專利名稱：：一種用于提高白喉類毒素純度的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于提高白喉類毒素純度的工藝，屬生物醫(yī)藥制造領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：白喉是急性呼吸道傳染病，白喉?xiàng)U菌侵入人體后在鼻咽部生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致局部炎癥及組織壞死并產(chǎn)生外毒素(分子量為62000蛋白質(zhì)，為一多肽鏈)，咽喉部的壞死組織形成灰白色假膜并繼續(xù)蔓延而引起呼吸障礙甚至窒息。外毒素可致心肌、神經(jīng)系統(tǒng)、肝、腎及腎上腺等器官受損，出現(xiàn)全身中毒癥狀。白喉類毒素可使白喉流行得到有效控制。國(guó)內(nèi)原生產(chǎn)白喉類毒素，白喉疫苗的廠家為中國(guó)生物制品集團(tuán)公司下屬的六大生物制品研究所，其工藝如下-固體培養(yǎng)基傳代一液體培養(yǎng)基發(fā)酵罐培養(yǎng)一離心去菌體一一段鹽析一二段鹽析一超濾脫鹽一除菌過濾一脫毒一原液檢定保存一半成品配制一成品工藝闡述(l')菌種制備將白喉38007菌種開啟并接種于呂氏血清斜面培養(yǎng)基上，34。C35。C孵箱培養(yǎng)16小時(shí)~24小時(shí)，再由血清斜面?zhèn)饔邳S氏馬丁肉湯(或改良林氏肉湯)培養(yǎng)基種子管，34'C35'C培養(yǎng)16小時(shí)~24小時(shí)為第二代，如此循環(huán)由黃氏馬丁肉湯傳至黃氏馬丁肉湯第二代，鏡檢合格者傳于IOL瓶，34°C—35'C培養(yǎng)48小時(shí)。(2)大罐培養(yǎng)(培養(yǎng)基主要為肉源胰酶消化液)毒素培養(yǎng)以抽樣3次，6小時(shí)內(nèi)絮狀單位不上升為停止培養(yǎng)指標(biāo)。用于生產(chǎn)的毒素不得低于150Lf/ml。(3)殺菌將培養(yǎng)液冷卻至28。C以下，按培養(yǎng)基的0.1%-0.15%加入甲醛溶液。(4)一段鹽析(去除大分子雜蛋白)離心機(jī)去除菌體，經(jīng)濃縮，加入23%(W/V)晶體硫酸銨、1%(W/V)活性炭，然后加入0.5%(W/V)碳酸氫鈉。收集上清。(5)二段鹽析(去除小分子雜蛋白)緩慢加入22%(W/V)晶體硫酸銨，收集沉淀用無菌的0.1%碳酸氫鈉溶液浸泡沉淀。用無菌的0.1%碳酸氫鈉(NaHC03)溶液分次溶解、洗滌沉淀，送超過濾脫鹽。(6)超濾脫鹽將精制毒素溶液泵入超過濾系統(tǒng)，直至測(cè)定樣品硫酸銨含量低于千分之一即可收集脫鹽后精制白喉毒素液。(7)除菌過濾用除菌過濾膜除菌過濾。(S)脫毒精制白喉毒素按0.5%計(jì)算加入福爾馬林溶液(按40%計(jì)算)及適量的10。/。L-賴氨酸溶液放置室溫2天-3天，每日振搖一次，然后放入36-C-37'C恒溫室，進(jìn)行脫毒。(9)精制類毒素原液檢定毒性逆轉(zhuǎn)試驗(yàn)，理化性狀，無菌試驗(yàn)，Lf值測(cè)定，純度，特異性毒性試驗(yàn)。保存與效期保存于2-8t:冷庫(kù)中，效期自脫毒合格之日起為3年半。其不足之處雖然，國(guó)內(nèi)已有吸附白喉疫苗、DTP、DtaP、吸附白破二聯(lián)疫苗上市，但其生產(chǎn)過程中由于工藝的限制，成人免疫時(shí)有嚴(yán)重的不良反應(yīng)，Pappenheimer認(rèn)為，可能是對(duì)白類過敏，或?qū)?xì)菌的非毒素蛋白過敏，也可能對(duì)二者都過敏，Henncq給對(duì)原制白類過敏者接種無毒白喉?xiàng)U菌培養(yǎng)濾液時(shí)，受實(shí)者呈陽(yáng)性反應(yīng)。在過量鐵培養(yǎng)液中培養(yǎng)白喉，鐵抑制了白喉毒素的形成，但不能抑制致敏原的形成。證明成年人接種白類容易引起過敏反應(yīng)，是因?yàn)樵?jīng)在上呼吸道感染過無毒力或毒力很小的白喉?xiàng)U菌，這些菌體的非毒素蛋白使其致敏，當(dāng)再接種白類時(shí)，白類中含有少量此種蛋白而引起過敏反應(yīng)。固如果能制備出高純度的精制白類有利于降低不良反應(yīng)，國(guó)外生物制品規(guī)程規(guī)定，精白類的純度應(yīng)不低于25001f/mgPN。而我國(guó)規(guī)程規(guī)定不低于15001f/mgPN。因此用于成人免疫的精白類有必要進(jìn)一步純化，提高純度。
