專利名稱：斑點金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的ccp肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎抗體的CCP肽，尤其涉及一種斑點金免疫滲 濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的CCP肽，實現(xiàn)對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的快速、準(zhǔn)確 檢測。
背景技術(shù)：
臨床上自身免疫疾病主要有系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、皮 肌炎、多發(fā)性肌炎、系統(tǒng)(多發(fā))性硬化癥、硬皮病等，這些疾病曾被命名為“結(jié)締組織 病”，后來國外和國內(nèi)均將它們歸為風(fēng)濕性疾病。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種較常見的以慢性多關(guān)節(jié)炎癥為主
要表現(xiàn)的系統(tǒng)性自身免疫疾病，其病程長，多反復(fù)，且會造成組織不可逆的損傷，而給 患者造成很大痛苦。該病的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)為0.5-1%，中國的發(fā)病率約為0.36%。 患者發(fā)病年齡多在20 50歲，女性多于男性，男女之比為1 3。最近流行病學(xué)統(tǒng)計， 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有逐年增加的趨勢，其突出的早期臨床表現(xiàn)為對稱性關(guān)節(jié)紅腫熱痛、常見 四肢小關(guān)節(jié)、指間近端關(guān)節(jié)腫脹、掌指、腕、肘和踝等關(guān)節(jié)腫痛及活動困難、晨間關(guān)節(jié) 僵硬、午后逐漸減輕、關(guān)節(jié)外癥狀約有20%患者可出現(xiàn)皮下結(jié)節(jié)；長久不愈的晚期癥狀 則有不同程度的關(guān)節(jié)畸形和強直，以及關(guān)節(jié)功能喪失等現(xiàn)象，還會損傷臟器和多組織器 官，造成骨頭缺血性壞死，對人體消耗大，致殘率高。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病因至今尚不十分清楚，且早期臨床表現(xiàn)也不典型。在 國內(nèi)外臨床實踐中，該疾病的常用診斷工具是美國風(fēng)濕學(xué)學(xué)會(American College of Rheumatology, ACR)在 1987 年制定的類風(fēng)濕分類標(biāo)準(zhǔn)(Arthritis Rheum 1988，31， 315-324)，該標(biāo)準(zhǔn)更依賴于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎所表現(xiàn)出的臨床病癥。但是，在該疾病早 期，這些臨床指標(biāo)通常是不易操作的。因此，目前普遍認(rèn)為這一標(biāo)準(zhǔn)不能較好適應(yīng)于 早期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷(Arthritis Rheum 2001，44，2485-2491 ； Neth J Med 2002， 60，383-388)。而目前使用的治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的方法主要是采用消炎方法，這種方 法雖能使得關(guān)節(jié)腫脹(swelling)和侵蝕(erosive)的程度得以減慢，卻無法使疾病得到治 愈。當(dāng)前人們共同的觀點認(rèn)為，在該疾病早期采用多種方法治療能得到最佳的治療效果 (Autoimmunity Reviews2006, 6，37-41)。由此，具有高專一性(Specificity)和高靈敏度 (Sensitivity)的血清學(xué)檢測標(biāo)記對于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎在骨關(guān)節(jié)遭受損傷之前的早期診斷就顯 得尤為必要(ClinApplied Immunol Rev 2004，4，239-362)。