專利名稱：選擇性富集翻譯后修飾的蛋白和/或肽的制作方法
選擇性富集翻譯后修飾的蛋白和/或肽發(fā)明主題本發(fā)明涉及通過使特定蛋白/肽標(biāo)記方案與待分析 的翻譯后修飾的蛋白和/或肽 的特異性選擇進(jìn)行組合，從復(fù)雜樣品中選擇性富集翻譯后修飾的蛋白和/或肽，其中所述 翻譯后修飾是糖基化。
背景技術(shù)：
從復(fù)雜樣品中鑒定、分離和分析特定蛋白或蛋白亞組對于揭示生物過程如何在分 子水平上發(fā)生、或者蛋白在各種細(xì)胞類型中或在生理狀態(tài)之間差異到何種程度是非常有價(jià) 值的。現(xiàn)代生物學(xué)中的主要挑戰(zhàn)涉及由生物編碼的整個(gè)蛋白組的表達(dá)、功能和調(diào)節(jié)的理 解，即通常稱為蛋白組學(xué)的技術(shù)領(lǐng)域。然而，因?yàn)椴淮嬖跀U(kuò)增蛋白的可能性，所以這個(gè)領(lǐng)域 中的研究一般是相當(dāng)費(fèi)力的，因?yàn)榧词瓜鄬唵蔚脑松锏募?xì)胞提取物也包含包括巨大 濃度范圍的多種蛋白。因此，此種任務(wù)超出任何目前簡單分析法的能力。因此，由于方法學(xué)限制，蛋白組分析不僅依賴于用于鑒定且定量蛋白的方法，還在 相當(dāng)大的程度上也依賴于根據(jù)其結(jié)構(gòu)和/或功能性質(zhì)允許其精確和可靠分離的方法，其中 這些亞組隨后更易于進(jìn)一步分析。蛋白組具有動態(tài)性質(zhì)，響應(yīng)細(xì)胞環(huán)境中的外界刺激或改變而具有蛋白合成、激活 和/或翻譯后修飾的改變。因此，蛋白組的固有復(fù)雜性超過細(xì)胞的基因組或轉(zhuǎn)錄組mRNA互 補(bǔ)序列的復(fù)雜性。由于在此種蛋白組學(xué)研究中待處理的非常大量的數(shù)據(jù)，所以蛋白/肽鑒定過程 需要巨大的分辨能力。通常用于分辨此種高度復(fù)雜混合物的兩種方法是二維凝膠電泳 (2D-GE;參見例如，0' Farrell, P. H. (1975) J. Biol. Chem. 250，4007-4021)和(二維) 液相層析((2D)-LC ；參見例如，Lipton，M.S.等人(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99， 11049-11054)。通過2D-GE或2D-LC分離的肽和蛋白通常通過質(zhì)譜法或通過測定氨基酸組 成和/或氨基酸序列進(jìn)行鑒定。然而，盡管對于許多應(yīng)用有用，但這些鑒定技術(shù)在要研究高度復(fù)雜樣品的蛋白質(zhì) 組學(xué)研究方面具有主要缺點(diǎn)。例如，疏水膜蛋白質(zhì)、高度堿性或酸性蛋白質(zhì)、非常大或非常 小的蛋白質(zhì)通常經(jīng)由2D-GE弱分辨。此外，這些方法的檢測(靈敏度)限制以及標(biāo)記技術(shù) 中的缺陷不允許平行可靠分析多種樣品，例如用于比較不同疾病組、疾病的不同進(jìn)展階段 之間，或疾病狀態(tài)與健康對照之間的相對蛋白水平或用于執(zhí)行高通量篩選分析。因此，高度希望開發(fā)克服上述局限性并且使得能夠平行處理多種復(fù)雜樣品的方 法。一般而言，特別是蛋白組學(xué)中，蛋白分析的另一個(gè)重要方面涉及研究翻譯后蛋白 修飾的可能性，翻譯后蛋白修飾可以影響蛋白的活性和結(jié)合并且改變其在細(xì)胞內(nèi)的作用 (參見例如，Pandey，A.和 Mann，M. (2000)Nature 405,837-846)。例如，蛋白的(可逆)磷 酸化對于調(diào)節(jié)許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)例如G蛋白偶聯(lián)的受體信號傳遞或磷酸-酪氨酸激酶信號 傳遞是關(guān)鍵的，蛋白糖基化在多細(xì)胞生物中的細(xì)胞/細(xì)胞和細(xì)胞/底物識別中起決定性作用，而遍在蛋白化對蛋白進(jìn)行標(biāo)記從而進(jìn)行降解，等等。