發(fā)明內(nèi)容設(shè)計(jì)目的避免
背景技術(shù)：
存在的不足之處，設(shè)計(jì)一種各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)均達(dá)到《中國(guó)藥典三部》吸附白喉疫苗要求，尤其純度指標(biāo)達(dá)到26001f/mgPN以上的一種用于提高白喉類毒素純度的工藝。設(shè)計(jì)方案本申請(qǐng)?jiān)趪?guó)內(nèi)生產(chǎn)白喉類毒素工藝的基礎(chǔ)上進(jìn)行工藝改進(jìn)，增加了將所用培養(yǎng)基超濾去除未消化徹底的蛋白降解物，二次鹽析后脫鹽后再經(jīng)凝膠過濾工藝，其各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)均達(dá)到《中國(guó)藥典三部》吸附白喉疫苗要求，尤其純度指標(biāo)達(dá)到26001f/mgPN以上，制品中的白喉類毒素純遠(yuǎn)高于同類制品中的純度，使制品更加安全。白喉類毒素工藝流程固體培養(yǎng)基傳代一(液體培養(yǎng)基經(jīng)處理去除分子量在50000以上的蛋白等)液體培養(yǎng)基發(fā)酵罐培養(yǎng)一離心去菌體一一段鹽析—二段鹽析一超濾脫鹽一凝膠過濾一除菌過濾一脫毒一原液檢定保存一半成品配制一成品；關(guān)鍵技術(shù)有兩點(diǎn)a、發(fā)酵罐培養(yǎng)。液體培養(yǎng)基經(jīng)處理去除分子量在50000以上的蛋白等。這樣培養(yǎng)收獲物中基本只有白喉毒素分子量在50000以上。b、通過鹽析和凝膠過濾進(jìn)一步去除收獲液中分子量50000以下的蛋白和其它雜蛋白等，從而獲得高純度的白喉毒素。技術(shù)方案一種用于提高白喉類毒素純度的工藝，其制作工藝為固體培養(yǎng)基傳代一液體培養(yǎng)基發(fā)酵罐培養(yǎng)一離心去菌體一一段鹽析一二段鹽析一超濾脫鹽一凝膠過濾一除菌過濾一脫毒一原液檢定保存一半成品配制一成品，液體培養(yǎng)基發(fā)酵罐中液體培養(yǎng)基經(jīng)處理去除分子量在50000以上的蛋白，培養(yǎng)收獲物中基本只有白喉毒素分子量在50000以上，通過鹽析和凝膠過濾進(jìn)一步去除收獲液中分子量50000以下的蛋白和其它雜蛋白，獲得高純度的白喉毒素。本發(fā)明與
背景技術(shù)：
相比，確定了合理的工藝路線，穩(wěn)定技術(shù)工藝流程，保證了規(guī)模化生產(chǎn)的可能，經(jīng)過培養(yǎng)基經(jīng)處理去除分子量在50000以上的蛋白等物質(zhì)，同過鹽析和凝膠過濾去除收獲液中分子量50000以下的蛋白和其它雜蛋白等，從而獲得高純度的白喉毒素，保證產(chǎn)品的安全性。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:一種用于提高白喉類毒素純度的工藝，其制作工藝為固體培養(yǎng)基傳代一液體培養(yǎng)基發(fā)酵罐培養(yǎng)一離心去菌體一一段鹽析—二段鹽析—超濾脫鹽一凝膠過濾一除菌過濾一脫毒一原液檢定保存一半成品配制—成品，所述的液體培養(yǎng)基發(fā)酵罐中液體培養(yǎng)基經(jīng)處理去除分子量在50000以上的蛋白，培養(yǎng)收獲物中基本只有白喉毒素分子量在50000以上，通過鹽析和凝膠過濾進(jìn)一步去除收獲液中分子量50000以下的蛋白和其它雜蛋白，獲得高純度的白喉毒素。工藝闡述(l)菌種制備將白喉38007菌種開啟并接種于呂氏血清斜面培養(yǎng)基上，34。C35t:孵箱培養(yǎng)16小時(shí)~24小時(shí)，再由血清斜面?zhèn)饔邳S氏馬丁肉湯(或改良林氏肉湯)培養(yǎng)基種子管，34'C35'C培養(yǎng)16小時(shí)~24小時(shí)為第二代，如此循環(huán)由黃氏馬丁肉湯傳至黃氏馬丁肉湯第二代，鏡檢合格者傳于10L瓶，34。C一35t:培養(yǎng)48小時(shí)。(2)大罐培養(yǎng)(培養(yǎng)基經(jīng)處理去除分子量在50000以上的蛋白等物質(zhì))毒素培養(yǎng)以抽樣3次，6小時(shí)內(nèi)絮狀單位不上升為停止培養(yǎng)指標(biāo)。用于生產(chǎn)的毒素不得低于150Lf/ml。(3)殺菌將培養(yǎng)液冷卻至28'C以下，按培養(yǎng)基的0.1%-0.15%加入甲醛溶液。