專利名稱：通過固相合成制備的肽的純化的制作方法
通過固相合成制備的肽的純化發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及用于純化通過固相肽合成制備的肽的方法，包括用于所述方法的試 劑的試劑盒和通過所述方法獲得的純化肽。
發(fā)明背景
多肽越來越多地用作藥劑用于治療在所有主要治療領(lǐng)域內(nèi)的疾病。用于治療應(yīng) 用的多肽是待高度純化的，以便有效且提供在施用于患者后不引起不利事件的確定性。
獲得治療肽的一種方法是通過固相肽合成。固相合成的產(chǎn)物是與不溶性載體結(jié) 合的肽。隨后使以這種方式合成的肽與樹脂切割開，并且分離經(jīng)切割的肽。
為了避免固相肽合成方法中的副反應(yīng)，胺基團在偶聯(lián)反應(yīng)過程中用氨基末端保 護基團(也稱為N末端保護基團)掩蔽，其包括與氨基酸的α氨基偶聯(lián)的化學(xué)部分。一 般地，氨基末端保護基團在將下一個氨基酸加入生長中的肽鏈前在脫保護反應(yīng)中去除， 但當(dāng)肽在固相合成過程中與載體切割開時可以維持。在洗滌或還以其他方式處理肽時， 氨基末端基團可以維持。
來自固相肽合成的粗肽混合物包括大量有機溶劑、試劑和方法相關(guān)雜質(zhì)。通 常，肽混合物顯示出高UV吸收，這干擾在層析控制方法中的線內(nèi)UV測量。此外，大 部分雜質(zhì)降低離子交換劑的能力并且難以完全去除。因此，即使在純化后一般也存在雜 質(zhì)水平。
9-芴甲氧羰基(Fmoc)是優(yōu)選N末端保護基團的例子。Fmoc是堿敏感性N末 端保護基團，其可以通過堿與氨基酸脫偶聯(lián)。
已知二苯富烯(DBF)在保護基團例如Fmoc的切割過程中產(chǎn)生，并且后續(xù)去除是 復(fù)雜且昂貴的。因此，非常需要在固相肽合成后的有效純化方法。
發(fā)明概述
根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，提供了用于純化通過固相肽合成制備的肽的方法， 其包括使通過固相肽合成制備的肽的粗提取物與固體載體接觸的步驟。
根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，提供了固相肽合成試劑盒，其包括用于固相肽合成 的試劑、如本文定義的固體載體、和依照本文定義方法使用所述試劑盒的說明書。
根據(jù)本發(fā)明的第三個方面，提供了通過本文所述方法獲得的肽。
附圖簡述


圖1。通過經(jīng)由固相合成制備的肽的控制純化獲得的層析譜。
圖2。在包括聚乙烯的容器中通過固相合成制備的肽貯存后獲得的層析譜。
圖3。在100%乙醇的存在下通過固相合成制備的肽層析分離后獲得的層析譜。
發(fā)明描述
下述是說明書中使用的術(shù)語的詳細定義。
如本文使用的，術(shù)語“緩沖劑”指減少溶液例如層析溶液的pH隨著時間過去 改變的趨勢的化學(xué)化合物，否則將發(fā)生所述改變。緩沖劑包括下述非限制性例子乙酸 鈉、碳酸鈉、檸檬酸鈉、甘氨酰甘氨酸、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、磷酸鈉、硼酸鹽、三羥甲基氨基甲烷、乙醇胺及其混合物。
如本文可互換使用的，術(shù)語“多肽”或“肽”意指由通過肽鍵連接的至少5個 組成成分氨基酸組成的化合物。組成成分氨基酸可以來自由遺傳密碼編碼的氨基酸組， 并且它們可以是并非由遺傳密碼編碼的天然氨基酸，以及合成氨基酸。22種編碼(也 稱為proteogenic)氨基酸是丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨 酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、羥脯氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲 硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸。并非由遺傳 密碼編碼但可以經(jīng)由肽鍵摻入肽內(nèi)的天然氨基酸可以指定為天然非proteogenic氨基酸， 并且是例如Y-羧基谷氨酸、鳥氨酸、磷酸絲氨酸、D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成非 proteogenic氨基酸包括通過化學(xué)合成制造的氨基酸，即由遺傳密碼編碼的氨基酸的D-同 分異構(gòu)體，例如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib(a-氨基異丁酸)、Abu(a_氨基丁酸)、 Tle(叔丁基甘氨酸)、3-氨基甲基苯甲酸、鄰氨基苯甲酸、氨基酸的β類似物例如β-丙 氨酸等、D-組氨酸、去氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、同組氨酸、 Na-乙?；?組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2_吡 啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸、(1-氨基環(huán)丙基)羧酸、(1-氨基環(huán)丁基)羧酸、(1-氨 基環(huán)戊基)羧酸、(1-氨基環(huán)己基)羧酸、(1-氨基環(huán)庚基)羧酸或(1-氨基環(huán)辛基)羧 酸。
多肽可以包括單條肽鏈，或它可以包括超過一條肽鏈，例如其中2條鏈通過二 硫鍵連接的人胰島素。
如本文使用的，術(shù)語“胰高血糖素樣肽”指促胰島素分泌肽(exendins)例如促 胰島素分泌肽-3和促胰島素分泌肽_4，以及除衍生自胰高血糖素前原基因的胰高血糖素 外的同源肽，即胰高血糖素樣肽I(GLP-I)、胰高血糖素樣肽2 (GLP-2)和胃泌酸調(diào)節(jié)素 (OXM)以及其類似物和衍生物。在吉拉毒蜥(Gilamonster)中發(fā)現(xiàn)的促胰島素分泌肽與 GLP-I同源，并且也發(fā)揮促胰島素效應(yīng)。促胰島素分泌肽的例子是促胰島素分泌肽-4和 促胰島素分泌肽_3。胰高血糖素樣肽具有SEQ IDNos. 1-6中所示序列
胰高血糖素6EQ ID NO 1)；
GLP-I (SEQ ID NO 2)；
GLP-2 (SEQ ID NO 3)；
促胰島素分泌肽-4 (SEQ ID NO 4)；
促胰島素分泌肽-3 6EQ IDNO 5)；和
OXM (SEQ ID NO 6)。
如本文提及肽使用的術(shù)語“類似物”意指經(jīng)修飾的肽，其中肽的一個或多個氨 基酸殘基已由其他氨基酸殘基置換和/或其中一個或更多個氨基酸殘基已從肽中缺失， 和或其中一個或更多個氨基酸殘基已加入肽中。氨基酸殘基的此類加入或缺失可以在肽 的N末端上和/或在肽的C末端上發(fā)生。2種不同且簡單的系統(tǒng)通常用于描述類似物 例如Arg34-GLP-I (7-37)或04R-GLP-1 (7-37)指定GLP-1類似物，其中在第；34位上天 然存在的賴氨酸已由精氨酸置換(根據(jù)IUPAC-IUB命名法使用的關(guān)于氨基酸的標準單或 三字母縮寫)。關(guān)于其未陳述旋光異構(gòu)體的所有氨基酸應(yīng)理解為意指L-同分異構(gòu)體。
在本發(fā)明的實施方案中，最大限度17個氨基酸已進行修飾。在本發(fā)明的實施方案中，最大限度15個氨基酸已進行修飾。在本發(fā)明的實施方案中，最大限度10個氨基 酸已進行修飾。在本發(fā)明的實施方案中，最大限度8個氨基酸已進行修飾。在本發(fā)明的 實施方案中，最大限度7個氨基酸已進行修飾。在本發(fā)明的實施方案中，最大限度6個 氨基酸已進行修飾。在本發(fā)明的實施方案中，最大限度5個氨基酸已進行修飾。在本發(fā) 明的實施方案中，最大限度4個氨基酸已進行修飾。在本發(fā)明的實施方案中，最大限度 3個氨基酸已進行修飾。在本發(fā)明的實施方案中，最大限度2個氨基酸已進行修飾。在 本發(fā)明的實施方案中，最大限度1個氨基酸已進行修飾。
