專利名稱：Hig2和urlc表位肽及包含它們的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
優(yōu)先權(quán) 本申請要求2008年8月19日提交的美國臨時(shí)申請No. 61/089，972的權(quán)益，通過述及將其全部內(nèi)容收入本文。
技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明涉及生物科學(xué)領(lǐng)域，更具體的說是癌癥治療領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及作為癌癥疫苗極其有效的新肽，及用于治療和預(yù)防腫瘤的藥物。
背景技術(shù)：
已經(jīng)證明，⑶8陽性CTL可識別主要組織相容性復(fù)合物(MHC) I類分子上出現(xiàn)的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)衍生的表位肽，然后殺死腫瘤細(xì)胞。從TAA的第一個(gè)例子一一黑素瘤抗原(MAG^家族被發(fā)現(xiàn)起，人們主要通過免疫學(xué)手段(NPL 1 =Boon TJnt J Cancer 1993May 8,54(2) :177-80 ；NPL 2 =Boon T&van der Bruggen P, J Exp Med 1996Mar 1,183(3) 725-9)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多其它TAA。人們正在將這些TAA中的一些作為免疫治療的靶標(biāo)進(jìn)行臨床開發(fā)。
能夠誘導(dǎo)強(qiáng)力且特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答的新TAA的鑒定保證了針對各種類型癌癥的肽疫苗接種策略的進(jìn)一步開發(fā)和臨床應(yīng)用(NPL 3 =Harris CC, J Natl Cancer Inst 19960ct 16,88(20) :1442-55 ；NPL 4 =Butterfield LH et al. , Cancer Res 1999Jul 1， 59(13) :3134-42 ；NPL 5 =Vissers JL et al. , Cancer Resl999Nov 1,59(21) :5554-9 ；NPL 6 :van der Burg SH et al. , J Immunol 1996May 1,156(9) :3308-14 ；NPL 7 :Tanaka F et al.，Cancer Res 19970ct 15,57(20) :4465-8 ；NPL 8 =Fujie T et al.，Int J Cancer 1999Jan 18,80(2) :169-72；NPL 9 =Kikuchi M et al.，Int J Cancer 1999May 5,81(3) 459-66 ；NPL 10 =Oiso M et al. ,Int J Cancer 1999May 5,81(3) :387-94)。迄今為止，已經(jīng)有數(shù)項(xiàng)使用這些腫瘤相關(guān)抗原衍生的肽進(jìn)行臨床試驗(yàn)的報(bào)告。不幸的是，迄今為止在這些癌癥疫苗試驗(yàn)中只觀察到較低的客觀應(yīng)答率(NPL 11 =Belli F et al.，J Clin Oncol 20020ct 15,20(20) :4169-80 ；NPL 12 =Coulie PG et al.，Immunol Rev 20020ct,188 33-42 ；NPL 13 =Rosenberg SA et al. , Nat Med 2004Sep,10(9) :909-15)。
世界上有數(shù)種類型的HLA-A。在已知的HLA基因型中，已知HLA-A0201、HLA_A0206、 HLA-Al 101、HLA-A2402、HLA-A2601、HLA-A3101 及 HLA-A3303 等基因型具有比其他類型更高的表達(dá)頻率(NPL 14 =Lee K W, etal. , Tissue Antigens 2005:65:437-447)。然而， 各種基因型具有不同的氨基酸序列以及對表位肽的不同的親和力(NPL 15 Journal of ImmunologicalMethods, (1995)，Vol. 185，pp. 181-190)。例如，HLA-A0206 基因型的 α-1 域的氨基酸殘基與HLA-A0201基因型的不同(即SEQ ID NO :8的第33個(gè)氨基酸——酪氨酸殘基被換成了苯丙氨酸)?？紤]到這些不同，HLA-A0201限制性的表位肽對于擁有HLA-A0206 基因型的患者而言不大可能有用。因此，對不同類型的患者有用的肽仍然是本領(lǐng)域的目標(biāo)。
已通過微陣列分析確認(rèn)了 HIG2 (低氧誘導(dǎo)型基因2)和URLClO (又稱LY6K ；淋巴細(xì)胞抗原6復(fù)合物，座位K)在數(shù)種癌癥組織如腎癌和肺癌中上調(diào)(PTL 1 :W02005/019475,PTL 2 :W02004/031413)。因此，HIG2和URLClO是癌癥免疫治療的令人感興趣的靶標(biāo)，從它們衍生的表位肽是本領(lǐng)域技術(shù)人員追求的對象。
引用列表 非專利文獻(xiàn) [NPL1]Boon Τ,Int J Cancer 1993May 8,54(2) :177-80 [NPL2]Boon T&van der Bruggen P, J Exp Med 1996Mar 1,183(3) :725-9 [NPL3]Harris CC,J Natl Cancer Inst 19960ct 16,88(20) :1442-55 [NPL4]Butterfield LH et al. , Cancer Res 1999Jul 1,59(13) :3134-42 [NPL5]Vissers JL et al. , Cancer Res 1999Nov 1,59(21) :5554-9 [NPL6]van der Burg SH et al. ，J Immunol 1996May 1,156(9) :3308-14 [NPL7]Tanaka F et al. , Cancer Res 19970ct 15,57(20) :4465-8 [NPL8]Fujie T et al. ， Int J Cancer 1999Jan 18,80(2) :169-72 [NPL9]Kikuchi M et al. ， Int J Cancer 1999May 5,81(3) :459-66 [NPL10]:0iso M et al. ， Int J Cancer 1999May 5,81(3) :387-94 [NPL11]=Belli F et al. , J Clin Oncol 20020ct 15,20(20) :4169-80 [NPL12]= Coulie PG et al.，Immunol Rev 20020ct, 188 :33-42 [NPL13]=Rosenberg SA et al. ，Nat Med 2004Sep,10(9) :909-15 [NPL14]:Lee K W, et al. ，Tissue Antigens 200565 :437-447 [NPL15]Journal of Immunological Methods, (1995), Vol. 185,pp.181-190 專利文獻(xiàn) [PTL 1]W02005/019475 [PTL 2]W02004/031413 發(fā)明概述 本發(fā)明部分基于具有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的兩種肽的新應(yīng)用的發(fā)現(xiàn)。在本發(fā)明的語境下，使用自HIG2或URLC10衍生的候選肽刺激從健康供體獲得的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。建立了可特異性識別經(jīng)相應(yīng)候選肽沖激的HLA-A0206 陽性靶細(xì)胞的CTL，而且鑒定了能誘導(dǎo)針對呈遞在靶細(xì)胞表面上的HIG2或URLClO的強(qiáng)而特異性的免疫應(yīng)答的HLA-A0206限制表位肽。
因而，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供具有CTL誘導(dǎo)能力、且具有氨基酸序列SEQ ID NO 1或2的肽。此外，本發(fā)明涵蓋修飾的肽的用途，其中替代、刪除、插入和/或添加了一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸，只要所得的修飾的肽保留CTL誘導(dǎo)能力。
當(dāng)對其HLA抗原是HLA-A0206的受試者施用時(shí)，本發(fā)明的肽呈遞在抗原呈遞細(xì)胞的表面上，然后誘導(dǎo)靶向相應(yīng)肽的CTL。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供與HLA-A0206抗原一起呈遞任何本發(fā)明肽的抗原呈遞細(xì)胞和外來體，以及用于誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的方法。
施用本發(fā)明的HIG2或URLClO多肽或編碼該多肽的多核苷酸、以及呈遞HIG2或 URLClO多肽的外來體和抗原呈遞細(xì)胞誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供含有所述多肽或編碼它們的多核苷酸，以及外來體和抗原呈遞細(xì)胞作為其活性成分的、意圖施用于其HLA抗原是HLA-A0206的受試者的藥物制劑。本發(fā)明的藥物制劑可用作疫苗。
此外，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供治療和/或預(yù)防(即防范)癌癥(腫瘤)，和/ 或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)的方法，以及用于誘導(dǎo)CTL的方法、用于誘導(dǎo)針對癌癥(腫瘤)的免疫應(yīng)答及抗腫瘤免疫的方法，其中受試者具有HLA-A0206抗原，此類方法包括施用SEQ ID NO 1或SEQ ID NO :2的肽、呈遞SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2的外來體或抗原呈遞細(xì)胞，或本發(fā)明的藥物制劑的步驟。另外，本發(fā)明的CTL還可用作針對癌癥的疫苗。目標(biāo)癌癥的例子包括但不限于腎癌、膀胱癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、食道癌、胃癌、NSCLC、骨肉瘤、胰腺癌和軟組織腫瘤。
要理解，上面的發(fā)明概述和下面的詳細(xì)描述都是例示性的實(shí)施方案，而非限制本發(fā)明或本發(fā)明的其它備選實(shí)施方案。
附圖簡述 在考慮本發(fā)明的附圖簡述和后面的詳細(xì)描述及優(yōu)選實(shí)施方案后，本發(fā)明的各方面和應(yīng)用對于熟練技術(shù)人員會變得顯而易見。


圖1包括一系列照片，描繪用HIG2衍生肽誘導(dǎo)的CTL的IFN- y ELISPOT測定的結(jié)果。用 HIG2-A0206-9-4(SEQ ID NO 1)刺激的 1、2、5、7、8、10、13 和 14 號孔中的 CTL 均顯示與對照相比強(qiáng)的IFN-Y生成。在圖中，“+"指示利用靶細(xì)胞用適宜的肽沖激過， 而"指示靶細(xì)胞沒有用任何肽沖激。