蛋白組學(xué)的獨(dú)特特征之一是翻譯后修飾可以在較總體的水平上進(jìn)行研究，因此允 許分析包括特定修飾的整個(gè)蛋白亞組。單一基因的表達(dá)產(chǎn)物代表可能包含大量微異質(zhì)性的 蛋白群體，每個(gè)不同狀態(tài)(即在翻譯后修飾的氨基酸殘基數(shù)目方面不同的類似蛋白)對那 種蛋白的表達(dá)概況增加大量多樣性。目前，存在幾種可用的技術(shù)，例如質(zhì)譜法，由于特定修飾的存在或不存在，其在原 則上可以區(qū)分類似蛋白或肽。然而，由于有限的檢測靈敏度，這些改變通常在總體蛋白組學(xué) 研究中未觀察到。因此，為了研究特定翻譯后修飾，通常通過某些形式的親和純化而針對該 修飾富集樣品和/或從該樣品中分離富集的經(jīng)修飾的蛋白亞組將是有用的。然而，可用方 法一般受用合適親和標(biāo)記物標(biāo)記蛋白的需求或需要使用可能干擾進(jìn)一步分析的特異性抗 體或其他試劑的阻遏。因此，基于親和純化的此種方法特別不適合于平行處理多種樣品。 此外，基于捕獲或親和純化方案來區(qū)分具有特定修飾的不同亞組的蛋白和/或肽 (例如，酪氨酸磷酸化的與絲氨酸/蘇氨酸磷酸化的蛋白或N-連接的糖蛋白與0-連接的糖 蛋白與糖基磷脂酰肌醇-錨著的蛋白)一般是麻煩的。蛋白糖基化的研究近年來已指數(shù)增長，這是由于來自各個(gè)學(xué)科的研究者已認(rèn)識 至IJ，關(guān)鍵細(xì)胞功能受到此種類型的遍在翻譯后修飾類型的調(diào)節(jié)。重要的是，聚糖組成顯著反映細(xì)胞類型和狀態(tài)，例如物種、組織、發(fā)育階段等的差 異。此外，聚糖比核酸和蛋白具有高得多的發(fā)揮結(jié)構(gòu)多樣性的潛能(Laine，R. Α. (1994) Glycobiology 4,759-767).糖組分的數(shù)目相對小，包括例如葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、甘露 糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、L-巖藻糖、L-木糖、L-阿拉伯糖和N-乙酰神經(jīng)氨酸，但鍵和 分支的高度變化使糖基化可能是最復(fù)雜的翻譯后修飾。此外，顯示了細(xì)胞糖基化譜在腫瘤發(fā)生過程中顯著改變(例如在Caprioli， R.M. (2005) Cancer Res. 65，10642 10645中綜述)；因此，對可以作為腫瘤診斷的生物標(biāo)記 物的腫瘤分泌的糖蛋白繼續(xù)進(jìn)行研究。因此，持續(xù)需要關(guān)于允許從復(fù)雜樣品中選擇性富集翻譯后修飾的蛋白和/或肽的 方法。特別地，將希望提供不僅以高靈敏度還無需特定試劑的、用于分離和/或區(qū)分糖基化 蛋白和/或肽的方法。此外，還將希望提供允許進(jìn)行多路分析的此種方法。發(fā)明目的和概述提供用于從復(fù)雜樣品中選擇性富集翻譯后修飾的肽和/或蛋白，特別是糖基化蛋 白和/或肽的新方法是本發(fā)明的一個(gè)目的。更具體而言，提供用于平行執(zhí)行多個(gè)此種分析 的方法是本發(fā)明的一個(gè)目的。提供允許使翻譯后修飾的蛋白和/或肽與其未經(jīng)修飾的對應(yīng)物分離和/或區(qū)分這 些經(jīng)修飾的蛋白和/或肽的不同亞組是本發(fā)明的進(jìn)一步目的。這些目的以及根據(jù)后續(xù)說明書將明確的其他目的通過獨(dú)立權(quán)利要求的主題實(shí)現(xiàn)。 本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案通過從屬權(quán)利要求的主題限定。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于從樣品選擇性富集和/或分離翻譯后修飾的 蛋白和/或肽的方法，包括(a)對樣品中包含的蛋白和/或肽進(jìn)行單或雙化學(xué)標(biāo)記；(b)捕獲翻譯后修飾的蛋白和/或肽的亞組，所述蛋白和/或肽的亞組包含要分析的特定翻譯后修飾；和(c)分離捕獲的翻譯后修飾的蛋白和/或肽的亞組，其中所述要分析的翻譯后修飾是糖基化。