如本文就肽而言使用的術(shù)語“衍生物”意指化學(xué)修飾的肽或其類似物，其中至 少一個取代基不存在于未修飾的肽或其類似物中，即已進行共價修飾的肽。一般的修飾 是酰胺、碳水化合物、烷基、?；?、酯、聚乙二醇化等。GLP-I (7-37)衍生物的例子是 NE26-((4S)-4-(十六酰氨基)-羧基-丁酰)[Arg34, Lys26]GLP-l-(7-37)。
如本文就肽而言使用的術(shù)語“其片段”意指具有親本多肽至少20%氨基酸的肽 的任何片段。因此，對于人血清白蛋白，片段將包括至少117個氨基酸，因為人血清白 蛋白具有585個氨基酸。在一個實施方案中，片段具有親本肽的至少35%氨基酸。在另 一個實施方案中，片段具有親本肽的至少50%氨基酸。在另一個實施方案中，片段具有 親本肽的至少75%氨基酸。
如本文就肽而言使用的術(shù)語“變體”意指經(jīng)修飾的肽，其是親本肽的類似物、 親本肽的衍生物、或親本肽類似物的衍生物。
如本文使用的，術(shù)語“GLP-1肽”意指GLP-I (7-37)、GLP_1 (7_37)的類似 物、GLP-I (7-37)的衍生物、或GLP-I (7-37)類似物的衍生物。
如本文使用的，術(shù)語“GLP-2肽”意指GLP-2(l-33)、GLP-2的類似物、 GLP-2(l-33)的衍生物、或GLP-2(l-33)類似物的衍生物。
如本文使用的，術(shù)語“促胰島素分泌肽-4肽”意指促胰島素分泌肽-4(1-39)、 促胰島素分泌肽-4類似物、促胰島素分泌肽-4衍生物、或促胰島素分泌肽-4類似物的 衍生物。
如本文使用的，術(shù)語“血漿穩(wěn)定的”胰高血糖素樣肽例如GLP-I、GLP-2、胰 高血糖素、促胰島素分泌肽-3或促胰島素分泌肽-4意指化學(xué)修飾的胰高血糖素樣肽， 即例如GLP-1、GLP-2、胰高血糖素、促胰島素分泌肽-3或促胰島素分泌肽-4的類似 物或衍生物，其在人中顯示出至少10小時的體內(nèi)血漿清除半衰期，如通過下述方法測定 的。用于測定胰高血糖素樣肽在人中的血漿清除半衰期的方法是使化合物溶解于等滲 緩沖液，pH7.4，PBS或任何其他合適緩沖液中。劑量外周地優(yōu)選在腹部或大腿上部內(nèi) 注射。用于測定活性化合物的血樣以頻繁間隔并且以足夠持續(xù)時間獲得，以覆蓋終末消 除部分(例如劑量前、劑量后1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、24(天2)、36(天2)、 48 (天3)、60 (天3)、72 (天4)和84 (天4)小時)?；钚曰衔餄舛鹊臏y定如Wilken 等人，Diabetologia 43 (51) A143，2000中所述執(zhí)行。衍生的藥代動力學(xué)參數(shù)通過使用 非區(qū)室法由關(guān)于每個個別受試者的濃度時間數(shù)據(jù)計算，使用商購可得的軟件WinNonKn版 本2.lCPharsight，Cary, NC, USA)。終末消除速率常數(shù)通過對濃度時間曲線的末端對 數(shù)線性部分的對數(shù)線性回歸進行估計，并且用于計算消除半衰期。
如本文使用的，術(shù)語“促胰島素試劑”意指其為人GLP-I受體的激動劑的化合物，即在包含人GLP-I受體的合適培養(yǎng)基(一種此類培養(yǎng)基在下文公開)中刺激cAMP 形成的化合物。促胰島素試劑的效力通過如下所述根據(jù)劑量應(yīng)答曲線計算EC5tl值進行測定。
表達克隆人GLP-I受體(BHK-467-12A)的幼倉鼠腎(BHK)細胞在DMEM培 養(yǎng)基中生長，所述DMEM培養(yǎng)基添加有100IU/mL青霉素、lOOyg/mL鏈霉素、5%胎 牛血清和0.5mg/mL遺傳霉素G_418 (Life Technologies)。細胞在磷酸鹽緩沖鹽水中洗滌 2次，并且用維爾烯(Versene)收獲。通過用Ultraturrax在緩沖液1 QOmM HEPES-Na> IOmM EDTA，pH 7.4)中勻漿化由細胞制備質(zhì)膜。使勻漿物在48,000 下在4°C下離心 15分鐘。通過在緩沖液2(20mMHEPES_Na、O.lmMEDTA，pH 7.4)中勻漿化使團塊懸 浮，隨后在48,000 下在4°C下離心15分鐘。洗滌操作再重復(fù)一次。使最終團塊懸浮 于緩沖液2中，并且緊用于測定或貯存于-80°C下。