圖2描繪了一系列線圖，呈現(xiàn)用IFN-Y ELISA測定法得到的用 HIG2-A0206-9-4(SEQ ID NO :1)刺激的 CTL 系的建立結(jié)果。表明用 HIG2-A0206-9-4(SEQ ID NO :1)刺激而建立的CTL系顯示了與對照相比強(qiáng)的IFN-γ生成。在圖中，“+〃指示靶細(xì)胞用適宜的肽沖激過，而"指示靶細(xì)胞沒有用任何肽沖激過。
圖3描繪了一幅線圖，呈現(xiàn)用IFN-γ ELISA測定法得到的用HIG2-A0206-9-4 (SEQ ID NO 1)刺激的CTL克隆的建立結(jié)果。結(jié)果表明用HIG2-A0206-9-4(SEQ ID NO 1)刺激而建立的CTL系顯示了與對照相比強(qiáng)的IFN-Y生成。在圖中，"+〃指示靶細(xì)胞用適宜的肽沖激過，而"指示靶細(xì)胞沒有用任何肽沖激過。
圖4描繪了一幅線圖，顯示針對表達(dá)HIG2與HLA_A*0206的靶細(xì)胞的特異性CTL 活性。制備用HLA-A*0206單獨(dú)轉(zhuǎn)染并用衍生自HIG2的非適宜肽沖激的C0S7細(xì)胞，或者用 HIG2單獨(dú)轉(zhuǎn)染的C0S7細(xì)胞作為對照。用HIG2-A0206-9-4(SEQ ID NO 1)建立的CTL克隆針對用HIG2與HLA-A*0206 二者轉(zhuǎn)染的C0S7細(xì)胞顯示了高的特異性CTL活性(黑色菱形標(biāo)記)。另一方面，沒有檢測到針對表達(dá)HLA-A0206的靶細(xì)胞(空心三角形標(biāo)記)或表達(dá) HIG2的靶細(xì)胞(空心圓)的顯著的特異性CTL活性。
圖5包括一系列照片，描繪用URLClO衍生肽誘導(dǎo)的CTL的IFN- y ELISP0T測定的結(jié)果。用URLC10-A0206-10-211(SEQ ID NO 2)刺激的7號孔中的CTL分別顯示與對照相比強(qiáng)的IFN-Y生成。在圖中，“+"指示靶細(xì)胞用適宜的肽沖激過，而"指示靶細(xì)胞沒有用任何肽沖激。
圖6描繪了一系列線圖，呈現(xiàn)用IFN-YELISA測定法得到的用 URLC10-A0206-10-211(SEQ ID NO 2)刺激的CTL系的建立結(jié)果。結(jié)果表明用 URLC10-A0206-10-211(SEQ ID NO 2)刺激而建立的CTL系顯示了與對照相比強(qiáng)的IFN-γ 生成。在圖中，“+"指示靶細(xì)胞用適宜的肽沖激過，而"指示靶細(xì)胞沒有用任何肽沖激過。
圖7描繪了一幅線圖，呈現(xiàn)用IFN-γ ELISA測定法得到的用 URLC10-A0206-10-211(SEQ ID NO 2)刺激的CTL克隆的建立結(jié)果。結(jié)果表明 URLC10-A0206-10-211(SEQ ID NO 2)刺激而建立的CTL系顯示了與對照相比強(qiáng)的IFN-γ 生成。在圖中，“+"指示靶細(xì)胞用適宜的肽沖激過，而"指示靶細(xì)胞沒有用任何肽沖激過。
圖8描繪了一幅線圖，顯示針對表達(dá)URLClO與HLA_A*0206的靶細(xì)胞的特異性CTL 活性。制備用全長URLClO基因單獨(dú)轉(zhuǎn)染或者用HLA-A*0206基因單獨(dú)轉(zhuǎn)染的C0S7細(xì)胞作為對照。用 URLC10-A0206-10-211 (SEQ ID NO 2)建立的 CTL 克隆針對用 HIG2 與 HLA_A*0206 二者轉(zhuǎn)染的C0S7細(xì)胞顯示了高的特異性CTL活性(黑色菱形標(biāo)記)。另一方面，沒有檢測到針對表達(dá)HLA-A0206的靶細(xì)胞(空心三角形標(biāo)記)或表達(dá)URLClO的靶細(xì)胞(空心圓) 的顯著的特異性CTL活性，在圖中，“R”表示應(yīng)答細(xì)胞，“S”表示刺激細(xì)胞。
實(shí)施方案的描述 現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法、裝置、和材料，不過在實(shí)施或檢驗(yàn)本發(fā)明的實(shí)施方案時(shí)可使用與本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料。然而，在描述本發(fā)明材料和方法之前，要理解本發(fā)明不限于特定大小、性狀、尺度、材料、方法、方案等，因?yàn)樗鼈兛梢勒绽袑?shí)驗(yàn)和優(yōu)化而變化。還要理解，所述描述中使用的術(shù)語只是出于描述特定樣式或?qū)嵤┓桨傅哪康?，而非意圖限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍只會由所附權(quán)利要求來限制。
通過述及明確將本說明書中提到的每一篇出版物、專利或?qū)＠暾埖墓_文本完整收入本文。然而，本文中無一處可解釋為承認(rèn)本發(fā)明沒有資格憑借發(fā)明在先而早于此類公開文本。
如果有沖突，以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)例僅為舉例說明而不構(gòu)成限制。
I.定義 如本文中使用的，詞語“一個(gè)/種”、“該”、和“所述”意味著“至少一個(gè)/種”，除非另有明確說明。
術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是經(jīng)過修飾的殘基或非天然存在型殘基(諸如相應(yīng)的天然存在型氨基酸的人工化學(xué)模擬物)的氨基酸聚合物，以及天然存在型氨基酸聚合物。
如本文中使用的，術(shù)語“氨基酸”指天然存在型和合成型氨基酸，以及與天然存在型氨基酸發(fā)揮相似功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在型氨基酸指由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及在細(xì)胞中在翻譯后被修飾的氨基酸(例如羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、 和0-磷酸絲氨酸)。短語“氨基酸類似物”指與天然存在型氨基酸具有相同的基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)(α碳與氫、羧基、氨基、和R基團(tuán)結(jié)合)但具有經(jīng)過修飾的R基團(tuán)或經(jīng)過修飾的主鏈的化合物(例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍)。短語“氨基酸模擬物” 指與具有與一般氨基酸不同的結(jié)構(gòu)但發(fā)揮與一般氨基酸相似的功能的化學(xué)化合物。
氨基酸在本文中可以通過它們公知的三字母符號或IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會推薦的單字母符號來指稱。
術(shù)語“基因”、“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”在本文中除非另有明確說明可互換使用，而且與氨基酸類似地通過它們普遍接受的單字母代碼來指稱。
除非另有定義，術(shù)語“癌癥”指過表達(dá)HIG2或URLClO基因的癌癥，過表達(dá)HIG2基因的癌癥的實(shí)例包括但不限于腎癌和軟組織腫瘤；過表達(dá)URLClO基因的癌癥包括但不限于膀胱癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、食道癌、胃癌、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、骨肉瘤、胰腺癌和軟組織腫瘤。
除非另有定義，術(shù)語“細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞”、“細(xì)胞毒性T細(xì)胞”和“CTL”在本文中可互換使用，而且除非另有明確說明，指能夠識別非自身細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞、病毒感染的細(xì)胞)并誘導(dǎo)此類細(xì)胞死亡的T淋巴細(xì)胞亞群。
除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員的普遍理解相同的含義。
II.肽 為了證明 HIG2-A0206-9-4(SEQ ID NO :1)和 URLC10-A0206-10-211 (SEQ ID NO: 2)的肽發(fā)揮被細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)所識別的抗原的功能，對這些肽進(jìn)行了分析以確定它們是否為HLA-A0206限制性的抗原表位。通過加載了這些肽的樹突細(xì)胞(DC)來體外刺激 T 細(xì)胞后，使用 HIG2-A0206-9-4(SEQ ID NO 1)和 URLC10-A0206-10-211 (SEQ ID NO: 2)的肽分別成功地建立了 CTL。
這些建立的CTL顯示針對經(jīng)相應(yīng)肽沖激的、表達(dá)HLA-A0206抗原的靶細(xì)胞的強(qiáng)且特異性的CTL活性。本文中的這些結(jié)果證明這些肽可能是受HLA-A0206限制的HIG2 或URLClO表位肽。由于這些肽也可能是受HLA-A0201限制的HIG2或URLClO表位肽 (W02008/102557, PCT/JP2008/00(^90，通過提述并入本文)，因此，包含這些肽的藥物制劑或組合物可能適用于HLA-A0201陽性受試者和HLA-A0206陽性受試者。
由于HIG2或URLClO基因在大多數(shù)癌癥組織中過表達(dá)，例如膀胱癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、食道癌、胃癌、NSCLC、骨肉瘤、胰腺癌、腎癌和軟組織腫瘤，它是良好的免疫治療靶標(biāo)。具體地說，過表達(dá)HIG2的癌癥的例子包括腎癌和軟組織腫瘤。同時(shí)，過表達(dá)URLClO的癌癥的例子包括膀胱癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、食道癌、胃癌、NSCLC、骨肉瘤、胰腺癌和軟組織腫瘤。因此，本發(fā)明提供與HIG2或URLClO的HLA-A0206限制性表位肽對應(yīng)的九肽(由九個(gè)氨基酸殘基組成的肽)和十肽(由十個(gè)氨基酸殘基組成的肽)。本發(fā)明的九肽和十肽的特別優(yōu)選例子包括那些具有選自SEQ ID NO :1和2的氨基酸序列的肽。更具體地說， HLA-A0206限制的HIG2表位肽的例子包括包含氨基酸序列SEQ ID NO 1的肽，而HLA-A0206 限制的URLClO表位肽的例子包括包含氨基酸序列SEQ ID NO 2的肽。
—般而言，蛋白質(zhì)中一個(gè)、兩個(gè)、或更多個(gè)氨基酸的修飾不會影響蛋白質(zhì)的功能， 而且在有些情況下甚至?xí)鰪?qiáng)原始蛋白質(zhì)的期望功能。事實(shí)上，已知有經(jīng)過修飾的肽(即由與原始參照序列相比其中修飾(即替代、刪除、添加或插入)一個(gè)、兩個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列構(gòu)成的肽)保留原始肽的生物學(xué)活性(Mark et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1984,81 :5662-6 ；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982，10 :6487-500 ; Dalbadie-McFarland etal. , Proc Natl Acad Sci USA 1982,79:6409-13)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽可既具有CTL誘導(dǎo)能力，又具有選自SEQ ID NO :1或2的氨基酸序列中插入、刪除、添加和/或替代一個(gè)、兩個(gè)或甚至更多個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列。