(4)一段鹽析離心機(jī)去除菌體，經(jīng)濃縮，加入23%(W/V)晶體硫酸銨、1%(W/V)活性炭，然后加入0.5%(W/V)碳酸氫鈉。收集上清。(5)二段鹽析(去除小分子雜蛋白)緩慢加入22%(W/V)晶體硫酸銨，收集沉淀用無菌的0.1%碳酸氫鈉溶液浸泡沉淀。用無菌的0.1°/。碳酸氫鈉(NaHCQ3)溶液分次溶解、洗滌沉淀，送超過濾脫鹽。(6)超濾脫鹽將精制毒素溶液泵入超過濾系統(tǒng)，直至測(cè)定樣品硫酸銨含量低于千分之一即可收集脫鹽后精制白喉毒素液。(7)凝膠過濾獲得高純度白喉毒素。(8)除菌過濾用除菌過濾膜除菌過濾。(9)脫毒精制白喉毒素按0.5%計(jì)算加入福爾馬林溶液(按40%計(jì)算)及適量的10°/丄-賴氨酸溶液放置室溫2天-3天，每日振搖一次，然后放入36"C-37'C恒溫室，進(jìn)行脫毒。鵬精制類毒素原液檢定毒性逆轉(zhuǎn)試驗(yàn)，理化性狀，無菌試驗(yàn)，Lf值測(cè)定，純度，特異性毒性試驗(yàn)。保存與效期保存于2—8'C冷庫(kù)中，效期自脫毒合格之日起為3年半。表l:工藝與批號(hào)的對(duì)應(yīng)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2:樣品培養(yǎng)及檢定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3:原液類毒素檢定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>從以上結(jié)果顯示，經(jīng)過培養(yǎng)基經(jīng)處理去除分子量在50000以上的蛋白等物質(zhì)，同過鹽析和凝膠過濾去除收獲液中分子量50000以下的蛋白和其它雜蛋白等，從而獲得高純度的白喉毒素，可以盡可能的減小產(chǎn)品的不良反應(yīng)，保證產(chǎn)品的安全性。具研究表明使用純度高的白喉類毒素，1Lf的免疫劑量即可以引起免疫應(yīng)答，提示如果能制造出高純度的白喉類毒素，可以降低產(chǎn)品中白喉類毒素的用量，從而更進(jìn)一步保證產(chǎn)品的安全性。國(guó)內(nèi)規(guī)程《中國(guó)藥典》三部3.1.3純度應(yīng)不低于1500Lf/mgPN。擬定注冊(cè)規(guī)程3.1.3純度應(yīng)不低于2500Lf/mgPN。需要理解到的是上述實(shí)施例雖然對(duì)本發(fā)明作了比較詳細(xì)的文字描述，但是這些文字描述，只是對(duì)本發(fā)明設(shè)計(jì)思路的簡(jiǎn)單描述，而不是對(duì)本發(fā)明設(shè)計(jì)思路的限制，任何不超出本發(fā)明設(shè)計(jì)思路的組合、增加或修改，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。權(quán)利要求1、一種用于提高白喉類毒素純度的工藝，其制作工藝為固體培養(yǎng)基傳代→液體培養(yǎng)基發(fā)酵罐培養(yǎng)→離心去菌體→一段鹽析→二段鹽析→超濾脫鹽→凝膠過濾→除菌過濾→脫毒→原液檢定保存→半成品配制→成品，其特征是所述的液體培養(yǎng)基發(fā)酵罐中液體培養(yǎng)基經(jīng)處理去除分子量在50000以上的蛋白，培養(yǎng)收獲物中基本只有白喉毒素分子量在50000以上，通過鹽析和凝膠過濾進(jìn)一步去除收獲液中分子量50000以下的蛋白和其它雜蛋白，獲得高純度的白喉毒素。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于提高白喉類毒素純度的工藝，其制作工藝為固體培養(yǎng)基傳代→液體培養(yǎng)基發(fā)酵罐培養(yǎng)→離心去菌體→一段鹽析→二段鹽析→超濾脫鹽→凝膠過濾→除菌過濾→脫毒→原液檢定保存→半成品配制→成品，所述的液體培養(yǎng)基發(fā)酵罐中液體培養(yǎng)基經(jīng)處理去除分子量在50000以上的蛋白，培養(yǎng)收獲物中基本只有白喉毒素分子量在50000以上，通過鹽析和凝膠過濾進(jìn)一步去除收獲液中分子量50000以下的蛋白和其它雜蛋白，獲得高純度的白喉毒素。文檔編號(hào)C07K14/195GK101503725SQ200910096768公開日2009年8月12日申請(qǐng)日期2009年3月19日優(yōu)先權(quán)日2009年3月19日發(fā)明者郭志軍申請(qǐng)人:浙江天元生物藥業(yè)股份有限公司