功能受體測定通過測量作為響應(yīng)經(jīng)由促胰島素試劑刺激的環(huán)狀A(yù)MP(cAMP)來 執(zhí)行。所形成的 cAMP 通過 AlphaScreen cAMP Kit (Perkin Elmer Life Sciences)進行 定量。溫育在一半面積96孔微量滴定板中在50μL緩沖液3(50mMTris-HCI、5mM HEPES> IOmMMgCl2, pH 7.4)總體積中執(zhí)行且伴隨下述添加ImM ATP、1 μ M GTP> 0.5mM3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、0.01 % Tween-20、0.1 % BSA、6 μ g 膜制 劑、lSyg/mL受體珠、與6nM生物素基-cAMP預(yù)溫育的20 μ g/mL供體珠。使待測 試激動劑活性的化合物在緩沖液3中溶解且稀釋。新鮮制備GTP用于每次實驗。使板 在黑暗中伴隨緩慢攪拌在室溫下溫育3小時，隨后為在Rision 儀器(Perkin Elmer Life Sciences)中計數(shù)。對于個別化合物描繪濃度應(yīng)答曲線，并且使用4參數(shù)對數(shù)模型與Prism v.4.0 (GraphPad, Carlsbad, CA)估計 EC50 值。
如本文使用的，術(shù)語“DPP-IV保護的胰高血糖素樣肽”意指與天然肽比 較進行化學(xué)修飾的胰高血糖素樣肽，以使得所述胰高血糖素樣肽對血漿肽酶二肽氨肽 酶-4 (DPP-IV)更有抵抗力。
肽對經(jīng)由二肽氨肽酶IV降解的抵抗力通過下述降解測定法進行測定
使等分試樣的肽(5nmol)在37°C下和與5mU酶促活性對應(yīng)的1 μ L純化二肽氨 肽酶IV在100 μ L 0.1Μ三乙胺-HCl緩沖液，pH 7.4中溫育10-180分鐘。酶促反應(yīng)通 過加入5 μ L 10%三氟乙酸得到終止，并且使用HPLC分析使肽降解產(chǎn)物分離且定量。用 于執(zhí)行這種分析的一種方法是
將混合物應(yīng)用到Vydac C18 大孔(widepore) (30nm 孔，5 μ m 顆粒)250x4.6mm 柱上，并且以lml/分鐘的流速用在0.1%三氟乙酸中的乙腈線性階式梯度洗脫(0%乙腈3 分鐘，0- %乙腈17分鐘，24-48%乙腈1分鐘)，根據(jù)Skgel等人，Regul.Pept.1999 ； 79: 93-102 和 Mentlein 等人 Eur.J.Biochem. 1993 ； 214 829-350 肽及其降解產(chǎn)物可以通 過其在220nm(肽鍵)或^Onm(芳香族氨基酸)下的吸光度進行監(jiān)控，并且通過其與標 準那些相關(guān)的峰面積的積分進行定量。肽通過二肽氨肽酶IV的水解速率在導(dǎo)致小于10% 的肽被水解的溫育時間下進行估計。
如本文使用的，術(shù)語“免疫調(diào)節(jié)的促胰島素分泌肽-4化合物”意指這樣的促胰 島素分泌肽-4肽，與促胰島素分泌肽-4 (1-39)比較，其是在人中具有減少的免疫應(yīng)答的 促胰島素分泌肽-4 (1-39)類似物或衍生物。用于評估免疫應(yīng)答的方法是在患者治療4周后測量對促胰島素分泌肽-4化合物反應(yīng)的抗體濃度。
如本文使用的，術(shù)語“胰島素肽”意指其為人胰島素、人胰島素類似物或化學(xué) 修飾的人胰島素的肽，即人胰島素的衍生物或人胰島素類似物。
如本文使用的，術(shù)語“人胰島素”意指其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)眾所周知的人激素。人胰 島素具有通過在半胱氨酸殘基之間的二硫橋連接的2條多肽鏈，即A鏈和B鏈。A鏈是 21氨基酸肽，并且B鏈是30氨基酸肽，所述2條鏈通過3個二硫橋連接一個在A鏈的 第6和11位中的半胱氨酸之間，第二個在A鏈的第7位中的半胱氨酸和B鏈的第7位中 的半胱氨酸之間，并且第三個在A鏈的第20位中的半胱氨酸和B鏈的第19位中的半胱 氨酸之間。