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括在進(jìn)行步驟(a)之前和/或與進(jìn)行步 驟(a)同時(shí)將蛋白切割成肽。在本發(fā)明方法的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙化學(xué)標(biāo)記包括同位素和同量異位素 標(biāo)記。特別優(yōu)選地，在同量異位素標(biāo)記前進(jìn)行同位素標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，在將蛋白切割成肽之前進(jìn)行同位素標(biāo)記。在分析糖基化蛋白和/或肽的情況下，步驟(b)典型地包括凝集素親和捕獲和糖 蛋白化學(xué)捕獲中的至少一種。在本發(fā)明方法的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟(C)包括從至少第一亞組的分離的翻 譯后修飾的蛋白和/或肽除去翻譯后修飾。典型地，化學(xué)或酶促除去翻譯后修飾。在進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方案中，第一亞組的分離的翻譯后修飾的蛋白和/或肽包括 N-糖基化蛋白和/或肽。特別優(yōu)選地，通過肽N-糖苷酶F，從所述N-糖基化蛋白和/或 肽酶促除去糖基化。在本發(fā)明方法的另一實(shí)施方案中，在進(jìn)行步驟(C)后，使蛋白分子的其余亞組進(jìn) 行另外的步驟(a)-(c)的循環(huán)，并且其中步驟(c)包括從至少第二亞組的蛋白分子除去翻 譯后修飾。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，第二亞組的分離的翻譯后修飾的蛋白和/或肽包括C-糖 基化蛋白和/或肽。在另一實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括通過質(zhì)譜分析分離的蛋白和/或肽。在一 些實(shí)施方案中，該方法以高通量形式進(jìn)行。本發(fā)明的方法可以用于進(jìn)行定性和/或定量蛋白組分析。根據(jù)下文詳述可以明確本發(fā)明的其他實(shí)施方案。圖例

圖1描述了選擇性糖基化肽(糖肽)的本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的示例性說 明。首先，使用同位素親和標(biāo)簽(Isotope-coded AffinityTag)技術(shù)(ICAT)對給定樣品中 包含的蛋白進(jìn)行同位素標(biāo)記，并且進(jìn)行酶促消化。隨后，使用用于相對和絕對定量的同量異 位素標(biāo)記(Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation)技術(shù)(iTRAQ)對所 得到的肽進(jìn)行同量異位素標(biāo)記。合并標(biāo)記的糖基化肽，通過陽離子交換色譜進(jìn)行捕獲。最 后，將糖基化的ICAT/iTRAQ肽和糖基化的iTRAQ肽與它們的非糖基化對應(yīng)物分離。圖2描繪了用于選擇性富集糖基化肽的本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案的示例性說 明。在16O-或18O-標(biāo)記的水(同位素標(biāo)記)存在下酶促消化樣品中包含的蛋白。然后用 iTRAQ對得到的肽的各個(gè)合并物進(jìn)行同量異位素標(biāo)記。合并標(biāo)記的糖基化肽，通過陽離子 交換層析捕獲。最后，將糖基化的160/180_標(biāo)記的/iTRAQ肽與它們的非糖基化的對應(yīng)物分 罔。圖3描繪了用于選擇性富集糖基化肽的本發(fā)明的另-優(yōu)選實(shí)施方案的示例性說 明。使蛋白進(jìn)行圖1描述的相同標(biāo)記程序以及涉及ICAT-肽(即含半胱氨酸的肽)的親和 選擇的兩倍捕獲/選擇程序和圖1和2描述的陽離子交換層析。