本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)可，改變氨基酸序列中的單個(gè)氨基酸或少數(shù)百分比氨基酸的個(gè)別添加或替換往往會導(dǎo)致原始氨基酸側(cè)鏈的特性得以保留。因此，它們常規(guī)上稱作“保守替代”或“保守修飾”，其中對蛋白質(zhì)的改變導(dǎo)致具有與原始蛋白質(zhì)類似的性質(zhì)和功能的修飾蛋白質(zhì)。提供功能上相似的氨基酸的保守替代表是本領(lǐng)域公知的。期望保留的氨基酸側(cè)鏈特征的例子包括例如疏水性氨基酸(A，I，L，M，F(xiàn)，P，W，Y，V)、親水性氨基酸(R，D，N, C，E， Q，G，H，K，S, T)、和具有下面的共同官能團(tuán)或特征的側(cè)鏈脂肪族側(cè)鏈(G，A，V，L，I，P)；含羥基側(cè)鏈(S，T，Y)；含硫原子側(cè)鏈(C，M)；含羧酸和酰胺側(cè)鏈(D，N, E，Q)；含堿側(cè)鏈(R，K， H)；和含芳香族側(cè)鏈(H，F(xiàn)，Y，W)。另外，下面的八組各自含有本領(lǐng)域公認(rèn)互為保守替代的氨基酸 1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)； 2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)； 3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)； 4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)； 5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸⑴，色氨酸(W)； 7)絲氨酸⑶，蘇氨酸⑴；和 8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(參見例如 Creighton, Proteins 1984)。
此類保守修飾肽也被視為本發(fā)明的肽。然而，本發(fā)明的肽不限于此，可包括非保守修飾，只要該肽保留原始肽的CTL誘導(dǎo)能力。另外，經(jīng)過修飾的肽不應(yīng)排除HIG2或URLClO 的多態(tài)變體、種間同源物、和等位基因中的可誘導(dǎo)CTL的肽。
當(dāng)在免疫療法的語境中使用時(shí)，本發(fā)明的肽應(yīng)呈遞在細(xì)胞或外來體的表面上，優(yōu)選作為與HLA-A0206抗原的復(fù)合物。因此，優(yōu)選選擇不僅誘導(dǎo)CTL而且擁有對HLA-A0206 抗原的高結(jié)合親和力的肽。為此，可通過替代、插入、刪除和/或添加氨基酸殘基來對肽進(jìn)行修飾，產(chǎn)生具有改良的結(jié)合親和力的修飾肽。除了天然被展示的肽之外，由于已經(jīng)知道通過結(jié)合HLA抗原而被展示的肽的序列規(guī)律(J Immunol 1994,152:3913; Immunogenetics 1995,41 :178 JImmunol 1994，155 :4307)，可將基于此類規(guī)律的修飾引入本發(fā)明的免疫原性肽。不僅可以在肽的末端氨基酸處引入替代，而且可以在潛在TCR識別位置處引入替代。數(shù)項(xiàng)研究證明了肽中的氨基酸替代可等同于或好于原來，例如CAP1、 p53(254-272) ^ Her-2/neu(369-377)或 gplOO(209_217) (Zaremba et al. Cancer Res. 57,4570-4577, 1997, Τ. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Febl ； 168 (3) :1338-47., S. 0. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003)52:199-206 及 S. 0. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy(2004)53，307-314)。
本發(fā)明還考慮，還可向本發(fā)明的肽的N和/或C端添加一個(gè)至兩個(gè)氨基酸。本發(fā)明也包括此類具有高HLA抗原結(jié)合親和力且保留CTL誘導(dǎo)能力的經(jīng)過修飾的肽。
然而，當(dāng)肽序列與具有不同功能的內(nèi)源或外源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一部分相同時(shí)，可能誘導(dǎo)副作用，諸如自身免疫性病癥和/或針對特定物質(zhì)的變應(yīng)性癥狀。因此，優(yōu)選的是，首先利用可得的數(shù)據(jù)庫實(shí)施同源性搜索，以避免肽的序列與另一種蛋白質(zhì)的氨基酸序列匹配的情況。當(dāng)根據(jù)同源性搜索清楚了即使與目標(biāo)肽相比差1個(gè)或2個(gè)氨基酸的肽亦不存在時(shí)，可以修飾目標(biāo)肽以提高其與HLA抗原的結(jié)合親和力，和/或提高其CTL誘導(dǎo)能力，而沒有此類副作用的任何危險(xiǎn)。
雖然預(yù)期如上所述經(jīng)修飾的肽是高度有效的，但還是對候選肽檢查了 CTL誘導(dǎo)能力的存在以選擇有效性更高的肽。在本文中，短語“CTL誘導(dǎo)能力，，指肽在抗原呈遞細(xì)胞上呈遞時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)的能力。另外，“CTL誘導(dǎo)能力”包括肽誘導(dǎo)CTL活化、 CTL增殖、促進(jìn)CTL溶解靶細(xì)胞、和提高CTL IFN- γ生成的能力。
CTL誘導(dǎo)能力的確認(rèn)如下來實(shí)現(xiàn)，用肽進(jìn)行刺激來誘導(dǎo)攜帶人MHC抗原的抗原呈遞細(xì)胞(例如B-淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、和樹突細(xì)胞(DC))，或者更具體地說，衍生自人外周血單核白細(xì)胞的DC，并且在用肽誘導(dǎo)后，與CD8陽性細(xì)胞混合，然后測量由CTL針對靶細(xì)胞生成和釋放的IFN-γ。作為反應(yīng)系統(tǒng)，可使用已經(jīng)制成的表達(dá)人HLAA0206抗原的轉(zhuǎn)基因動物 (例如 BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immuno 12000Aug, 61 (8) :764-79)。例如，可以用51Cr等放射性標(biāo)記靶細(xì)胞，并且可以自HLA 抗原為HLA-A0206的靶細(xì)胞釋放的放射性計(jì)算細(xì)胞毒性活性?；蛘撸珻TL誘導(dǎo)能力可以如下評估測量在攜帶固定化肽的抗原呈遞細(xì)胞(APC)存在下由CTL生成和釋放的IFN-γ， 并使用抗IFN-γ單克隆抗體顯現(xiàn)培養(yǎng)基上的抑制區(qū)。
除上文所述修飾之外，還可將本發(fā)明的肽連接至其它物質(zhì)，只要所得的連接肽保留原始肽的必需的CTL誘導(dǎo)能力。合適物質(zhì)的例子包括但不限于肽、脂質(zhì)、糖和糖鏈、乙?；?、天然的和合成的聚合物、等。肽可含有修飾，諸如糖基化、側(cè)鏈氧化、或磷酸化等，前提是該修飾不破壞原始肽的生物學(xué)活性?？蓪?shí)施這些種類的修飾以賦予額外的功能(例如靶向功能和投遞功能)或穩(wěn)定多肽。
例如，為了提高多肽的體內(nèi)穩(wěn)定性，本領(lǐng)域已知引入D-氨基酸、氨基酸模擬物或非天然氨基酸；此構(gòu)思也可適用于本發(fā)明多肽。可以以多種方式測定多肽的穩(wěn)定性。例如， 可使用肽酶和各種生物學(xué)介質(zhì)(諸如人血漿和血清)來測試穩(wěn)定性(參見例如Verhoef et al. , Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986,11 :291-302) 此外，本發(fā)明的肽可以藉由接頭(linker)或間隔物(spacers)與其他的肽相連。所述其他的肽的例子包括但不限于從其他TAA衍生的能誘導(dǎo)CTL的肽。或者，兩個(gè)或更多個(gè)本發(fā)明的肽可以藉由接頭或間隔物連接起來。這些由接頭或間隔物連接起來的肽可以是彼此相同或不同的。接頭或間隔物沒有特殊限制，但優(yōu)選的是肽，更優(yōu)選的是具有一個(gè)或多個(gè)能夠被酶(如肽酶、蛋白酶和蛋白酶體等)切割的切割位點(diǎn)的肽。接頭或間隔物的例子包括但不限于AAY(P.M. Daftarian et al.，J Trans Med 2007,5 26), AAA, NKRK (R. P. Μ. Sutmuller et al.，J Immunol. 2000，165 :7308-7315)或一個(gè)到數(shù)個(gè)賴氨酸殘基(S. Ota et al. , Can Res. 62,1471-1476, K.S.Kawamura et al. , J Immunol. 2002,168 5709-5715)。本發(fā)明的肽涵蓋那些肽藉由間隔物或接頭與其他的肽相連而成的肽。
本發(fā)明的肽可以作為與MHC分子結(jié)合而成的復(fù)合物存在于攜帶人MHC抗原的細(xì)胞 (例如抗原呈遞細(xì)胞)或外來體的表面上。然后誘導(dǎo)CTL。所述的細(xì)胞和外來體可以依照本領(lǐng)域公知的技術(shù)來制備，例如，所述細(xì)胞可以通過與本發(fā)明的肽接觸來制備，而外來體可以通過從與本發(fā)明的肽接觸過的細(xì)胞收集含有外來體的級分來制備(參見例如日本專利申請?zhí)乇砥?1-510507和W099/03499)。本發(fā)明的肽涵蓋那些作為與MHC分子結(jié)合而成的復(fù)合體存在于細(xì)胞或外來體表面的肽。
本文中，本發(fā)明的肽也可以稱為“HIG2或URLClO肽”或“HIG2或URLClO多肽”。
III.肽的制備 本發(fā)明的肽可使用公知技術(shù)來制備。例如，肽可以通過合成、使用重組DNA技術(shù)或化學(xué)合成來制備。可個(gè)別地合成本發(fā)明的肽，或作為由兩個(gè)或更多個(gè)肽構(gòu)成的較長多肽來合成本發(fā)明的肽。然后可以分離，即純化所述肽，使其基本上不含其它天然存在的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)及其片段或任何其它化學(xué)物質(zhì)。
可以根據(jù)選定的氨基酸序列，借助化學(xué)合成來獲得本發(fā)明的肽?？蛇m用于合成的常規(guī)肽合成法的例子包括但不限于 ⑴Peptide Synthesis, Interscience, New York,1966 ； (ii)The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York,1976 ； (iii)Peptide Synthesis ( Hi), Maruzen Co. , 1975 ； (iv)Basics and Experiment of Peptide Synthesis ( H JC ) Maruzen Co., 1985 ； (ν) Development of Pharmaceuticals (second volume) (in Japanese), Vol.14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991 ； (vi)W099/67288 ；和 (vii) Barany G. &Merrifield R. B. , Peptides Vol. 2, “ Solid Phase PeptideSynthesis" , Academic Press, New York，1980，100—118。