如本文使用的，術(shù)語“多肽產(chǎn)物”意指待用于制造藥物組合物的純化肽產(chǎn)物。 因此，多肽產(chǎn)物通常作為來自最終純化、干燥或條件處理步驟的產(chǎn)物獲得。產(chǎn)物可以是 晶體、沉淀物、溶液或懸浮液。多肽產(chǎn)物在本領(lǐng)域中也稱為原料藥，即活性藥學(xué)成分。
如本文使用的，術(shù)語“等電點”意指其中大分子例如多肽的凈總電荷是零的pH 值。在可能存在許多荷電基團的多肽中，并且在等電點下，所有這些電荷的總和是零。 在高于等電點的pH下，多肽的凈總電荷將是負的，而在低于等電點的pH值下，多肽的 凈總電荷將是正的。
如本文使用的，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”意指適合于正常藥學(xué)應(yīng)用，即在患者 中不產(chǎn)生不利事件。
如本文使用的，術(shù)語“賦形劑”意指通常加入藥物組合物中的化學(xué)化合物，即 緩沖劑、張度劑、防腐劑等。
如本文使用的，術(shù)語“有效量”意指與不治療比較，足以有效治療患者的用量。
如本文使用的，術(shù)語“藥物組合物”意指包括活性化合物或其鹽連同藥學(xué)賦形 劑例如緩沖劑、防腐劑和任選地張度改性劑和/或穩(wěn)定劑的產(chǎn)物。因此，藥物組合物在 本領(lǐng)域中也稱為藥物制劑。
如本文使用的，術(shù)語“疾病治療”意指已發(fā)展疾病、病狀或病癥的患者的管理 和照顧。治療目的是對抗疾病、病狀或病癥。治療包括施用活性化合物以消除或控制疾 病、病狀或病癥，以及減輕與疾病、病狀或病癥相關(guān)的癥狀或并發(fā)癥。
應(yīng)當(dāng)理解固相肽合成是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。此外，保護基團與肽的偶 聯(lián)和后續(xù)脫保護步驟也是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
在一個實施方案中，固相肽合成包括使用Fmoc作為氨基末端保護基團。在一 個進一步的實施方案中，本發(fā)明的純化方法包括用于從粗肽提取物中去除二苯富烯的方 法。在一個實施方案中，固相肽合成產(chǎn)物的脫保護步驟包括堿的使用。在一個進一步的 實施方案中，堿選自仲胺和/或能夠氫解的試劑。在一個再進一步的實施方案中，堿選 自哌啶、二乙胺和哌嗪。
在一個實施方案中，固相肽合成產(chǎn)物的脫保護步驟在溶劑例如N-甲基吡咯烷酮 (NMP)、二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷(DCM)中執(zhí)行。
在一個實施方案中，在脫保護步驟后獲得的粗肽提取物的純化包括將粗肽提取 物應(yīng)用于固體載體，隨后從其中洗脫純化產(chǎn)物。
在一個實施方案中，固體載體包括離子交換層析柱。在一個進一步的實施方案 中，固體載體包括陰離子樹脂或陽離子樹脂。在一個再進一步的實施方案中，固體載體 包括選自 Source 30Q、Poros 50HQ、QSepharose HP> Q Ceramic HyperD F 的樹脂。在一個再進一步的實施方案中，固體載體包括陰離子樹脂(例如季銨樹脂例如Source 30Q)。
在其中固體載體包括離子交換層析柱的本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的純 化方法包括下述步驟
(a)在標準層析條件下，用得自固相合成的粗肽提取物裝載離子交換層析柱；
(b)用醇執(zhí)行洗脫步驟；和
(c)用一種或更多種緩沖劑執(zhí)行層析分離。
在一個實施方案中，在步驟(b)中的醇是CV5醇，即具有1-5個碳原子的醇。 在另一個實施方案中，醇是CV3醇。在一個實施方案中，醇是選自下述的未分支或分支 醇甲醇、乙醇、1-丙醇(丙醇)、2-丙醇(異丙醇)、2-甲基-1-丙醇(異丁醇)、 2-甲基-2-丙醇(叔丁醇)、1-丁醇(丁醇)、2-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁 醇、2-甲基-2-丁醇、3-甲基-2-丁醇、1-戊醇(戊醇)、2-戊醇和3-戊醇。在一個進 一步的實施方案中，醇選自乙醇和丙醇。在一個實施方案中，在步驟(b)中的醇選自 70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇(在水中)和100%乙醇。在一個實施方案中，在步驟 (b)中的醇是100%乙醇。