然后，將糖基化的ICAT/iTRAQ肽與它們的非糖基化的對應(yīng)物分離。發(fā)明詳述本發(fā)明基于出乎意料的下述發(fā)現(xiàn)使特定蛋白/肽方案與要分析的翻譯后修飾的 蛋白和/或肽的特異性選擇組合，允許從復(fù)雜樣品中快速和高度選擇性富集和/或分離所 述修飾的蛋白。此外，通過適應(yīng)反應(yīng)條件，相同方法還適合于區(qū)分具有特定翻譯后修飾的不 同蛋白亞組。在下文中舉例說明性描述的本發(fā)明可以適當(dāng)?shù)卦诓淮嬖诒疚奈淳唧w公開的任何 一種或多種要素、一種或多種限定條件的情況下進(jìn)行實(shí)踐。本發(fā)明將針對特定實(shí)施方案且參考特定附圖進(jìn)行描述，但本發(fā)明并不限于其，而 僅受權(quán)利要求限制。所述附圖僅是示意性的而不是限制性的。在附圖中，為了舉例說明性目的，某些要 素的大小可能是放大的而未按比例描繪。當(dāng)術(shù)語“包括”在本說明書和權(quán)利要求中使用時(shí)，它不排除其他要素或步驟。為了
本發(fā)明的目的，術(shù)語“由......組成”視為術(shù)語“包括”的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案。如果在下文
中組定義為包括至少特定數(shù)目的實(shí)施方案，那么這還應(yīng)理解為公開優(yōu)選僅由這些實(shí)施方案 組成的組。當(dāng)提及單數(shù)名詞使用不定冠詞或定冠詞例如“一個(gè)”或“一種”、“該”時(shí)，這包括那 個(gè)名詞的復(fù)數(shù)，除非具體陳述其他事物。在本發(fā)明上下文中的術(shù)語“約”指本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解仍確保所討論特征的 技術(shù)效果的準(zhǔn)確度區(qū)間。該術(shù)語一般指示與所指出的數(shù)值士 10%、且優(yōu)選士5%的偏差。此外，說明書和權(quán)利要求中的術(shù)語第一、第二、第三等用于區(qū)分相似要素，并且不 一定用于描述順序或時(shí)間次序。應(yīng)當(dāng)理解如此使用的術(shù)語在合適情況下是可互換的，并且 本文描述的本發(fā)明的實(shí)施方案能夠以除本文所述或舉例說明外的其他順序操作。更多的術(shù)語定義將在下文中使用術(shù)語的上下文中給出。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及從樣品選擇性富集和/或分離翻譯后修飾的蛋白 和/或肽的方法，包括(a)對樣品中包含的蛋白和/或肽進(jìn)行單或雙化學(xué)標(biāo)記；(b)捕獲翻譯后修飾的蛋白和/或肽的亞組，所述蛋白和/或肽的亞組包含要分析 的特定翻譯后修飾；和(c)分離捕獲的翻譯后修飾的蛋白和/或肽的亞組，其中所述要分析的翻譯后修飾是糖基化。如本文所使用的，術(shù)語“蛋白”指包括經(jīng)由肽鍵連接的多個(gè)天然或修飾氨基酸的任 何天然存在或合成的(例如通過化學(xué)合成或重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的)大分子。這種分子的長 度可以從2-數(shù)千個(gè)氨基酸(該術(shù)語因此也包括通常稱作寡肽的分子)。典型地，術(shù)語“蛋白”涉及長度超過20個(gè)氨基酸的分子。因此，要在本發(fā)明中分析 的蛋白可以具有約30至約2500個(gè)氨基酸、約50至約1000個(gè)氨基酸或約100至約1000個(gè) 氨基酸的長度。如本文所使用的，術(shù)語“肽”指上述“蛋白”在切割一個(gè)或多個(gè)肽鍵后獲得的任何 片段。如本發(fā)明中使用的肽不以任何方式在其大小或性質(zhì)方面進(jìn)行限制。典型地，要在本發(fā)明中分析的肽可以具有約2至約20個(gè)氨基酸、約3至約18個(gè)氨基酸或約5至約15個(gè)氨 基酸的長度。如本文所使用的，術(shù)語“翻譯后修飾”應(yīng)當(dāng)理解為不對蛋白和/或肽中包括的翻譯 后修飾的數(shù)目和/或類型進(jìn)行限制。因此，給定蛋白在其序列中可以包括兩個(gè)或更多個(gè)糖 基化氨基酸，其可以是相同類型或不同類型(見下文)。