或者，可借助任何已知的遺傳工程肽生產(chǎn)方法來獲得本發(fā)明的肽(例如 Morrison J, J Bacteriology 1977,132 :349-51 ；Clark-Curtiss&Curtiss, Methodsin Enzymology (eds. Wu et al. )1983,101 :347-62)。例如，首先，制備包含處于可表達(dá)形式(例如處于相當(dāng)于啟動子序列的調(diào)節(jié)序列下游)的編碼目標(biāo)肽的多核苷酸的合適載體，并轉(zhuǎn)移入合適宿主細(xì)胞。然后培養(yǎng)宿主細(xì)胞以生成感興趣的肽。也可以采用體外翻譯系統(tǒng)在體外生產(chǎn)肽。
IV.多核苷酸 本發(fā)明還提供編碼上述本發(fā)明肽的多核苷酸。這些包括由天然存在型HIG2或 URLC10 基因(SEQ ID NO 3 或 5，GenBank 登錄號 NM_013332 或 NM_017527)衍生的多核苷酸以及具有它們的經(jīng)過保守修飾的核苷酸序列的多核苷酸。在本文中，短語“經(jīng)過保守修飾的核苷酸序列”指編碼相同或本質(zhì)上相同的氨基酸序列的序列。由于遺傳密碼的簡并性，對于任何給定蛋白質(zhì)都有極其多種功能上相同的核酸來編碼它。例如，密碼子GCA、GCC、GCG、 和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在由密碼子規(guī)定為丙氨酸的任何位置處，該密碼子可改變成任何相應(yīng)所述密碼子，而不改變所編碼的多肽。這樣的核酸變異是“沉默變異”，是保守修飾變異的一種。本文中編碼肽的每一種核酸序列也涵蓋該核酸的每一種可能的沉默變異。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會認(rèn)識到，可以修飾核酸中的每一個(gè)密碼子(AUG和TGG除外，AUG 在正常情況下是甲硫氨酸的唯一密碼子，而TGG在正常情況下是色氨酸的唯一密碼子)以產(chǎn)生功能上相同的分子。因而，每一種所公開的序列隱含涵蓋了編碼肽的核酸的每一種沉默變異。
本發(fā)明的多核苷酸可以由DNA、RNA、及其衍生物構(gòu)成。DNA由堿基諸如A、T、C、和 G合適地構(gòu)成，而T在RNA中被U替換。
本發(fā)明的多核苷酸可編碼多個(gè)本發(fā)明肽，其中它們之間有或無居間氨基酸序列存在。例如，居間氨基酸序列可提供多核苷酸的或所翻譯的肽的切割位點(diǎn)(例如酶識別序列)。另外，多核苷酸除編碼本發(fā)明肽的編碼序列以外還可包括任何額外的序列。例如，多核苷酸可以是包括表達(dá)肽所需要的調(diào)節(jié)序列的重組多核苷酸，或者可以是具有標(biāo)志基因等等的表達(dá)載體(質(zhì)粒)。一般而言，此類重組多核苷酸可通過常規(guī)重組技術(shù)操作多核苷酸來制備，例如通過使用聚合酶和內(nèi)切核酸酶。
重組和化學(xué)合成技術(shù)都可用來生成本發(fā)明的多核苷酸。例如，可以通過插入在轉(zhuǎn)染入感受態(tài)細(xì)胞后能表達(dá)的適宜載體來生成多核苷酸?；蛘?，可借助PCR技術(shù)或通過在合適宿主中的表達(dá)來擴(kuò)增多核苷酸(參見例如Sambrooket al.，Molecular Cloning =A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York, 1989)。或者，可使用固相技術(shù)來合成多核苷酸，如Beaucage SL&Iyer RP,Tetrahedron 1992,48 :2223-311 ；Matthes et al.，EMBO J 1984,3 :801-5 中記載的。
含有本發(fā)明的多核苷酸的載體以及攜帶所述載體的宿主細(xì)胞也包含在本發(fā)明之內(nèi)。
V.夕卜來體(exosomes) 本發(fā)明進(jìn)一步提供了稱作外來體的細(xì)胞內(nèi)囊泡，這些外來體在它們的表面上呈遞本發(fā)明肽與HLA抗原之間形成的復(fù)合體。外來體可以通過，例如在日本專利申請公表公報(bào)平11-510507和W099/03499中詳細(xì)描述的方法來制備，并可以用從治療和/或預(yù)防針對的患者獲得的APC制備。本發(fā)明的外來體可以作為疫苗以與本發(fā)明的肽相似的方式進(jìn)行接種。
在本發(fā)明的語境下，所述復(fù)合物中包含的HLA抗原的類型應(yīng)為HLA-A0206，并且接種所述外來體的受試者必須具有HLA-A0206抗原。通常，在臨床上，預(yù)先對需要治療的患者的HLA抗原類型進(jìn)行檢查，這樣就能夠合適地選擇預(yù)期將受益于用本發(fā)明的外來體治療的
^^ ο VI.抗原呈遞細(xì)胞(APC) 本發(fā)明還提供在其表面上呈遞在HLA-A0206抗原與本發(fā)明肽之間形成的復(fù)合物的分離的APC。通過接觸本發(fā)明的肽或?qū)胩幱诳杀磉_(dá)形式的編碼本發(fā)明肽的核苷酸而獲得的APC可衍生自要進(jìn)行治療和/或預(yù)防的患者，而且可作為疫苗以它們自身或與其它藥物(包括本發(fā)明的肽、外來體、或細(xì)胞毒性T細(xì)胞)組合來施用。
APC不限于特定種類的細(xì)胞，包括樹突細(xì)胞(DC)、Langerhans細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、和活化的T細(xì)胞，已知它們在它們的細(xì)胞表面上呈遞蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗原，從而被淋巴細(xì)胞識別。由于DC是APC中具有最強(qiáng)CTL誘導(dǎo)作用的代表性APC，本發(fā)明的APC優(yōu)選是DC。
例如，可通過自外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)DC，然后在體外、離體或在體內(nèi)用本發(fā)明的肽接觸(刺激)它們來獲得APC。當(dāng)對HLA-A抗原是HLA-A0206的受試者施用本發(fā)明的肽時(shí)， 在受試者的身體中誘導(dǎo)出呈遞本發(fā)明肽的APC。短語“誘導(dǎo)APC”包括用本發(fā)明的肽或編碼本發(fā)明肽的核苷酸接觸(刺激)細(xì)胞，以在細(xì)胞的表面上呈遞在HLA-A0206抗原與本發(fā)明肽之間形成的復(fù)合物?；蛘?，在將本發(fā)明的肽給予APC以容許APC呈遞該肽后，可以將這些 APC作為疫苗施用給受試者。例如，離體施用可包括下述步驟 a 自HLA-A抗原是HLA-A0206的第一受試者收集APC ； b 用肽接觸步驟a的APC ；并 C 對HLA-A抗原是HLA-A0206的第二受試者施用加載了所述肽的APC。
第一受試者和第二受試者可以是同一個(gè)體，或者可以是不同個(gè)體。或者，依照本發(fā)明，提供本發(fā)明的肽在制備用于誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的藥物組合物中的用途。另外，本發(fā)明提供一種制備用于誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的藥物組合物的方法或工藝，其中所述方法包括將本發(fā)明的肽與藥學(xué)可接受的載體混合或配制的步驟。另外，本發(fā)明還提供用于誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的本發(fā)明肽。通過步驟b獲得的APC可作為疫苗施用于受試者。依照本發(fā)明的一個(gè)方面，APC具有高水平的CTL誘導(dǎo)能力。在術(shù)語“高水平的CTL 誘導(dǎo)能力”中，高水平是相對于未與肽接觸或與不能誘導(dǎo)CTL的肽接觸的APC的該水平而言的。這樣的具有高水平CTL誘導(dǎo)能力的APC可通過下述方法來制備，該方法包括在體外將含有編碼本發(fā)明肽的多核苷酸的基因轉(zhuǎn)移至APC的步驟。所導(dǎo)入的基因可以是DNA或 RNA的形式。用于進(jìn)行導(dǎo)入的方法的例子包括但不具體限于本領(lǐng)域中常規(guī)實(shí)施的各種方法，諸如可使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔、和磷酸鈣法。更具體的說，可以如Cancer Res 1996， 56 5672-7 J Immunol 1998，161 :5607_13 ;J Exp Med 1996，184 :465_72 ；國際公開文本 No. 2000-509281的已
公開日文翻譯中所述來實(shí)施。通過將基因轉(zhuǎn)移入APC，基因在細(xì)胞中經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄、翻譯、等等，然后得到的蛋白質(zhì)被MHC I類或II類加工，并經(jīng)由呈遞途徑呈遞給本發(fā)明的肽。
VII.細(xì)胞毒件T細(xì)胞(CTL) 被誘導(dǎo)的針對任何本發(fā)明肽的細(xì)胞毒性T細(xì)胞可在體內(nèi)加強(qiáng)靶向腫瘤相關(guān)內(nèi)皮的免疫應(yīng)答，并且因此可以以與肽本身相似的方式用作疫苗。因此，本發(fā)明還提供由任何本發(fā)明肽特異性誘導(dǎo)或活化的、分離的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。
此類細(xì)胞毒性T細(xì)胞可通過下述步驟來獲得(1)對受試者施用本發(fā)明的肽然后從該受試者收集細(xì)胞毒性T細(xì)胞，或(2)在體外用本發(fā)明的肽接觸(刺激)受試者衍生的 APC和CD8陽性細(xì)胞、或外周血單核白細(xì)胞。
通過刺激從呈遞本發(fā)明肽的APC誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞可衍生自要進(jìn)行治療和/ 或預(yù)防且具有HLA-A0206抗原的患者，而且可以單獨(dú)施用，或者與其它藥物(包括本發(fā)明的肽或外來體)組合施用以調(diào)節(jié)效果。所得到的細(xì)胞毒性T細(xì)胞特異性針對呈遞本發(fā)明的肽或例如與用于誘導(dǎo)的肽相同的肽的靶細(xì)胞起作用。換言之，細(xì)胞毒性T細(xì)胞可以通過T細(xì)胞受體來識別(即結(jié)合)靶細(xì)胞表面上的HLA-A0206與本發(fā)明肽之間形成的復(fù)合物，然后攻擊該靶細(xì)胞以誘導(dǎo)該靶細(xì)胞死亡。靶細(xì)胞可以是內(nèi)源表達(dá)HIG2或URLClO的細(xì)胞，或被 HIG2或URLClO基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；而且因肽的刺激而在細(xì)胞表面上呈遞本發(fā)明肽的細(xì)胞也可充當(dāng)活化CTL攻擊的靶標(biāo)。
VIII. T 細(xì)胞受體(TCR) 本發(fā)明還提供包含編碼能夠形成T細(xì)胞受體(TCR)的亞單位的多肽的核酸序列的多核苷酸，及使用該組合物的方法。所述TCR亞單位具有形成賦予T細(xì)胞針對呈遞HIG2 肽或URLClO肽與HLA-A0206抗原的腫瘤細(xì)胞的特異性的TCR的能力。通過使用本領(lǐng)域已知的方法，可鑒定出用本發(fā)明的肽誘導(dǎo)的CTL中表達(dá)的TCR的α和β鏈的核酸序列 (W02007/032255 及 Morgan et al.，JImmunol，171，3288 (2003))。衍生的 TCR 在體內(nèi)和在體外能以高親合力結(jié)合展示在靶細(xì)胞上的HIG2或URLClO肽，且任選可介導(dǎo)對呈遞HIG2肽或URLClO肽與HLA-A0206抗原的靶細(xì)胞的有效殺傷。