本發(fā)明的這個實施方案提供了洗脫步驟(步驟(b))有效去除來自離子交換柱的 雜質(zhì)的優(yōu)點。例如，當(dāng)Fmoc已在肽合成方法中用作N末端保護基團時，已驚奇地發(fā)現(xiàn)這 個步驟選擇性洗脫二苯富烯。層析分離步驟(步驟(C))隨后在不存在任何殘留雜質(zhì)(例 如二苯富烯)的情況下分離純化肽，如本文證實的。
在步驟(c)中可以使用的緩沖劑的例子包括Tris(三(羥甲基)甲胺)、 TAPS(3-{[三(羥甲基)甲基]氨基}丙磺酸、Bicine(N，N-二(2-羥乙基)甘氨 酸)、Tricine(N_三(羥甲基)甲基甘氨酸)、HEPES 羥乙基-1-哌嗪乙磺酸)、 TES(2-{[三(羥甲基)甲基]氨基}乙磺酸、MOPS (3-(N-嗎啉代)丙磺酸、PIPES(哌 嗪-N，N'-雙O-乙磺酸))、Cacodylate ( 二甲基胂酸鹽)、MES (2- (N-嗎啉代)乙 磺酸)或乙酸鹽。在一個實施方案中，在步驟(c)中使用的緩沖劑包括Tris緩沖劑(例 如緩沖至 pH 8.0 的 0.02mol/kg Tris)。
應(yīng)當(dāng)理解緩沖劑可以在步驟(C)中任選在一種或更多種溶劑(例如乙醇，例如 50% (w/w)乙醇)的存在下使用。還應(yīng)當(dāng)理解用于分離步驟(C)的條件一般是本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的那些。例如，用第一種緩沖液平衡，隨后通過應(yīng)用從第一種緩沖液到 第二種緩沖液(其一般將與第一種緩沖液相同，除一種或更多種鹽(例如氯化鈉，例如 0.0625mol/kg氯化鈉)的存在外)的線性梯度洗脫。
在一個實施方案中，固體載體包括包含熱塑性聚合物例如聚乙烯、聚丙烯、聚 苯乙烯或相似材料的包裝材料，例如容器、粒狀物、顆粒物或漏斗架。在另一個實施方 案中，固體載體包括包含聚乙烯、聚丙烯或聚苯乙烯的包裝材料，例如容器、粒狀物、 顆粒物或漏斗架。在另外一個實施方案中，固體載體包括包含聚乙烯的包裝材料，例如 容器、粒狀物、顆粒物或漏斗架。
當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“容器”應(yīng)意指在純化前或后用于包含待純化肽的任何裝置。
在其中固體載體包括包含熱塑性聚合物的包裝材料的本發(fā)明的實施方案中，本 發(fā)明的純化方法包括下述步驟
(a)將得自固相合成的粗肽提取物加入包裝材料中；
(b)使提取物在包裝材料中溫育；
(c)從包裝材料中取出提取物；和
(d)對提取物實施標準肽分離。
當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“標準肽分離”應(yīng)意指適合于使肽與雜質(zhì)分離的 本領(lǐng)域已知的任何分離法，例如層析分離(例如離子交換層析、疏水作用層析或反相 HPLC(高效液相層析))、超濾(UF)、等電沉淀或任何其他合適分離法。
在一個實施方案中，在步驟(d)中的標準肽分離是離子交換層析例如陰離子交 換層析。
提及“聚乙烯”、“聚丙烯”等包括提及由乙烯(IUPAC名稱ethene)、丙烯 (IUPAC名稱propene)等多個(即超過一個)單體單位組成的聚合物。為了例示，聚乙 烯的一般結(jié)構(gòu)在下文作為式⑴的化合物顯示，其中η是整數(shù)
(I)
聚乙烯可以以高密度聚乙烯(HDPE)或低密度聚乙烯(LDPE)的形式。在一個 實施方案中，聚乙烯是高密度聚乙烯(HDPE)。HDPE具有低分支度，并且因此具有更 強的分子間作用力和抗張強度，并且由大于或等于0.941g/cm3的密度限定。LDPE由 0.910-0.940g/cm3的強度范圍限定。
聚丙烯可以以高密度聚丙烯(HDPP)或低密度聚丙烯(LDPP)的形式。在一個 實施方案中，聚丙烯是高密度聚丙烯(HDPP)。