本文使用的術(shù)語“糖基化蛋白”(本文也稱作“糖蛋白”)和“糖基化肽”(本文也 稱作“糖肽”)是指任何在一級序列中包含一個(gè)或多個(gè)糖基化氨基酸殘基的蛋白和/或肽， 其中所述糖基化可以是N-糖基化、0-糖基化或糖基磷脂酰肌醇_錨著。本文使用的術(shù)語 “N-糖基化”(本文也稱作“N-連接的糖基化”)是指任何糖部分(即碳水化合物或糖部分， 包括單糖，如葡萄糖或半乳糖、二糖，如麥芽糖和蔗糖，以及寡糖或多糖)在天冬酰胺氨基 酸殘基的酰胺氮上的酶指導(dǎo)的和定點(diǎn)的添加，而本文使用的術(shù)語“0-糖基化”(本文也稱作 “0-連接的糖基化”)是指任何糖部分在絲氨酸或蘇氨酸氨基酸殘基的羥基氧上的酶指導(dǎo) 的和定點(diǎn)的添加。最后，本文使用的術(shù)語“糖基磷脂酰肌醇_錨著”(本文也稱作“GPI-錨 著”)是指在蛋白和/或肽的C-末端氨基酸上添加通過含碳水化合物的接頭(例如與磷酸 乙醇胺殘基連接的葡糖胺和甘露糖)連接的疏水磷脂酰肌醇基團(tuán)，其中磷脂酰肌醇基團(tuán)內(nèi) 的兩個(gè)脂肪酸將蛋白錨著于細(xì)胞膜。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，通過翻譯后蛋白修飾可以體內(nèi)發(fā) 生氨基酸糖基化，或通過采用特異性糖基轉(zhuǎn)移酶可以體外發(fā)生氨基酸糖基化。借助于本發(fā)明的方法從包括糖蛋白和/或糖肽的樣品，優(yōu)選從生物樣品富集和/ 或分離糖蛋白和/或糖肽。如本文所使用的，術(shù)語“樣品”不意指在執(zhí)行本發(fā)明的方法前必 須包括或排除任何處理步驟。樣品可以是未經(jīng)處理的(“粗”)樣品、提取的蛋白級分、純化 的蛋白級分等。例如，所采用的樣品可以通過一個(gè)或多個(gè)亞組的充足蛋白的免疫耗竭進(jìn)行 預(yù)處理。合適樣品包括原核生物(例如細(xì)菌或病毒樣品)或真核生物來源(例如真菌、酵 母、植物、無脊椎動物、哺乳動物且特別是人樣品)的樣品。如本文所使用的，術(shù)語“復(fù)雜樣品，，指下述事實(shí)使用本發(fā)明的方法分析的樣品典 型地包括大量不同蛋白和/或肽(或此種蛋白和/或肽的不同變體)，其以不同濃度存在。 例如，本發(fā)明內(nèi)的復(fù)雜樣品可以包括至少約500、至少約1000、至少約5000或至少約10000 種蛋白和/或肽。本發(fā)明中使用的典型復(fù)雜樣品尤其包括原核生物或真核生物來源的細(xì)胞 提取物或裂解物以及人或非人體液例如全血、血清、血漿樣品等。如本文所使用的，術(shù)語“化學(xué)標(biāo)記”指一種或多種可檢測標(biāo)記物(或“標(biāo)記”)連 接于或摻入本發(fā)明中使用的蛋白和/或肽內(nèi)。如本文所使用的，術(shù)語“可檢測標(biāo)記物”指包 括一種或多種合適化學(xué)物質(zhì)或酶的任何化合物，其在化學(xué)、物理或酶促反應(yīng)中直接或間接 產(chǎn)生可檢測化合物或信號。如本文所使用的，該術(shù)語應(yīng)當(dāng)理解為包括像這樣的標(biāo)記(即與 蛋白和/或肽結(jié)合的化合物或部分)以及標(biāo)記試劑(即在與肽或蛋白結(jié)合前的化合物或部 分)。在本發(fā)明中使用的標(biāo)記可以經(jīng)由共價(jià)或非共價(jià)鍵與蛋白和/或肽的氨基酸殘基連接。 典型地，鍵是共價(jià)鍵。標(biāo)記可以選自同位素標(biāo)記、同量異位素標(biāo)記、酶標(biāo)記、有色標(biāo)記、熒光 標(biāo)記、生色標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、半抗原、生物素、金屬絡(luò)合物、金屬和膠體金等，其 中同位素標(biāo)記和同量異位素標(biāo)記是特別優(yōu)選的。