可將編碼TCR亞單位的核酸序列摻入合適載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。這些載體是本領(lǐng)域公知的。有用的是，可將核酸或含有它們的載體轉(zhuǎn)移入T細(xì)胞，例如來自HLA-A抗原為HLA-A0206患者的T細(xì)胞。有利的是，本發(fā)明提供一種即配即用型(off-the-shelf) 組合物，其容許快速修飾患者自己的T細(xì)胞(或其他哺乳動物的T細(xì)胞)以快速且容易地生成具有卓越的癌細(xì)胞殺傷特性的修飾型T細(xì)胞。
還有，本發(fā)明提供通過用具有這樣的核酸序列的多核苷酸轉(zhuǎn)導(dǎo)而制備的CTL，該核酸編碼在HLA-A0206背景下結(jié)合HIG2或URLClO肽與HLA-A0206抗原之間形成的復(fù)合物的 TCR亞單位多肽。經(jīng)過轉(zhuǎn)導(dǎo)的CTL能夠在體內(nèi)歸巢(homing)至癌細(xì)胞，而且能在體外通過公知培養(yǎng)方法來擴(kuò)增(例如 Kawakamiet al.，J Immunol.，142，3452-3461 (1989))。本發(fā)明的T細(xì)胞可用于形成在需要治療或防護(hù)的患者中治療或預(yù)防癌癥方面有用的免疫原性組合物(W02006/031221)。
IX.藥物制劑或藥物組合物 術(shù)語“預(yù)防”和“防范”在本文中可互換使用，指降低來自疾病的死亡率或發(fā)病率負(fù)擔(dān)的任何活動。預(yù)防和防范可發(fā)生于“一級、二級和三級預(yù)防水平”。一級預(yù)防和防范避免疾病的發(fā)生，而二級和三級預(yù)防和防范水平涵蓋旨在預(yù)防和防范疾病進(jìn)展和癥狀出現(xiàn)以及降低已建立的疾病的負(fù)面影響的活動，這通過恢復(fù)功能和減輕疾病相關(guān)并發(fā)癥來實(shí)現(xiàn)。或者，預(yù)防和防范可包括廣泛的預(yù)防療法，它們旨在減輕特定病癥的嚴(yán)重性，例如降低腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。
治療和/或預(yù)防癌癥或腫瘤，和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)包括任何下述步驟，諸如手術(shù)清除癌細(xì)胞、抑制癌性細(xì)胞生長、腫瘤衰退或消退、誘導(dǎo)癌癥減退和遏制癌癥發(fā)生、腫瘤消退、及降低或抑制轉(zhuǎn)移。癌癥的有效治療和/或預(yù)防降低患癌個(gè)體的死亡率并改善其預(yù)后，降低血液中腫瘤標(biāo)志物的水平，及減輕伴隨癌癥的可檢測癥狀。例如，癥狀的減輕或改善構(gòu)成有效治療和/或預(yù)防包括10 %、20 %、30 %或更多降低，或病情穩(wěn)定。
由于HIG2或URLClO表達(dá)在數(shù)種癌癥中與正常組織相比上調(diào)，本發(fā)明的肽或編碼所述肽的多核苷酸可用于治療和/或預(yù)防癌癥，和/或預(yù)防它們的手術(shù)后復(fù)發(fā)。因此，本發(fā)明提供用于治療和/或預(yù)防癌癥，和/或預(yù)防它們的手術(shù)后復(fù)發(fā)的藥物制劑或組合物，其包括一種或多種本發(fā)明肽或編碼所述肽的多核苷酸作為活性組分?；蛘?，可以在任何上述外來體或細(xì)胞諸如APC的表面上表達(dá)本發(fā)明的肽，以用作藥物制劑或組合物。另外，上述靶向任何本發(fā)明的肽的細(xì)胞毒性T細(xì)胞也可用作本發(fā)明藥物制劑或組合物的活性組分。在本發(fā)明的語境中，短語“靶向某個(gè)肽”是指通過T細(xì)胞受體識別(即結(jié)合)靶細(xì)胞上的HLA-A0206 抗原與肽之間形成的復(fù)合物，然后攻擊該靶細(xì)胞以誘導(dǎo)該靶細(xì)胞的死亡。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供選自下組的活性組分在制備用于治療癌癥的藥物組合物或藥物制劑中的用途 (a)本發(fā)明的肽， (b)處于可表達(dá)形式的編碼如本文中公開的肽的核酸， (C)本發(fā)明的 APCJP (d)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。
或者，本發(fā)明進(jìn)一步提供用于治療癌癥的選自下組的活性組分 (a)本發(fā)明的肽， (b)處于可表達(dá)形式的編碼如本文中公開的肽的核酸， (c)本發(fā)明的APC，和 (d)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。
或者，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種制備用于治療癌癥的藥物組合物或制劑的方法或工藝，其中該方法或工藝包括配制藥學(xué)或生理學(xué)可接受載體與選自下組的活性組分作為活性組分的步驟 (a)本發(fā)明的肽， (b)處于可表達(dá)形式的編碼如本文中公開的肽的核酸， (C)本發(fā)明的 APCJP (d)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供一種制備用于治療癌癥的藥物組合物或制劑的方法或工藝，其中該方法或工藝包括混合活性組分與藥學(xué)或生理學(xué)可接受載體的步驟， 其中所述活性組分選自下組 (a)本發(fā)明的肽， (b)處于可表達(dá)形式的編碼如本文中公開的肽的核酸， (C)本發(fā)明的 APCJP (d)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。
或者，本發(fā)明的藥物組合物或制劑可用于防范癌癥和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)。
本發(fā)明的藥物制劑或組合物可用作疫苗。在本發(fā)明的語境中，短語“疫苗”(也稱作“免疫原性組合物”)指具有在接種入動物后誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力的功能的物質(zhì)。
本發(fā)明的藥物制劑或組合物可用于在受試者或患者(包括人和任何其它哺乳動物，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、貓、犬、綿羊、山羊、豬、牛、馬、猴、狒狒、和黑猩猩， 特別是商業(yè)上重要的動物或馴養(yǎng)的動物)中治療和/或預(yù)防癌癥，和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)。
依照本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有選自SEQ ID NO 1和2的氨基酸序列的多肽是能誘導(dǎo)針對表達(dá)HIG2或URLClO以及HLA-A0206的靶細(xì)胞的強(qiáng)且特異性免疫應(yīng)答的HLA-A0206限制性表位肽。因此，包括任何這些具有選自SEQ IDNO :1和2的氨基酸序列的多肽的本發(fā)明藥物制劑或組合物特別適合于對其HLA抗原為HLA-A0206的受試者施用。這同樣適用于含有編碼任何這些多肽的多核苷酸的藥物制劑或組合物。
要用本發(fā)明的藥物制劑或組合物治療的癌癥不受限制，包括其中涉及HIG2或 URLClO的所有種類的癌癥，包括例如膀胱癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、食道癌、胃癌、NSCLC、骨肉瘤、胰腺癌、腎癌和軟組織腫瘤。特別是，靶向HIG2的藥物制劑或組合物優(yōu)選地可適用于腎癌和軟組織腫瘤，而靶向URLClO的藥物制劑或組合物優(yōu)選地可適用于膀胱癌、宮頸癌、 膽管細(xì)胞癌、食道癌、胃癌、NSCLC、骨肉瘤、胰腺癌和軟組織腫瘤。
除上述活性組分之外，本發(fā)明的藥物制劑或組合物還可含有其它具有誘導(dǎo)針對癌性細(xì)胞的CTL的能力的肽、編碼所述其它肽的其它多核苷酸、呈遞所述其它肽的其它細(xì)胞等等。在本文中，其它具有誘導(dǎo)針對癌性細(xì)胞的CTL的能力的肽以癌癥特異性抗原(例如已鑒定的TAA)為例，但是不限于此。
如果需要，本發(fā)明的藥物制劑或組合物可任選包括其它治療性物質(zhì)作為活性組分，只要該物質(zhì)不抑制活性組分例如任何本發(fā)明肽的抗腫瘤效果。例如，配制劑可包括抗炎劑或組合物、鎮(zhèn)痛劑、化療劑、諸如此類。除了在藥物自身中包括其它治療性物質(zhì)之外，本發(fā)明的藥物還可以與一種或多種其它藥理學(xué)作用劑或組合物順序或同時(shí)施用。藥物和藥理學(xué)作用劑或組合物的量取決于例如所使用的藥理學(xué)作用劑或組合物的類型、所治療的疾病、 及施用的時(shí)序安排和路徑。
應(yīng)當(dāng)理解，除在本文中具體提及的組分之外，本發(fā)明的藥物制劑或組合物可包括與所討論的配制劑類型相關(guān)的本領(lǐng)域常規(guī)的其它制劑或組合物。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物制劑或組合物可包括在制品和試劑盒中，該制品和試劑盒含有可用于治療要治療的疾病(例如癌癥)的病理狀況的材料。制品可包括任何本發(fā)明藥物制劑或組合物的容器及標(biāo)簽。合適的容器包括瓶、管形瓶、和試管。 容器可以用多種材料制成，諸如玻璃或塑料。容器上的標(biāo)簽應(yīng)指明該藥劑或組合物用于治療或預(yù)防一種或多種疾病狀況。標(biāo)簽還可指明關(guān)于施用的指導(dǎo)等等。
除上文描述的容器之外，包括本發(fā)明藥物制劑或組合物的試劑盒還可任選進(jìn)一步包括第二容器，其中裝有藥學(xué)可接受稀釋劑。它可進(jìn)一步包括從商業(yè)和用戶立場看期望的其它材料，包括其它緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭、注射器、和載有使用說明的包裝插頁。
如果期望的話，藥物組合物可存在于藥包或分配器裝置中，該藥包或分配器裝置可裝有一個(gè)或多個(gè)含有活性組分的單位劑型。例如，藥包可包括金屬或塑料箔，諸如泡罩包。藥包或分配器裝置可附有施用說明書。
(1)含有肽作為活性組分的藥物制劑或組合物 本發(fā)明的肽可以作為藥物制劑或組合物直接施用，或者如果必要，通過常規(guī)配制方法來配制。在后一種情況中，除本發(fā)明的肽之外，還可以視情況包括通常用于藥物的載體、賦形劑、等等，沒有特別限制。此類載體的例子有滅菌水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、培養(yǎng)基、等等。另外，藥物制劑或組合物可在必要時(shí)含有穩(wěn)定劑、懸浮液、防腐劑、表面活性劑等等。本發(fā)明的藥物制劑或組合物可用于抗癌目的。