本發(fā)明的這個實施方案提供了給限定包裝材料添加粗肽提取物導(dǎo)致雜質(zhì)與包裝 材料表面附著的優(yōu)點。因此，該方法有效去除來自粗肽提取物的雜質(zhì)。例如，當(dāng)Fmoc 已在肽合成方法中用作N末端保護基團時，已驚奇地發(fā)現(xiàn)這個步驟使二苯富烯與聚乙烯 包裝材料表面選擇性附著，如本文證實的。
在一個實施方案中，溫育步驟(b) —般包括在環(huán)境溫度(例如室溫)下溫育2分 鐘-10小時的持續(xù)時間。在另一個實施方案中，持續(xù)時間是2分鐘-2小時。在另外一 個實施方案中，持續(xù)時間是2分鐘-30分鐘。
在一個實施方案中，步驟(b)可以另外包括提取物的攪拌。
在一個實施方案中，步驟(d) —般包括依照已知操作的層析分離，其可以包括批吸附、填充柱或濾器。
在一個實施方案中，步驟(d)包括層析分離，其中使用填充柱或濾器，并且其 中停留時間是至少0.1分鐘。在另一個實施方案中，停留時間是至少1分鐘。在另外一 個實施方案中，停留時間是0.1分鐘-60分鐘。在另外一個實施方案中，停留時間是0.1 分鐘-10分鐘。
當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“停留時間”應(yīng)理解為肽與包裝材料接觸的平均時 間，即肽如何快速地移動通過包裝材料。
在本發(fā)明的一個實施方案中，多肽是胰高血糖素樣肽。
在本發(fā)明的一個實施方案中，胰高血糖素樣肽是DDP-IV保護的胰高血糖素樣 肽。
在本發(fā)明的一個實施方案中，胰高血糖素樣肽是血漿穩(wěn)定的胰高血糖素樣肽。
在本發(fā)明的一個實施方案中，胰高血糖素樣肽具有賴氨酸殘基，例如一個賴氨 酸，其中親脂取代基任選經(jīng)由間隔物與所述賴氨酸的ε氨基附著。
在一個實施方案中，親脂取代基包括?；鶊F。酰基基團具有式R(C = 0)_。
在本發(fā)明的一個實施方案中，親脂取代基具有8-40個碳原子，優(yōu)選8-M個碳原 子，例如12-18個碳原子。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包括親脂取代基的胰高血糖素樣肽的衍生 物，其中所述親脂取代基包括直鏈或分支烷烴α，ω-二羧酸。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)上述實施方案的胰高血糖素樣肽，其 中親脂取代基是或包括選自下述的部分CH3-(CH2)n-CO_、(COOH)-(CH2)n-CO_、 (COOH)-(CH2)n-CO-NH-(CH2) m-R-CO_、(NH2-CO)-(CH2)n-CO-禾口 HO-(CH2) n-CO-；其中R是選自環(huán)戊基、環(huán)己基和環(huán)庚基的環(huán)烷基，4《n《38和0《m《4。
在一個實施方案中，12《n《36。在一個實施方案中，12《n《20。
在一個實施方案中，親脂取代基選自CH3-(CH2)n-CO_、(COOH)-(CH2) n-CO_、(COOH)-(CH2)n-CO-NH-(CH2) m-R-CO_、(NH2-CO) _ (CH2) n-CO_、 HO-(CH2)n-CO-；其中R是選自環(huán)戊基、環(huán)己基和環(huán)庚基的環(huán)烷基，4《n《38和l《m《4。
在一個實施方案中，親脂取代基選自CH3-(CH2)n-CO_、(COOH)-(CH2) n-CO_、(COOH)-(CH2)n-CO-NH-(CH2) m-R-CO_、(NH2-CO) _ (CH2) n-CO_、 HO-(CH2)n-CO-；其中 R 是環(huán)己基，12<n<20 和 l<m<20
一個或更多個親脂取代基可以直接或經(jīng)由合適間隔物與活性組分連接。在一個 實施方案中，親脂組分經(jīng)由合適間隔物附著。
在一個實施方案中，間隔物存在并且包括至少一個氨基酸殘基。
在本發(fā)明的一個實施方案中，間隔物存在并且選自氨基酸，例如β-Ala、L-Glu 或氨基丁?；?br> 在一個實施方案中，間隔物存在并且選自Y-或α-谷氨酰接頭、β-或α-天 冬氨酰接頭、α-酰氨基-Υ-谷氨酰接頭、或α-酰氨基-β-天冬氨酰接頭、或其組I=I O