研究發(fā)現(xiàn)一些自身免疫抗體雖然與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病相聯(lián)系，如抗 calpastatin 抗體(Proc Natl Acad Sci USA 1995，92，7267-7271)、抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì) 抗 體(anti-neutrophil cytoplasmic antibodies, ANCA) (IntArchAllergy Immunol 1996, 109，201-206)、核抗原抗體(anti-nuclear antigens, ANA) (Scand J Rheumatol 1986， 15，185-192)、抗 II 型膠原抗體(anti-collagen type II) (J Immunol Methods 2001，247， 191-203)和抗葡萄糖 6 磷酸異構(gòu)酶(anti-glucose-6_phosphate isomerase, anti-GPI) (NatImmunol 2001, 2，746-753)等也都能在患有其它自身免疫疾病的病人中，甚至于在健康 個體中檢測出來(Clin Applied ImmunolRev 2004，4，239-262)。其中的某些抗體雖然 能應(yīng)用于風(fēng)濕性疾病的識別，而且篩選這些抗體也有助于疾病監(jiān)測和預(yù)測，但由于其對 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎缺乏專一性，這些抗體中的絕大多數(shù)都很少應(yīng)用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎早期診斷 (Clinica ChimicaActa 2004，350，17-34)。對于 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎早期診斷的理想標(biāo)記(Marker)應(yīng)當(dāng)至少滿足4個標(biāo)準(zhǔn)(1)高 靈敏度，能檢測的病人達(dá)到高百分比；(2)高專一性，盡可能地限制錯誤陽性結(jié)果的發(fā) 生；(3)能適用于早期診斷；(4)能預(yù)見到某些病人會發(fā)展成侵蝕性疾病(erosive disease) (AutoimmunityReviews 2006，6，37-41; MEDICINE 2006，34，441-444)。類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor，RF)抗體作為血清學(xué)檢測方法應(yīng)用于ACR標(biāo) 準(zhǔn)中，被公認(rèn)為是IgG分子上Fc結(jié)構(gòu)域的直接抗體。雖然其檢測靈敏度范圍可以達(dá)到 60-80%,但其對于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的專一性也比較一般，為60%。此外，RF同樣可以在 其它患有自身免疫疾病的病人中、患有感染性疾病的病人中以及3-5%健康人群中(其中 10-30% 的老年人)檢測到(AnnRheumDis 2003，62，261-263)?？笲iP(p68)抗體，抗Sa抗體和抗環(huán)狀胍氨酸化蛋白抗體(APF、AKA、抗 filaggrin和抗CCP)則對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有更高的專一性。64%的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人能產(chǎn) 生直接針對BiP的抗體，還有報道稱其對該疾病具有高度的專一性，但目前沒有數(shù)據(jù)支 持BiP在預(yù)測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎方面具有作用，而且這些報道的BiP抗體還需要等待進一步通 過獨立的臨床研究加以確認(rèn)(Clinica Chimica Acta 2004，350，17-34)?？筍a抗體是源 自于人脾臟和胎盤的提取物當(dāng)中，分子量為50kDa的蛋白(Internal Medicine 2005，44， 1122-1126)。另有研究揭示Sa抗原對于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的專一性可以高達(dá)92-99%，但其 靈敏度則顯得一般，僅為 30-40% (J Rheumatol 1994，21，1027-33 ； J Rheumatol 1999, 26， 7-13)?？购酥芤蜃?antiperinuclear factor, APF)首次披露于1964年。經(jīng)研究這些自身 免疫抗體對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有專一性，并能通過以人頰粘膜細(xì)胞為抗原底物的免疫熒光 法間接測得(AnnRheumDis 1964，23，302-305)。