本發(fā)明的肽可制備成由兩種或更多種本發(fā)明肽構(gòu)成的組合以在體內(nèi)誘導(dǎo)CTL。肽組合可采取雞尾酒的形式，或者可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)彼此綴合。例如，可以將各個(gè)肽化學(xué)連接或表達(dá)成為單一融合多肽序列。組合中的各個(gè)肽可以是相同的或不同的。通過施用本發(fā)明的肽，肽被HLA-A0206抗原以高密度展示在APC上，然后誘導(dǎo)出與所展示的肽與HLA-A0206抗原之間形成的復(fù)合物特異性起反應(yīng)的CTL?；蛘?，可以給其HLA抗原為HLA-A0206的受試者施用這樣的APC:它們在其細(xì)胞表面上展示任何本發(fā)明的肽，可以通過用本發(fā)明的肽刺激來源于受試者的APC (如DC)而獲得；結(jié)果在受試者中誘導(dǎo)CTL，從而可提高針對癌細(xì)胞，諸如膀胱癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、食道癌、胃癌、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、骨肉瘤、胰腺癌、腎癌和軟組織腫瘤的攻擊性。
包括本發(fā)明的肽作為活性組分、用于治療和/或預(yù)防癌癥的藥物制劑或組合物還可包括已知可有效建立細(xì)胞免疫的佐劑?；蛘?，它們可以與其它活性組分一起施用，而且它們可以通過配制成顆粒來施用。佐劑指在與具有免疫學(xué)活性的蛋白質(zhì)一起(或順序)施用時(shí)增強(qiáng)針對該蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答的化合物。本文中涵蓋的佐劑包括文獻(xiàn)中記載的那些 (Clin Microbiol Rev 1994，7 :277_89)。合適佐劑的例子包括但不限于磷酸鋁、氫氧化鋁、 明礬、霍亂毒素、沙門氏菌毒素、諸如此類，但不限于此。
另外，可方便地使用脂質(zhì)體配制劑、其中肽結(jié)合至幾微米直徑的珠子的顆粒配制齊U、和其中脂質(zhì)結(jié)合至肽的配制劑。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物制劑或組合物可進(jìn)一步包括引發(fā)(Prime)CTL 的成分。已經(jīng)確認(rèn)脂質(zhì)是能夠在體內(nèi)引發(fā)針對病毒抗原的CTL的作用劑或組合物。例如， 可將棕櫚酸殘基連接至賴氨酸殘基的和α-氨基，然后連接至本發(fā)明的肽。然后脂化肽可以在膠束或顆粒中直接施用，摻入脂質(zhì)體，或在佐劑中乳化。作為脂質(zhì)引發(fā)CTL應(yīng)答的另一個(gè)例子，大腸桿菌(E. coli)脂蛋白，諸如三棕櫚?；?S-甘油基半胱氨酰絲氨酰-絲氨酸(P3CSS)，當(dāng)與適宜的肽共價(jià)連接時(shí)，可用來引發(fā)CTL(參見例如Deres et al. ,Nature 1989，342 561-4)。
施用的方法可以是口服、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)注射等等，及系統(tǒng)施用或局部施用至靶位點(diǎn)附近。施用可以通過單次施用來實(shí)施，或者通過多次施用來強(qiáng)化。本發(fā)明肽的劑量可以依據(jù)要治療的疾病、患者的年齡、重量、施用的方法等等恰當(dāng)加以調(diào)整，通常是0. OOlmg 至lOOOmg，例如0. OOlmg至lOOOmg，例如0. Img至10mg，而且可以每少數(shù)天施用一次至每少數(shù)月施用一次。本領(lǐng)域技術(shù)人員能恰當(dāng)選擇合適的劑量。
(2)含有多核苷酸作為活性組分的藥物制劑或組合物 本發(fā)明的藥物制劑或組合物也可含有處于可表達(dá)形式的編碼本文中公開的肽的核酸。在本文中，短語“處于可表達(dá)形式的”意味著多核苷酸在導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)會在體內(nèi)表達(dá)成誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力的多肽。在一個(gè)例示性的實(shí)施方案中，感興趣的多核苷酸的核酸序列包括多核苷酸表達(dá)所必需的調(diào)節(jié)元件。多核苷酸可具有為實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定插入靶細(xì)胞的基因組所需的配置(關(guān)于同源重組盒載體的描述參見例如Thomas KR&Capecchi MR,Cell 1987,51 503-12)。參見例如 Wolff et al.，Science 1990，247 :1465_8 ；美國專利 No. 5，580，859 ； 5，589，466 ；5，804，566 ；5，739，118 ；5，736，524 ；5，679，647 ；及 WO 98/04720?；?DNA 的投遞技術(shù)的例子包括“裸DNA”、易化(布比卡因、聚合物、肽介導(dǎo)的)投遞、陽離子脂質(zhì)復(fù)合物、和顆粒介導(dǎo)的(“基因槍”)或壓力介導(dǎo)的投遞(參見例如美國專利No. 5，922，687)。
本發(fā)明的肽還可用病毒或細(xì)菌載體來表達(dá)。表達(dá)載體的例子包括減毒病毒宿主， 諸如牛痘或禽痘。這種辦法涉及使用例如痘苗病毒作為載體來表達(dá)編碼肽的核苷酸序列。 在導(dǎo)入宿主后，重組牛痘病毒表達(dá)表達(dá)免疫原性肽，并由此引發(fā)免疫應(yīng)答?？捎糜诿庖呓臃N方案的牛痘載體和方法記載于例如美國專利No. 4，722，848。另一種載體的例子包括卡介苗(BCG，Bacille CalmetteGuerin)。BCG 載體記載于 Stover et al.，Nature 1991,351 456-60。有很多種可用于治療性施用或免疫接種的其它載體是顯而易見的，例如腺病毒和腺伴隨病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)載體、去毒炭疽毒素載體、諸如此類。參見例如 Shata et al.，Mol Med Today 2000,6 :66_71 ；Shedlock et al.，J Leukoc Biol 2000,68 :793_806 ；Hipp et al.，In Vivo 2000，14 :571_85。
將多核苷酸投遞入受試者可以是直接的，其中受試者直接暴露于攜帶多核苷酸的載體，或者是間接的，其中首先在體外用感興趣多核苷酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后將細(xì)胞移植入受試者。這兩種辦法分別稱作體內(nèi)和離體基因療法。
關(guān)于基因療法的方法的一般綜述參見Goldspiel et al.，Clinical Pharmacyl993, 12 488-505 ；Wu and ffu, Biotherapy 1991,3 87-95 ；Tolstoshev, Ann RevPharmacol Toxicol 1993,33 573-96 ；Mulligan, Science 1993,260 926-32 ； Morgan&Anderson, Ann Rev Biochem 1993,62 191-217 ；Trends inBiotechnology 1993,11(5) 155—215。在eds. Ausubel et al. ,Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,NY, 1993 ；及Krieger,Gene Transfer andExpression,A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990中描述的重組DNA技術(shù)領(lǐng)域的公知方法也可用于本發(fā)明。施用的方法可以是口服、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)注射等等，而且可使用系統(tǒng)施用或局部施用至靶位點(diǎn)附近。施用可以通過單次施用來實(shí)施，或者通過多次施用來強(qiáng)化。可以依據(jù)要治療的疾病、患者的年齡、重量、施用的方法等等恰當(dāng)調(diào)整合適載體或經(jīng)編碼本發(fā)明肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中的多核苷酸的劑量，而且通常是0. OOlmg至lOOOmg，例如0. OOlmg 至lOOOmg，例如0. Img至10mg，而且可以每數(shù)天施用一次至每數(shù)月施用一次。本領(lǐng)域技術(shù)人員能恰當(dāng)選擇合適的劑量。
X.使用肽、外來體、APC和CTL的方法 本發(fā)明的肽和編碼此類肽的多核苷酸可用于誘導(dǎo)APC和CTL。本發(fā)明的外來體和 APC也可用于誘導(dǎo)CTL。肽、多核苷酸、外來體和APC可以與任何其它化合物組合使用，只要該化合物不抑制它們的CTL誘導(dǎo)能力。因此，任何前文所述的本發(fā)明藥物制劑或組合物均可用于誘導(dǎo)CTL，而且除它們之外，那些包括肽和多核苷酸的也可用于誘導(dǎo)APC，如下文討論的。
(1)誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞(APC)的方法 本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的肽或編碼所述肽的多核苷酸來誘導(dǎo)APC的方法。誘導(dǎo) APC可以如上文“VI.抗原呈遞細(xì)胞”部分所述來實(shí)施。本發(fā)明還提供了用于誘導(dǎo)具有高水平CTL誘導(dǎo)能力的APC的方法，上文“VI.抗原呈遞細(xì)胞”項(xiàng)目下也提到了其誘導(dǎo)。
優(yōu)選的是，誘導(dǎo)APC的方法包括選自下組的至少一個(gè)步驟 a 使其HLA抗原為HLA-A0206的APC與本發(fā)明的肽接觸，和 b 將本發(fā)明的肽以可表達(dá)的形式導(dǎo)入其HLA抗原為HLA-A0206的APC。
這樣的APC誘導(dǎo)方法優(yōu)選地以體外或離體的方式實(shí)施。當(dāng)以體外或離體方式實(shí)施所述方法時(shí)，要誘導(dǎo)的APC可以從待治療的受試者或者其HLA抗原為HLA-A0206的其他個(gè)體獲得。
(2)誘導(dǎo)CTL的方法 另外，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的肽、編碼所述肽的多核苷酸、或呈遞所述肽的外來體或APC來誘導(dǎo)CTL的方法。
本發(fā)明還提供了使用編碼能形成T細(xì)胞受體(TCR)亞單位的多肽的多核苷酸來誘導(dǎo)CTL的方法，所述TCR亞單位識別(即結(jié)合)細(xì)胞表面上的本發(fā)明的肽與HLA-A0206抗原之間形成的復(fù)合物。優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)CTL的方法包括選自下組的至少一個(gè)步驟 (a)使CD8-陽性T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞和/或外來體接觸，所述抗原呈遞細(xì)胞和外來體在其表面上呈遞HLA-A0206抗原與本發(fā)明的肽之間形成的復(fù)合物；和 (b)向⑶8-陽性T細(xì)胞中導(dǎo)入編碼能夠形成TCR亞單位的多肽的多核苷酸，所述 TCR亞單位可識別HLA-A0206抗原與本發(fā)明的肽之間形成的復(fù)合物。
當(dāng)本發(fā)明的肽被施用給受試者后，受試者的身體中誘導(dǎo)出CTL，而且靶向癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答的強(qiáng)度增強(qiáng)?；蛘?，肽和編碼肽的多核苷酸可用于離體治療方法，其中在體外用本發(fā)明的肽接觸(刺激)受試者衍生的APC和CD8陽性細(xì)胞或外周血單核白細(xì)胞，并在誘導(dǎo) CTL后，將活化的CTL細(xì)胞返還給受試者。例如，該方法可包括下述步驟 a 自其HLA抗原為HLA-A0206的受試者收集APC ； b 用本發(fā)明的肽接觸步驟a的APC ； c 將步驟b的APC與其HLA抗原為HLA-A0206的OT8+T細(xì)胞混合，并共培養(yǎng)以誘導(dǎo) CTL;并 d :自步驟c的共培養(yǎng)物收集OT8+T細(xì)胞。