在一個實施方案中，間隔物具有通式I
權(quán)利要求
1.一種用于純化通過固相肽合成制備的肽的方法，其包括使通過固相肽合成制備的 肽的粗提取物與固體載體接觸的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述固相肽合成包括使用Fmoc作為氨基末端保護基團。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述方法包括用于從所述粗肽提取物中去除二苯 富烯的方法。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中所述固體載體包括包含熱塑性聚合物的包 裝材料。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述固體載體選自容器、粒狀物、顆粒物和漏斗架。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的方法，其中所述熱塑性聚合物是聚乙烯或聚丙烯。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一項的方法，其包括下述步驟(a)將得自固相合成的所述粗肽提取物加入所述包裝材料中；(b)使所述提取物在所述包裝材料中溫育；(c)從所述包裝材料中取出所述提取物；和(d)對所述提取物實施標準肽分離。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中在步驟(d)中的所述標準肽分離是離子交換層析。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中所述固體載體包括離子交換層析柱。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中所述固體載體包括陰離子交換層析柱。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10中任一項的方法，其包括下述步驟(a)在標準層析條件下，用得自固相合成的所述粗肽提取物或得自權(quán)利要求7的方法 中步驟(a)-(c)的肽裝載所述離子交換層析柱；(b)用醇執(zhí)行第一個洗脫步驟；和(c)用一種或更多種緩沖劑執(zhí)行第二個洗脫步驟。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中在步驟(C)中使用的緩沖劑包括Tris(三(羥甲基) 甲胺)、TAPS(3-{[三(羥甲基)甲基]氨基}丙磺酸、BiCine(N，N-二(2-羥乙基)甘 氨酸)、Tricine (N-三(羥甲基)甲基甘氨酸)、HEPES (4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸)、 TES (2-{[三(羥甲基)甲基]氨基}乙磺酸、MOPS (3-(N-嗎啉代)丙磺酸、PIPES (哌 嗪-N，N'-雙(2-乙磺酸))、Cacodylate ( 二甲基胂酸鹽)、MES (2- (N-嗎啉代)乙 磺酸)或乙酸鹽。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12中任一項的方法，其中在步驟(b)中使用的所述醇是CV5
14.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的方法，其中所述多肽是胰高血糖素樣肽。
15.一種肽，其通過權(quán)利要求1-14中任一項中描述的方法獲得。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于純化已通過固相肽合成制備的肽的有效方法。本發(fā)明還包括的是包括用于所述方法的試劑的試劑盒和通過所述方法獲得的純化肽。
文檔編號C07K14/435GK102027005SQ200980116943
公開日2011年4月20日 申請日期2009年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月15日
發(fā)明者C·科恩貝克, T·B·漢森 申請人:諾沃-諾迪斯克有限公司