1979年研究者描述了一種類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎專一性角質(zhì)蛋白抗體，它能直接抑 制角質(zhì)層上皮細(xì)胞角質(zhì)化，并將這類抗體的名稱暫定為抗角質(zhì)蛋白抗體(anti-keratin andtibody, AKA) (BMJ 1979，2，97-99)。之后的研究證實，雖然 AKA 和 APF 的發(fā)現(xiàn)是互相獨立的，但是兩者所直接對應(yīng)的抗原是一致的(J.ClinJnvest 1995， 95，2672-2679)。 許多研究進一步表明AKA和APF具有許多共同的特性，它們 均對于RA患者表現(xiàn)出高度的專一性(Internal Medicine 2005，44，1122-1126)。 Filaggrin(filamentaggregating protein)是一種互相交聯(lián)的角蛋白絲狀體，作用是形成非常 堅固的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，其也是AKA和APF的常見抗原(ClinAppliedImmunol Rev 2004， 4，239-262)。其中，APF 的目標(biāo)抗原為 profilaggrin，而 AKA 的抗原為 filaggrin (J Clin Invest 1995，95，2672-2679)。雖然AKA和APF對于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有專一性，但其缺陷也很突出。這兩種 抗體的檢測靈敏度嚴(yán)重依賴于filaggrin的純化方法。實踐中，由于難以分離得到純的且 胍基含量具有可重復(fù)性的抗原，再加上其檢測手段不簡便，以及熒光免疫檢測過程需要耗費較大的工作量，從而使得實驗室間難以形成標(biāo)準(zhǔn)化，導(dǎo)致AKA和APF沒有成為類風(fēng) 濕關(guān)節(jié)炎檢測的主流方法(ClinApplied Immunol Rev 2004，4，239-262)。 基于filaggrin和profilaggrin是AKA和APF抗體靶點的知識，人們合成了含 有瓜氨酸的多肽以檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎血清中AKA和APF抗體的活性。由于瓜氨酸不 是基本氨基酸而無法在蛋白質(zhì)翻譯中加入，因此通常的方法是通過肽精氨酸脫亞胺酶 (peptidylargnine deiminine, PAD, EC3.5.3.15)催化精氨酸殘基脫氨基得到。根據(jù)這些 事實，一些從filaggrin序列中衍生出來的精氨酸側(cè)鏈經(jīng)修飾的，尤其是含有瓜氨酸的多肽 被合成出來，并用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎抗體的體外檢測(US6,858,438)。在用酶聯(lián)免疫吸附 (Enzyme-Linked immunosorbent Assay, ELISA)方法檢測實驗中，這一方法合成的含有瓜 氨酸直線性多肽能從類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清中檢測出抗瓜氨酸肽抗體，在保持高專一性 (大于90%)的情況下，還大大提高了檢測的靈敏度(達(dá)到63%)。實驗還證明，只有 含瓜氨酸的多肽才能實現(xiàn)該反應(yīng)，若將多肽中的瓜氨酸用其它氨基酸代替則完全沒有反 應(yīng)發(fā)生。這些結(jié)果表明，瓜氨酸部分是決定能被AKA和APF抗體識別的抗原決定因子 (J Clin Invest 1998, 101，273-281)。其它研究者發(fā)現(xiàn)將含有瓜氨酸的直線性多肽通過二硫鍵(S-S鍵)形成環(huán)形 結(jié)構(gòu)的方式能模擬類似轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，從而模仿最初抗原決定簇的轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)， 并可增加多肽-抗體的親和力(FASEBJ 1995，9，37-42 ； Mol Immunol 1985，22， 1255-1264)。由此，一種環(huán)狀肽被人工合成出來，其將filaggrin主要表位上的兩個絲氨 酸換成半胱氨酸后，再由二硫鍵環(huán)化形成，即第一代環(huán)瓜氨酸肽(the first generation cyclic citrullinatedpeptide, CCP1) (Internal Medicine 2005, 44，1122-1126)。