所有這些類型的標(biāo)記是本領(lǐng)域充分建立 的。如本文所使用的，術(shù)語“單標(biāo)記”指蛋白和/或肽由僅一類標(biāo)記，例如僅同量異位素標(biāo)記的一個(gè)或多個(gè)可檢測標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。如本文所使用的，術(shù)語“雙標(biāo)記”指蛋白和/ 或肽由兩個(gè)不同類型標(biāo)記，例如同位素標(biāo)記和同量異位素標(biāo)記的一個(gè)或多個(gè)可檢測標(biāo)記物 進(jìn)行標(biāo)記。
在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，蛋白和/或肽是雙標(biāo)記的。特別優(yōu)選地， 蛋白和/或肽的雙標(biāo)記包括同位素標(biāo)記和同量異位素標(biāo)記，即同位素標(biāo)記和同量異位素標(biāo) 記各自的一個(gè)或多個(gè)分別連接于或摻入要分析的蛋白和/或肽。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，兩個(gè) 標(biāo)記步驟可以以任何按順序的次序或同時(shí)執(zhí)行。然而，在本發(fā)明方法的典型實(shí)施方案中，同 位素標(biāo)記在同量異位素標(biāo)記前?？梢岳缤ㄟ^生長細(xì)胞的代謝標(biāo)記(例如使用可商購的 SILAC(在細(xì)胞培養(yǎng)中用氨基酸進(jìn)行穩(wěn)定的同位素標(biāo)記)技術(shù))、完整蛋白的標(biāo)記(如ICAT 標(biāo)記)、標(biāo)記(例如16O-或18O-標(biāo)記的水)存在下的蛋白消化和消化的肽的標(biāo)記(例如iTRAQ 標(biāo)記)，將穩(wěn)定的標(biāo)記在多個(gè)樣品制備階段引入蛋白和/或肽。如本文所使用的，術(shù)語“同位素標(biāo)記”指使用一組兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)記進(jìn)行的標(biāo)記事 件，所述標(biāo)記具有相同化學(xué)式但在一個(gè)或多個(gè)原子存在的同位素?cái)?shù)目和/或類型方面彼此 不同，導(dǎo)致可以例如經(jīng)由質(zhì)譜法檢測的標(biāo)記的蛋白和/或肽質(zhì)量方面的差異。換言之，由不 同同位素標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記的在其他方面等同的蛋白和/或肽可以因此基于質(zhì)量方面的差異 進(jìn)行區(qū)別。雖然同量異位素標(biāo)記(參見下文)在原則上構(gòu)成特定類型的同位素標(biāo)記，但在 本發(fā)明的上下文中，術(shù)語同位素標(biāo)記將用于指并非同量異位素但可以因此基于其分子量區(qū) 分的標(biāo)記。根據(jù)本發(fā)明的同位素標(biāo)記的例子包括16O-或18O標(biāo)記的水或同位素親和標(biāo)簽 (ICAT)標(biāo)記等等(參見 Gygi，S. P.等人(1999) Nat. Biotechnol. 17，994-999)。ICAT 試劑使 用3種功能元件用于選擇性標(biāo)記還原的半胱氨酸氨基酸殘基的硫醇反應(yīng)基團(tuán)，允許選擇 性分離標(biāo)記的肽的生物素親和標(biāo)記，和同位素標(biāo)記，其以兩種同位素形式合成，即“輕”(非 同位素)和“重”(利用例如2H或13C)形式。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，同位素標(biāo)記可以在肽水平 上(例如通過在16O-或18O標(biāo)記的水的存在下切割要分析的樣品中包含的蛋白)、或例如通 過采用商購可得的ICAT試劑(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)直接在蛋白水 平上(即在切割前)進(jìn)行。