或者，依照本發(fā)明，提供了本發(fā)明的肽在制備用于誘導(dǎo)CTL的藥物組合物中的用途。另外，本發(fā)明提供了一種制備用于誘導(dǎo)CTL的藥物制劑或藥物組合物的方法或工藝，其中所述方法包括將本發(fā)明的肽與藥學(xué)可接受的載體混合或配制的步驟。另外，本發(fā)明還提供了用于誘導(dǎo)CTL的本發(fā)明的肽。
通過步驟d獲得的具有細(xì)胞毒性活性的OT8+T細(xì)胞可作為疫苗施用于受試者。上文步驟c中要與OT8+T細(xì)胞混合的APC也可通過將編碼本發(fā)明肽的基因轉(zhuǎn)移入APC來制備， 如上文“VI.抗原呈遞細(xì)胞”部分中詳述的；但是不限于此，任何將本發(fā)明的肽有效呈遞給T 細(xì)胞的APC或外來體均可用于本發(fā)明的方法。
提供下面的實(shí)施例來例示本發(fā)明及幫助本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來制備和使用本發(fā)明。實(shí)施例并非意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例 材料和方法 細(xì)胞系 PSCCA0922 (HLA-A0206)購自 Pharma SNP Consortium ;PSC。人 B-淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系和C0S7均購自ATCC。
自HIG2或URLClO衍生的候選肽 自HIG2或URLClO衍生的9聚物和10聚物肽由Sigma(札幌，日本)或 Biosynthesis Inc. (Lewisville,TX)依照標(biāo)準(zhǔn)固相合成法合成，并通過反相高效液相層析 (HPLC)進(jìn)行了純化。分別通過分析性HPLC和質(zhì)譜術(shù)分析測定了肽的純度(> 90% )和身份。將肽以20mg/ml在二甲亞砜(DMSO)中溶解，并保存于_80°C。
體外CTL誘導(dǎo) 使用單核細(xì)胞的衍生樹突細(xì)胞(DC)作為抗原呈遞細(xì)胞(APC)來誘導(dǎo)針對人白細(xì)胞抗原(HLA)上呈遞的肽的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答。如別處(Nakahara S et al.，Cancer Res 2003Jul 15，63 (14) :4112_8)所述在體外生成 DC。具體而言，將用 Ficoll-Plaque(Pharmacia)溶液自正常志愿者(HLA-A0206陽性)分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)通過粘附至塑料組織培養(yǎng)皿(BectonDickinson)來加以分離，以將它們作為單核細(xì)胞級分富集。在含有2%熱滅活自體血清(AS)的AIM-V培養(yǎng)基(Invitrogen)中在1000U/ml粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF) (R&D System)和1000U/ml白介素 (IL)-4(R&DSystem)存在下培養(yǎng)富集了單核細(xì)胞的群體。培養(yǎng)7天后，將經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的DC在AIM-V培養(yǎng)基中在3微克/ml β 2-微球蛋白存在下用20微克/ml每一種合成肽于 37°C沖激3小時(shí)。所生成的細(xì)胞表觀上在它們的細(xì)胞表面上表達(dá)DC相關(guān)分子，諸如⑶80、 ⑶83、⑶86和HLA II類(數(shù)據(jù)未顯示)。然后將這些經(jīng)肽沖激的DC用絲裂霉素C(MMC) 滅活(30微克/ml,30min)，并以1 20比例與用CD8陽性分離試劑盒(Dynal)通過正選擇獲得的自體⑶8+T細(xì)胞混合。在48孔板(Corning)中設(shè)立這些培養(yǎng)物；每個(gè)孔在0. 5ml AIM-V/2 % AS培養(yǎng)基中含有1. 5x IO4個(gè)經(jīng)肽沖激的DC、3x IO5個(gè)CD8+T細(xì)胞和10ng/ml IL-7 (R&D System)。3天后，給這些培養(yǎng)物補(bǔ)充IL-2 (CHIRON)至終濃度20IU/ml。在第7天和第14天，用自體肽沖激過的DC進(jìn)一步刺激T細(xì)胞。每次通過與上文所述相同的方式來制備 DC。在第21天在第三輪肽刺激后測試針對經(jīng)肽沖激的PSCCA0922細(xì)胞的CTLCTanaka H et al. ,Br J Cancer 2001 Jan 5,84(1) :94_9 ；Umano Y et al. ,Br J Cancer 2001 Apr 20， 84(8) 1052-7 ；Uchida N et al.，Clin Cancer Res 2004Dec 15,10(24) 8577-86 ；Suda T et al. ,Cancer Sci 2 006May,97(5) :411_9 ；Watanabe T et al. ,Cancer Sci 2005Aug, 96(8) :498-506)。
CTL擴(kuò)增規(guī)稈 使用與Riddell 等人(Walter EA et al.，N Engl J Med 1995 Oct 19,333(16) 1038-44 ；Riddell SR et al.，Nat Med 1996Feb，2(2) :216_23)記載的方法相似的方法在培養(yǎng)中擴(kuò)增CTL。將總共5x IO4個(gè)CTL在25ml AIM_V/5% AS培養(yǎng)基中懸浮，其中有在40ng/ ml抗CD3單克隆抗體(Pharmingen)存在下經(jīng)MMC滅活的兩種人B-淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系。啟動培養(yǎng)后一天，向培養(yǎng)物添加120IU/mlIL-2。在第5天、第8天和第11天給培養(yǎng)物補(bǔ)加新鮮的含有30IU/ml IL-2 的AIM-V/5%AS培養(yǎng)基(Tanaka H et al. ,Br J Cancer 200IJan 5， 84(1) 94-9 ；Umano Y et al. ,Br J Cancer 200IApr 20,84(8) 1052-7 ；Uchida N et al.， ClinCancer Res 2004Dec 15，10 (24) 8577-86 ；Suda T et al. , Cancer Sci 2006May, 97(5) 411-9 ；Watanabe T et al. , Cancer Sci 2005Aug,96(8) :498_506)。
CTL克隆的建立 在96圓底微量滴定板(Nalge Nunc International)中進(jìn)行稀釋以獲得0. 3、1和 3個(gè)CTL/孔。在總體積為150微升/孔的含5% AS的AIM-V中，將CTL與7xl04個(gè)細(xì)胞/ 孔的兩種人B-淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系、30ng/ml的抗⑶3抗體，和125U/ml的IL-2 —起培養(yǎng)。 10天后向培養(yǎng)基中加入50微升/孔的IL-2以使得IL-2的終濃度成為125U/ml。在第14 天測試CTL的CTL活性，并使用上述的相同方法擴(kuò)增CTL克隆。
特異性CTL活性 為了檢查特異性CTL活性，實(shí)施了干擾素(IFN)-Y酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISP0T)測定法和IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)。具體而言，制備經(jīng)肽沖激的PSCCA0922(lx IO4/孔)作為刺激細(xì)胞。使用48孔中培養(yǎng)的細(xì)胞作為應(yīng)答細(xì)胞。依照制造商的規(guī)程實(shí)施 IFN- y ELISP0T 測定法和 IFN- y ELISA 測定法。
強(qiáng)迫表達(dá)靶基因和/或HLA-A0206基因的細(xì)胞的建立 通過PCR 擴(kuò)增了編碼靴基因(HIG2 ；SEQ ID NO 3 和 URLC10 ；SEQ IDNO 5)或 HLA-A0206 (SEQ ID NO 7)的可讀框的 cDNA。將 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到 pcDNA3. Imyc-His 載體(Invitrogen)中。利用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(lipofectamine) (Invitrogen)依照制造商推薦的程序?qū)⒑邪谢蚝?或HLA-A0206的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到C0S7中。簡單地說，用10微克質(zhì)粒以140V、1000，沖激2. 5x IO6個(gè)C0S7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染起2天后，用細(xì)胞解離溶液處理經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，然后用作CTL活性測定的靶細(xì)胞。
結(jié)果 HIG2和URLC10在癌癥中表達(dá)增強(qiáng) 利用cDNA微陣列獲得的不同癌癥中的全局基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)揭示，HIG2 (GenBank Accession No. ΝΜ_013332 ；SEQ ID No. 3)和 URLClO (GenBankAccession No. ΝΜ_017527 ；SEQ ID No 5)表達(dá)上升。HIG表達(dá)在20例腎癌中的19例、9例軟組織腫瘤中的7例中與相應(yīng)的正常組織相比有效升高。URLClO表達(dá)在29例膀胱癌中的29例、16例宮頸癌中的15例、 7例膽管細(xì)胞癌中的7例、19食道癌中的7例、3例胃癌中的3例、27例NSCLC中的24例、 19例骨肉瘤中的15例、5例胰腺癌中的4例、和43例軟組織腫瘤中的33例中與相應(yīng)的正常組織相比有效升高。
使用來自HIG2的HLA-A0206限制型肽刺激T細(xì)胞和經(jīng)HIG2衍牛肽刺激的CTL系的律立 依照上文“材料和方法” 一節(jié)中描述的方案產(chǎn)生了針對HIG2衍生的肽的 CTL0用IFN- y ELISP0T測定法測定了肽特異性CTL活性(圖1)。此處的結(jié)果顯示 HIG2-A0206-9-4 (SEQ ID NO :1)相比于對照孔顯示出強(qiáng)有力的IFN-γ生成。此外，對用 SEQ ID Ν0:1刺激的1、2、5、7、8、10、13和14號陽性孔中的細(xì)胞進(jìn)行了擴(kuò)增以建立CTL系。 用IFN-γ ELISA測定法測定了那些CTL系的CTL活性(圖2)。這里的結(jié)果顯示，相比于未經(jīng)肽沖激的靶細(xì)胞，所有的CTL系針對經(jīng)相應(yīng)肽沖激的靶細(xì)胞均顯示出強(qiáng)有力的IFN-Y生成。因此，HIG2-A0206-9-4可誘導(dǎo)針對表達(dá)HLA-A0206的靶細(xì)胞的強(qiáng)有力的CTL系。