研究者將一條由 19 個氨基酸殘基組成的瓜氨酸肽中兩個絲氨酸替換為半胱氨酸形成與β-轉(zhuǎn)角具有相似結(jié) 構(gòu)的二硫鍵，得到人工合成CCP，并將CCPl與直線肽的檢測結(jié)果作了比較。結(jié)果顯示， 采用CCPl為抗原的多肽用ELISA法檢測RA患者的抗CCP抗體，靈敏度較用直線性瓜 氨酸肽為抗原有顯著提高，分別為68%和49%，二者專一性相似(Arthritis Rheum2000， 43，155-63)。穆榮等人在266例RA患者和186例對照者血清中檢測RF和AKA抗體、 APF和抗CCP抗體的方式，評估了抗聚絲蛋白抗體群(anti-filaggrin antibodies，AFAs)與 RF聯(lián)合檢測的意義。由于AKA和APF的敏感性太低，臨床上以RF和抗CCP抗體的 聯(lián)合測定更為實用(北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)2005，37，894)。研究還發(fā)現(xiàn)，通過檢測 抗CCP抗體還能作為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎早期病人一項重要指標(biāo)，為這類人群的早期防治提供 參考(JIndia Rheumatol Assoc 2004，12，143-146)，其還能預(yù)測侵蝕性疾病(Clin Applied Immunol Rev 2004, 4，239-262)。在含有不同瓜氨酸多肽的反應(yīng)模式中，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎血清檢測表現(xiàn)出巨大的可 變性。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的血清/血漿中除了 filaggrin精氨酸殘基被瓜氨酸化外，Sa抗 原、膠原蛋白(I和II型)、組蛋白、髓磷脂堿蛋白、纖維連接蛋白等也出現(xiàn)瓜氨酸化，并 產(chǎn)生抗CCP抗體。深入研究表明，瓜氨酸化的自身抗原中并非所有精氨酸脫氨基轉(zhuǎn)化為 瓜氨酸；已瓜氨酸化的瓜氨酸也不完全參與形成抗原表位，即產(chǎn)生抗CCP抗體。綜上， 抗瓜氨酸抗體的產(chǎn)生與瓜氨酸密切相關(guān)，并且瓜氨酸的側(cè)翼序列對抗瓜氨酸抗體的產(chǎn)生 起重要作用，這一事實暗示著瓜氨酸殘基的周邊氨基酸對于抗原表位(antigen episode)具 有重要作用，以及抗瓜氨酸化蛋白(如AKA和APF抗體)活性是多克隆反應(yīng)(JClinInvest 1998, 101，273-281)。基于filaggrin的屬性，它被認(rèn)為是模擬瓜氨酸抗原表位的 天然庫藏(ClinAppliedImmunolRev 2004，4，239-262)。第二代CCP(CCP2)檢測方法產(chǎn)生于2002年，通過將含有瓜氨酸的多肽庫與類 風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎血清篩選得到與filaggrin無關(guān)的第二代CCP，其具有更有利于抗體檢測的表位 (Report on the 5th Dresden symposium onautoantibodies.Lengerich, Germany Pabst Science Publishers ； 2000.ρ.140-145)。將CCPl和CCP2經(jīng)同一組病人測試后表明，CCP2不僅保 持了較高專一性(96%)，而且其分析靈敏度也有顯著的提高(Ann.Rheum.Dis.2005，64， 1510-1512)。許多研究者在最近5年的研究證明，抗含瓜氨酸多肽的測試的靈敏度具有 較高的可變性，范圍在 40%-94% (Clin.Exp Rheumatol.2005，23 (Suppl39)，569-576 ； Ann.Rheum.Dis.2006，65，845-851)。CCP2在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體體外檢測中得 到應(yīng)用說明了在該領(lǐng)域的檢測抗原的篩選并不需要僅僅依賴filaggrin，也說明與filaggrin 不同的結(jié)合表位能更有利于體外檢測。Bizzaro N 等人(Clin Chem 2007，53，1527-1533)和 Lutteri L 等人(Clinica ChimicaActa 2007，386，76-81)分別針對現(xiàn)在市場上使用的第二代和第三代CCP試劑盒 (Kit)進行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，伊諾瓦診斷(InovaDiagnostics)公司開發(fā)的三種檢測方法 中，其CCP3試劑盒與使用CCP2為抗原的方法相比僅僅略有改善，各自的靈敏度分別為 67%和64%。