如本文所使用的，術(shù)語“同量異位素標(biāo)記”指使用具有相同結(jié)構(gòu)和相同質(zhì)量的一組 兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)記進(jìn)行的標(biāo)記事件，所述標(biāo)記在斷裂后釋放由于同量異位素標(biāo)記內(nèi)同位素 的差異分布而具有相同結(jié)構(gòu)但在質(zhì)量方面不同的特定片段。同量異位素標(biāo)記典型地包括在 質(zhì)譜法分析中在碰撞誘導(dǎo)的解離(CID，即片段釋放)后產(chǎn)生強(qiáng)標(biāo)志離子的報(bào)道基團(tuán)、和包 括特定補(bǔ)償數(shù)目同位素的平衡基團(tuán)，以便確保報(bào)道基團(tuán)和平衡基團(tuán)的組合質(zhì)量對于不同同 量異位素標(biāo)記是恒定的。平衡基團(tuán)可以在CID后從標(biāo)記中釋放或不釋放。根據(jù)本發(fā)明的同量異位素標(biāo)記的例子包括用于相對和絕對定量標(biāo)記的同量 異位素標(biāo)記物(iTRAQ)等等(參見 Ross，P. L.等人(2004)Mol. Cell. Proteomics 3， 1154-1169)。這種方法采用4種不同的iTRAQ試劑，其各自包含報(bào)道基團(tuán)、平衡基團(tuán)和與伯 胺基團(tuán)(例如，賴氨酸氨基酸殘基的ε氨基)反應(yīng)的肽反應(yīng)基團(tuán)。依賴于每種試劑中12C/13C 和160/180的不同同位素組合，報(bào)道基團(tuán)具有114、115、116或117Da的質(zhì)量。平衡基團(tuán)在質(zhì) 量方面從31到28Da不等，以確保報(bào)道基團(tuán)和平衡基團(tuán)的組合質(zhì)量對于4種試劑保持恒定 (145Da)。因此，相同肽由這些試劑中的每一種進(jìn)行標(biāo)記，得到這樣的肽其是同量異位的，并且因此例如在液相層析中共洗脫，并且因而彼此無法層析區(qū)別。然而，在質(zhì)譜法過程中， 至少各自的報(bào)道基團(tuán)在CID后釋放，顯示114至117Da的不同質(zhì)量。這些片段的強(qiáng)度可以 用于在單次分析中對各個(gè)蛋白和/或肽進(jìn)行定量。
本發(fā)明特別涉及組合使用同位素標(biāo)記和同量異位素標(biāo)記來進(jìn)行多路蛋白分析， 艮口，用于平行進(jìn)行多種分析，例如，2、4、8或16個(gè)平行樣品。特別地，所述組合的標(biāo)記策略也 使得能夠比較不同樣品之間的相對蛋白水平。同位素和同量異位素標(biāo)記的組合物可以具有 以下優(yōu)點(diǎn)即，僅僅需要例如通過MALDI-MS/MS分析或iTRAQ定量來特異性分析觀察到差異 表達(dá)水平的那些肽，由此得到更快和較不復(fù)雜的樣品分析。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括在標(biāo)記蛋白和/或肽之前或同時(shí)，將蛋白 切割為肽。在一些實(shí)施方案中，在蛋白的同位素標(biāo)記之后(但在同量異位素標(biāo)記之前)進(jìn) 行蛋白切割。此種蛋白切割可以用化學(xué)(例如，經(jīng)由酸或堿處理，其采用化學(xué)物質(zhì)例如溴化 氰、2-(2'-硝基苯磺酰基)-3-甲基-3-溴-假吲哚(BNPS)、甲酸、羥胺、碘苯甲酸和2-硝 基-5-硫代氰基苯甲酸)或經(jīng)由本領(lǐng)域眾所周知的蛋白酶(包括胰蛋白酶、胃蛋白酶、凝血 酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K等)酶促實(shí)現(xiàn)。