用HIG2衍牛的肽刺激的CTL克降的津立 依照上文“材料和方法”部分中所述的規(guī)程自這些CTL系進(jìn)行有限稀釋。圖3顯示了從HIG2-A0206-9-4(SEQ ID NO 1)CTL系建立CTL克隆的情況。相比于針對未經(jīng)肽沖激的靶物的活性，這些CTL克隆針對經(jīng)肽沖激的靶物均顯示出強(qiáng)有力而特異性的CTL活性。
針對表達(dá)HIG2和HLA-A0206的靶細(xì)胞的特異性CTL活性 對針對HIG2-A0206-9-4 (SEQ ID NO 1)產(chǎn)生的建成CTL克隆，檢查它們識別表達(dá) HIG2和HLA-A0206的靶細(xì)胞的能力。使用利用HIG2-A0206-9-4 (SEQ ID NO 1)生成的CTL 克隆作為效應(yīng)細(xì)胞，測試了針對用全長HIG2基因和HLA-A0206分子二者轉(zhuǎn)染的C0S7 (其充當(dāng)內(nèi)源表達(dá)HIG2和HLA-A0206的靶細(xì)胞的特異性模型)的特異性CTL活性。制備用全長 HIG2但未用HLA-A0206轉(zhuǎn)染、且用其他肽(HIG2-9-8 :YLLGVVLTL)沖激過的C0S7、以及用 HLA-A0206但未用全長HIG2轉(zhuǎn)染的C0S7作為對照。顯示最高的針對C0S7的特異性CTL活性的CTL克隆，是那些用HIG2和HLA-A0206 二者轉(zhuǎn)染的CTL克隆(圖4)。
此處的結(jié)果清楚地表明HIG2-A0206-9-4 (SEQ ID NO 1)被天然地加工并與 HLA-A0206 一起呈遞在靶細(xì)胞表面上，并識別CTL。因此，HIG2-A0206-9-4可充當(dāng)癌癥疫苗， 靶向其HLA抗原為HLA-A0206的受試者中表達(dá)HIG的癌細(xì)胞。
使用來自URLClO的HLA-A0206限制肽誘導(dǎo)CTL和經(jīng)URLClO衍生肽刺激的CTL系的津立 依照上文“材料和方法”中描述的方案產(chǎn)生了針對自URLClO衍生的肽的 CTL0用IFN- y ELISP0T測定法測定了肽特異性CTL活性(圖5)。此處的結(jié)果顯示 URLC10-A0206-10-211(SEQ ID NO 2)與對照孔相比顯示出強(qiáng)有力的IFN-γ生成。此外， 對用SEQ ID NO :2刺激的7號陽性孔中的細(xì)胞進(jìn)行了擴(kuò)增并建立了 CTL系。用IFN-γ ELISA測定法測定了該CTL系的CTL活性(圖6)。這里的結(jié)果顯示，相比于未經(jīng)肽沖激的靶細(xì)胞，該CTL系針對經(jīng)相應(yīng)肽沖激的靶細(xì)胞顯示出強(qiáng)有力的IFN-Y生成。因此，URLC10-A0206-10-211可誘導(dǎo)強(qiáng)有力的CTL系。
用HIG2衍牛的肽刺激的CTL克降的津立 依照上文“材料和方法”部分中所述的規(guī)程自這些CTL系進(jìn)行有限稀釋。圖7顯示了從URLC10-A0206-10-211(SEQ ID NO :2) CTL系建立CTL克隆的情況。相比于針對未經(jīng)肽沖激的靶物的活性，該CTL克隆針對經(jīng)肽沖激的靶物顯示出強(qiáng)有力而特異性的CTL活性。
針對表汰URLClO和HLA-A0206的靶細(xì)胞的特異件CTL活件 對針對URLC10-A0206-10-211(SEQ ID NO :2)產(chǎn)生的建成CTL克隆，檢查它們識別表達(dá) URLClO 和 HLA-A0206 的靶細(xì)胞的能力。使用利用 URLC10-A0206-10-211 (SEQ ID NO: 2)生成的CTL克隆作為效應(yīng)細(xì)胞，測試了針對用全長URLClO基因和HLA-A0206分子二者轉(zhuǎn)染的C0S7 (其充當(dāng)內(nèi)源表達(dá)URLClO和HLA-A0206的靶細(xì)胞的特異性模型)的特異性CTL 活性。制備用全長URLClO但未用HLA-A0206轉(zhuǎn)染的C0S7、以及用HLA-A0206但未用全長 URLClO轉(zhuǎn)染的C0S7作為對照。顯示最高的針對C0S7的特異性CTL活性的CTL克隆，是那些用URLClO和HLA-A0206 二者轉(zhuǎn)染的CTL克隆(圖8)。
此處的結(jié)果清楚地表明URLC10-A0206-10-211 (SEQ ID NO 16)被天然地加工并與 HLA-A0206 一起呈遞在靶細(xì)胞表面上，并識別CTL。因此，URLC10-A0206-10-211可充當(dāng)癌癥疫苗，靶向其HLA抗原為HLA-A0206的受試者中表達(dá)URLClO的癌細(xì)胞。
總之，鑒定了新的HLA-A0206 表位肽 HIG2-A0206-9-4(SEQ ID NO 1)和 URLC10-A0206-10-211 (SEQ ID NO 2)，并證明它們適用于在其HLA抗原為HLA-A0206的受試者中的癌癥免疫治療。
工業(yè)實(shí)用性 本發(fā)明描述了新的TAA，特別是那些HIG2或URLClO衍生的，它們誘導(dǎo)強(qiáng)有力且特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答，而且可以應(yīng)用于極其多種癌癥類型。此類TAA保證了進(jìn)一步開發(fā)針對與HIG2或URLClO有關(guān)的疾病的肽疫苗，所述疾病例如癌癥，如膀胱癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、食道癌、胃癌、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、骨肉瘤、胰腺癌、腎癌和軟組織腫瘤。
雖然本文中參照具體實(shí)施方案詳細(xì)地描述了本發(fā)明，但是要理解，上面的描述本質(zhì)上是例示性的和解釋性的，而且意圖例示本發(fā)明及其優(yōu)選實(shí)施方案。經(jīng)由常規(guī)實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會容易地認(rèn)識到，可以對本發(fā)明進(jìn)行各種變化和修飾，而不偏離本發(fā)明的精神和范圍，本發(fā)明的邊界和范圍由所附權(quán)利要求來限定。
權(quán)利要求
1.一種藥物制劑，其中該制劑包含一種或多種具有細(xì)胞毒性τ淋巴細(xì)胞(CTL)誘導(dǎo)能力的肽，其中所述肽包含選自下組的氨基酸序列(a)SEQ ID NO :1 禾口 2 ；禾口(b)SEQID NO :1和2，其中替代、插入、缺失和/或添加了 1個(gè)、2個(gè)或幾個(gè)氨基酸，或者一種或多種編碼這樣的肽的多核苷酸，與藥理學(xué)可接受的載體組合，該制劑配制為用于選自下組的目的(i)治療其HLA-A抗原是HLA-A0206的受試者中的癌癥，( )預(yù)防其HLA-A抗原是HLA-A0206的受試者中的癌癥，(iii)防止其HLA-A抗原是HLA-A0206的受試者中的癌癥的手術(shù)后復(fù)發(fā)，和(iv)上述的組合。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物制劑，其中所述癌癥選自膀胱癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、食道癌、胃癌、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、骨肉瘤、胰腺癌、腎癌和軟組織腫瘤。
3.權(quán)利要求1的藥物制劑，其配制成疫苗。
4.一種誘導(dǎo)具有高的CTL誘導(dǎo)能力的抗原呈遞細(xì)胞的方法，其中所述方法包括選自下組的步驟(a)使抗原呈遞細(xì)胞與包含選自SEQID NO 1和2的氨基酸序列的肽、或其中有至少一個(gè)氨基酸添加、插入、缺失或替換為其他氨基酸的這樣的肽接觸，和(b)將編碼包含選自SEQID NO :1和2的氨基酸序列的肽、或其中有至少一個(gè)氨基酸添加、插入、缺失或替換為其他氨基酸的這樣的肽的多核苷酸導(dǎo)入抗原呈遞細(xì)胞，其中所述抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)HLA-A0206抗原。
5.一種使用包含選自SEQ ID NO :1和2的氨基酸序列的肽、或其中有至少一個(gè)氨基酸添加、插入、缺失或替換為其他氨基酸的這樣的肽誘導(dǎo)CTL的方法，其中所述CTL識別 HLA-A0206抗原與所述肽的復(fù)合物。
6.一種分離的抗原呈遞細(xì)胞，該細(xì)胞在其表面上呈遞HLA-A0206抗原與包含選自SEQ ID NO 1和2的氨基酸序列的肽、或其中有至少一個(gè)氨基酸添加、插入、缺失或替換為其他氨基酸的這樣的肽的復(fù)合物。
7.一種分離的CTL，其識別HLA-A0206抗原與包含選自SEQ ID NO :1和2的氨基酸序列的肽、或其中有至少一個(gè)氨基酸添加、插入、缺失或替換為其他氨基酸的這樣的肽的復(fù)合物。
8.一種用于誘導(dǎo)具有高的CTL誘導(dǎo)能力的抗原呈遞細(xì)胞的作用劑，其中所述作用劑包含(a)一種或多種具有CTL誘導(dǎo)能力的肽，其中所述肽包含選自下組的氨基酸序列(i)SEQID NO :1 禾口 2 ；禾口(ii)SEQID NO :1和2，其中替代、插入、缺失和/或添加了 1個(gè)、2個(gè)或幾個(gè)氨基酸，(b)一種或多種編碼這樣的肽的多核苷酸。
9.一種在其HLA抗原為HLA0206的受試者中誘導(dǎo)抗癌癥免疫應(yīng)答的方法，其中所述方法包括對受試者施用包含下述物質(zhì)的作用劑的步驟具有CTL誘導(dǎo)能力且具有選自SEQ ID NO :1或2的氨基酸序列的肽；其中有至少一個(gè)氨基酸添加、插入、缺失或替換為其他氨基酸的這樣的肽；編碼這樣的肽的多核苷酸；權(quán)利要求6的分離的抗原呈遞細(xì)胞；或權(quán)利要求7的分離的CTL。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述癌癥選自膀胱癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、食道癌、胃癌、 非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、骨肉瘤、胰腺癌、腎癌和軟組織腫瘤。
11.一種用于在其HLA抗原為HLA0206的受試者中誘導(dǎo)抗癌癥免疫應(yīng)答的作用劑，其中所述作用劑包含與藥理學(xué)可接受載體組合的(a)一種或多種具有CTL誘導(dǎo)能力的肽，其中所述肽包含選自下組的氨基酸序列(i)SEQID NO 1 和 2，和(ii)SEQID NO :1和2，其中替代、插入、缺失和/或添加了 1個(gè)、2個(gè)或幾個(gè)氨基酸；(b)一種或多種編碼這樣的肽的多核苷酸；(c)一種或多種權(quán)利要求6的分離的抗原呈遞細(xì)胞；(d)一種或多種權(quán)利要求7的分離的CTL ；或(e)上述的組合。
全文摘要
本發(fā)明提供藥物制劑或組合物，所述藥物制劑或組合物含有一種或多種具有氨基酸序列SEQ ID NO1或2的肽或一種或多種編碼此類肽的多核苷酸，配制為用于治療和/或預(yù)防其HLA-A抗原為HLA-0206的受試者體內(nèi)的癌癥。此外，本發(fā)明提供利用此類肽、多核苷酸或藥物制劑誘導(dǎo)CTL和抗原呈遞細(xì)胞的方法。
文檔編號C07K14/47GK102186491SQ200980141320
公開日2011年9月14日 申請日期2009年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月19日
發(fā)明者角田卓也, 大澤龍司, 吉村祥子 申請人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司