相反地，用于抗IgG的CCP3.0與即能檢測IgG又能檢測IgA的CCP3.1的 檢測方法相比后發(fā)現(xiàn)，兩者竟然沒有絲毫差別?？梢姡瑫r檢測IgG和IgA抗體的方法 并沒有象看上去那樣有顯著改進。他們的結(jié)論是由于測試的診斷試劑盒靈敏度可能與胍 基化精氨酸殘基的位置和數(shù)量有關(guān)，而專一性則可能受到蛋白質(zhì)或雜多肽序列的影響， 因此，對此二者而言，抗原的種類顯得更為重要。兩者綜合考慮，實驗數(shù)據(jù)表明抗原的 制備是決定測定方法優(yōu)劣的最重要的可變因素。Lutteri L 等人(Clinica ChimicaActa 2007，386，76-81)的研究還發(fā)現(xiàn)了抗 CCP
的另一個價值，他們指出，IgM-RF是最靈敏的標(biāo)記，能在77.9%的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中 發(fā)現(xiàn)。必須注意的是，作為ACR標(biāo)準(zhǔn)中的RF，其類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷中靈敏度不能直接 與那些沒有包括在診斷標(biāo)準(zhǔn)中的其它方法相比較。IgM-RF被認(rèn)為在疾病專一性方面略 有欠缺。使用IgM-RF檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者，其中有13-19%的人為RF陰性，與之相 比，當(dāng)這些患者使用抗CCP方法檢測時均為陽性。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的遺傳因素會影響瓜氨酸化蛋白的出現(xiàn)和產(chǎn)生，也會影響針對 這些修飾蛋白的抗體產(chǎn)物(ClinicaChimicaActa 2004，350，17-34)。一系列相關(guān)研究 表明，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎與某些HLA-DR等位基因有密切聯(lián)系，尤其是HLA_DRB1*0401 和HLA-DRBl*0404(Cell 1996，85，307-310)。 與相應(yīng)的含有精氨酸的多肽相比， 將多肽瓜氨酸化就能與HLA_DRB1*0401和HLA_DRB1*0404兩種“袋形”抗原更好 地結(jié)合(J India Rheumatol Assoc 2004，12，143-146)。 在不 同地區(qū)的人群中，這些等 位基因也略有不同。DRB1*0401主要出現(xiàn)在北歐和北美地區(qū)的人群中，有證據(jù)表明 該基因與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎所導(dǎo)致的“特大關(guān)節(jié)”表征(extraarticular manifestations)有聯(lián) 系，在 DRB1*0401/DRB1*0404 雜合基因型中尤為突出。DRB1*0403、DRB 1*0406 和 DRB1*0407與DRB1*0401、*0404或*0101基因組合后會增加類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病情的發(fā)展 可能。DRB1*0404與DRB1*0408只要存在于白色人種中。DRB1*0405很少在北歐人群中，但在亞洲和環(huán)地中海沿岸國家的人群中極其普遍。DRB1*0101主要存在于北歐 和北美人群中。美洲印第安人群中則為DRB1*1402和*1406(Hum Immuno 2000, 61， 1254-1261)。雖然這些與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)的基因在各地區(qū)人群中各有不同，但研究發(fā) 現(xiàn)在DRBl的第三高度可變區(qū)(HV3)具有共享表位(shared epitope，SE)，在70-74位氨 基酸殘基都為 QKRAA、QRRAA 或 RRRAA (ClinicaChimica Acta 2004，350，17-34)。
將一群有幾個共享表位基因型的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者與具有抗CCP2抗體的患者比 較研究表明，一種共享表位等位基因與抗CCP2抗體的產(chǎn)生具有密切的內(nèi)在聯(lián)系(Arthritis Rheum 2000, 50，2113-2121; Arthritis ResTher 2004，6，R303-8)。經(jīng)證實，這一關(guān)聯(lián) 是由于MHC分子共享表位β鏈的70-74位氨基酸殘基(Q/R，K/R，R，Α，Α)形成 第4個錨定袋(Ρ4)，其與電中性或負(fù)電荷氨基酸具有高度親和性(JImmun0 2003，171， 538-541)。當(dāng)帶正電荷精氨酸在PAD酶作用下轉(zhuǎn)換成電中性的瓜氨酸后，得到的翻譯 后修飾蛋白/多肽親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于精氨酸與P4的親和力，并能夠激活CD4+T細(xì)胞，這 些“瓜氨酸特異T細(xì)胞”可有助于抗瓜氨酸蛋白(多肽)抗體的產(chǎn)生(JImmun0 2003， 171，538-541 ； Arthritis Rheuml987, 30，1205-1213Rheum Dis Clin North Am 1992, 18，741-759 ； Arthritis Rheum 2005, 52，1063-1068)。這些結(jié)果表明具有共享表位的 DBRl等位基因能激活類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者自身免疫反應(yīng)。綜合目前的研究結(jié)果，抗CCP抗體對RA具有較高的專一性，能將RA與其它 與RA相似的疾病相區(qū)分，這類抗體存在于絕大多數(shù)的病人體內(nèi)，在疾病的早期就能檢測 至IJ，有助于對疾病的預(yù)測，能通過簡單的方式加以檢測(JlndiaRheumatolAssoc 2004， 12， 143-146)。將CCP肽用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的體外ELISA檢測已得到廣泛研究，也有諸多商業(yè) 化的檢測試劑盒。單次ELISA檢測通常需要較大的樣本數(shù)，檢測所用的時間也較長，其 檢測過程還需要專業(yè)的人員進行操作，對醫(yī)療機構(gòu)的依賴度較大，從而不利于普通病患 對病程的自助監(jiān)測。膠體金金標(biāo)側(cè)向?qū)游龇ㄔ陬愶L(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體檢測中也有應(yīng)用，該方法利用 毛細(xì)現(xiàn)象使檢測樣品依次流過標(biāo)記物、檢測區(qū)和控制區(qū)。由于在整個檢測過程中，待測 抗體分子與標(biāo)記抗體/抗原的結(jié)合始終處于吸附和脫附的過程當(dāng)中，在實際應(yīng)用當(dāng)中， 其檢測靈敏度受到所用檢測膜的影響，不利于產(chǎn)品的大規(guī)模臨床應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種斑點金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的 CCP肽，包括CCP肽組合物、與CCP肽結(jié)合的高分子聚合物、微孔濾膜和吸水介質(zhì)，實 現(xiàn)對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的快速、準(zhǔn)確檢測。本發(fā)明所述的CCP肽組合物，包含CCP肽I、CCP肽II和CCP肽III，以任意
摩爾比共價或非共價結(jié)合于高分子聚合物。CCP肽I從N端至C端包含如下氨基酸序列His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xa a3 _Xaa4_ Arg-Gly-Arg_Xaa5 _Xaa6 _Xaa7 _Xaa8-Cys-Gly,其中，Xaal為 His 或 Ala ； Xaa2 為 Gln 或 Arg ； Xaa3 為 Arg 或 Gln ； Xaa4 為 Phe 或 Met ； Xaa5 為 Ser 或 Arg ； Xaa6 為 Arg 或 Leu ； Xaa7 為 Ala 或 Ile ； Xaa8 為 Ala 或Arg,其中至少有兩個精氨酸側(cè)鏈被修飾。CCP肽II從N端 至C端包含如下氨基酸序列His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe_X aa3 _Xaa4-Arg-Hi s-Arg_Xaa5 _Xaa6 _Xaa7 _Xaa8-Cys-Gly,其中，Xaal為 His 或 Ala ； Xaa2 為 Gln 或 Arg ； Xaa3 為 Arg 或 Gln ； Xaa4 為 Phe 或 Met ； Xaa5 為 Ser 或 Arg ； Xaa6 為 Arg 或 Leu ； Xaa7 為 Ala 或 Ile ； Xaa8 為 Ala 或 Arg,其中至少有兩個精氨酸側(cè)鏈被修飾。CCP肽III從N端至C端包含如下氨基酸序列His-Gln-Cys-Xaa 1-Xaa2-Phe-X aa3 _Xaa4_Xaa5 _Xaa6 _Xaa7 _Xaa8 _Xaa9 -Xaa 10 -Xaa 11-Cys-Gly,其中，Xaal為 His 或 Ala ； Xaa2 為 Gln 或 Arg ； Xaa3 為 Arg 或 Gln ； Xaa4 為 Phe 或 Met ； Xaa5 為 Arg ； Xaa6 為 Gly 或 His ； Xaa7 為 Arg ； Xaa8 為 Ser 或 Arg ； Xaa9 為Arg或Leu; XaalO為Ala或Ile ； Xaall為Ala或Arg，其中有一個精氨酸側(cè)鏈被修飾。在所述CCP肽序列當(dāng)中至少有一個精氨酸側(cè)鏈被修飾，修飾的精氨酸側(cè)鏈具有 式I所示的結(jié)構(gòu)，
權(quán)利要求
1.一種斑點金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的CCP肽，包括CCP肽組合 物、高分子聚合物、微孔濾膜、吸水介質(zhì)和載體介質(zhì)；其中，CCP肽組合物包含CCP肽 I、肽II和肽III，以任意摩爾比共價或非共價結(jié)合于高分子聚合物；所述高分子聚合物通 過共價鍵或非共價鍵結(jié)合于微孔濾膜上；CCP肽I從N端至C端包含如下氨基酸序列His-Gln-Cys-Xaa卜Xaa2-Phe-Xaa3-X aa4_ Arg-Gly-Arg_Xaa5 _Xaa6 _Xaa7 _Xaa8-Cys-Gly,其中，Xaal 為 His 或 Ala ； Xaa2 為 Gln 或 Arg ； Xaa3 為 Arg 或 Gln ； Xaa4 為 Phe 或 Met ； Xaa5 為 Ser 或 Arg ； Xaa6 為 Arg 或 Leu ； Xaa7 為 Ala 或 Ile ； Xaa8 為 Ala 或 Arg, 其中至少有兩個精氨酸側(cè)鏈被修飾；CCP肽II從N端至C端包含如下氨基酸序列His-Gln-Cys-Xaa卜Xaa2-Phe-Xaa3-X aa4_ Arg-Hi S-Arg_Xaa5 _Xaa6 _Xaa7 _Xaa8-Cys-Gly,其中，Xaal 為 His 或 Ala ； Xaa2 為 Gln 或 Arg ； Xaa3 為 Arg 或 Gln ； Xaa4 為 Phe 或 Met ； Xaa5 為 Ser 或 Arg ； Xaa6 為 Arg 或 Leu ； Xaa7 為 Ala 或 Ile ； Xaa8 為 Ala 或 Arg, 其中至少有兩個精氨酸側(cè)鏈被修飾；CCP肽III從N端至C端包含如下氨基酸序列His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4_Xaa5 _Xaa6 _Xaa7 _Xaa8 _Xaa9 -Xaa 10 -Xaa 11-Cys-Gly,其中，Xaal 為 His 或 Ala ； Xaa2 為 Gln 或 Arg ； Xaa3 為 Arg 或 Gln ； Xaa4 為 Phe 或 Met ； Xaa5 為 Arg ； Xaa6 為 Gly 或 His ； Xaa7 為 Arg ； Xaa8 為 Ser 或 Arg ； Xaa9 為 Arg 或Leu ； XaalO為Ala或Ile ； Xaall為Ala或Arg，其中有一個精氨酸側(cè)鏈被修飾。
2.一種斑點金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的CCP肽，包括CCP肽組合 物、高分子聚合物、微孔濾膜、吸水介質(zhì)和載體介質(zhì)；其中，CCP肽組合物包含CCP肽 I、肽II和肽III，以任意摩爾比共價或非共價結(jié)合于高分子聚合物；所述高分子聚合物通 過共價鍵或非共價鍵結(jié)合于微孔濾膜上；CCP肽I從N端至C端包含如下氨基酸序列His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Arg-Phe-X aa-Gly-Xaa-Ser-Arg-Ala-Ala-Cys-Gly,其中，Xaa 為修飾的 Arg;CCP肽II從N端至C端包含如下氨基酸序列His-Gln-Cys-Ala-Arg-Phe-Gln-Met-Xaa-His-Xaa-Arg-Leu-Ile-Arg-Cys-Gly，其中，Xaa 為修飾的 Arg;CCP肽III從N端至C端包含如下氨基酸序列His-Gln-Cys-Ala-Arg-Phe-Gln-Met -Arg-His-Xaa-Arg-Leu-Ile-Arg-Cys-Gly，其中，Xaa 為修飾的 Arg。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的斑點金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的CCP肽， 其特征在于所述側(cè)鏈被修飾的精氨酸，其側(cè)鏈具有式I所示的結(jié)構(gòu)，其中 Gl 為 O、NH 或 CH2; G2 為 NH2、CH3> NHCH3 或 N (CH3) 2 ； G3 為 O、NH> NHCH3 或 NHCH3 ； η 為 2、3 或 4 ；當(dāng) Gl 為 NH，G2 為 NH2 時，G3 為 O、NHCH3 或CH2Jn？ 1 式INHCH3O
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的斑點金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的CCP肽， 其特征在于所述精氨酸側(cè)鏈被修飾后，成為瓜氨酸殘基。
5.一種斑點金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的CCP肽，包括CCP肽組合 物、高分子聚合物、微孔濾膜、吸水介質(zhì)和載體介質(zhì)；其中，CCP肽組合物包含CCP肽 I、肽II和肽III，以摩爾比1 1 1共價或非共價結(jié)合于高分子聚合物；高分子聚合物 通過共價鍵或非共價鍵結(jié)合于微孔濾膜上；CCP肽I從N端至C端包含如下氨基酸序列His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Arg-Phe-C it-Gly-Cit-Ser-Arg-Ala-Ala-Cys-Gly ；CCP肽II從N端至C端包含如下氨基酸序列His-Gln-Cys-Ala-Arg-Phe-Gln-Met-Cit-His-Cit-Arg-Leu-Ile-Arg-Cys-Gly ；CCP肽III從N端至C端包含如下氨基酸序列His-Gln-Cys-Ala-Arg-Phe-Gln-Met -Arg-His-Cit-Arg-Leu-Ile-Arg-Cys-Gly。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一所述的斑點金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的CCP 肽，其特征在于所述微孔濾膜上結(jié)合的CCP肽聚合物含量為50 μ g-300 μ g/cm3。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一所述的斑點金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的CCP 肽，其特征在于所述微孔濾膜上結(jié)合的CCP肽聚合物含量為50 μ g-150 μ g/cm3。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一所述的斑點金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的CCP 肽，其特征在于所述高分子聚合物分子量大于2,000Da。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一所述的斑點金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的CCP 肽，其特征在于所述高分子聚合物選自于牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋 白、雞卵清白蛋白、鑰孔血藍(lán)蛋白、分叉型聚合物、聚賴氨酸、聚乙二醇、親和素或抗 體。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一所述的斑點金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的 CCP肽，其特征在于所述CCP肽與高分子聚合物之間的共價鍵選自于酰胺鍵、尿鍵、酯 鍵、硫醚鍵、腙鍵、肟鍵或二硫鍵。
全文摘要
一種斑點金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的CCP肽，包括CCP肽組合物、高分子聚合物、微孔濾膜、吸水介質(zhì)和載體介質(zhì)，高分子聚合物通過共價或非共價形式結(jié)合于微孔濾膜上。其中，CCP肽組合物包含CCP肽I、肽II和肽III，且與高分子聚合物共價或非共價結(jié)合。該組合物不僅能夠?qū)崿F(xiàn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的快速體外檢測，而且便于患者自助診斷，并為及時了解病情發(fā)展提供參考。
文檔編號C07K7/08GK102012431SQ20091019514
公開日2011年4月13日 申請日期2009年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月4日
發(fā)明者朱紹榮 申請人:上海榮盛生物藥業(yè)有限公司