本文使用的術(shù)語“捕獲”是指用于鑒定和隨后富集和/或選擇特定糖蛋白和/或 糖肽亞組的程序，所述糖蛋白和/或糖肽要通過將所述糖蛋白和/或糖肽亞組共價(jià)或非共 價(jià)連接(由此固定)于合適的結(jié)合成員(例如合適的基質(zhì)或樹脂；參見下文)的方式進(jìn)行 分析，所述結(jié)合成員使得能夠?qū)⒉东@的翻譯后修飾的蛋白和/或肽與它們的未標(biāo)記的對應(yīng) 物進(jìn)一步分離。任選地，結(jié)合成員可以附著于固體支持物如表面(例如順磁聚苯乙烯顆粒 或乳膠珠的表面)，所述固定促進(jìn)隨后分離捕獲的蛋白和/或肽亞組。典型地，捕獲步驟至少包括親和純化或親和層析步驟，即，將翻譯后修飾的蛋白和 /或肽亞組連接(即捕獲)于對要選擇的蛋白和/或肽亞組具有特異性結(jié)合活性的結(jié)合成 員。但是，捕獲步驟也可以依賴于離子交換層析、大小排阻層析、疏水相互作用層析和/或 反相排阻層析中的一種或多種。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，也可以將相同或不同類型的兩個(gè)或更 多個(gè)捕獲步驟，例如兩個(gè)親和層析步驟(使用相同類型或不同類型的基質(zhì))或親和純化步 驟和離子交換層析進(jìn)行組合。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，捕獲步驟包括凝集素親和捕獲和糖蛋白化學(xué)捕獲中的至 少一種。本文使用的“凝集素親和捕獲”是指采用凝集素作為結(jié)合成員的捕獲方案。本文使 用的術(shù)語“凝集素”是指植物、細(xì)菌、真菌和動物中發(fā)現(xiàn)的一類蛋白，已知其結(jié)合特定寡糖部 分(綜述于Lis，H.，和Sharon，N. (1998) Chem. Rev. 98,637 674)。與抗原-抗體結(jié)合親和力 不同，單糖和寡糖與大多數(shù)凝集素結(jié)合的親和常數(shù)在低微摩爾范圍，但也可以在毫摩爾范 圍內(nèi)。對于親和捕獲目的，寡糖和凝集素這兩者自身的多價(jià)性質(zhì)使這些相互作用對層析分 離有用。合適的凝集素包括a-sarciruriziruconcavalin A和鈣連接蛋白，等等。用于凝 集素親和捕獲的一些方案是本領(lǐng)域已知的(參見例如Kaji等(2003)Nat. Biotechnol. 21， 667-672 ；Hirabayashi，J. (2004) Glycoconj. J. 21,35 40 ；Drake, R. R.等(2006)Mol. Cell. Proteomics 5，1957-1967)。本文使用的術(shù)語“糖蛋白化學(xué)捕獲”是指用于糖蛋白的任何化學(xué)捕獲程序，但不涉 及使用凝集素。很多這些程序涉及離子交換層析步驟。一些程序是本領(lǐng)域充分確立的(參 見例如 Zhang, H. et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21，660—666 ；Sun, B. et al. (2007)Mol.Cell. Proteomics 6，141-149)。典型地，在這些化學(xué)捕獲程序中，要分析的蛋白是單或雙化學(xué)標(biāo)記的，并且例如通 過使用胰蛋白酶或任何其它蛋白酶切割成肽。將消化的肽溶解于終濃度為2mg/100y 1緩 沖液的偶聯(lián)緩沖液(IOOmM醋酸鈉，150mM NaCl, pH 5. 5)中。通過離心除去任何未溶解的 固體。將上清液用于后面的反應(yīng)。首先通過加入IOmM高碘酸鈉(終濃度)并且在顛倒旋 轉(zhuǎn)下在暗處在室溫下將樣品溫育30分鐘，將碳水化合物的順式二醇基團(tuán)氧化為醛。隨后， 加入20mM亞硫酸鈉(終濃度)用于猝滅，并且在室溫下將樣品溫育10分鐘，以便滅活任何 過量的氧化劑。
然后，通過在猝滅的樣品中引入終濃度為20mg/ml的酰胼樹脂(商購珠的形式) 而起始偶聯(lián)反應(yīng)。通過形成共價(jià)腙鍵，將碳水化合物的醛基團(tuán)與酰胼樹脂偶聯(lián)。為了確保 固體與液體的比是1 5，在樣品中加入適量的偶聯(lián)緩沖液。在顛倒旋轉(zhuǎn)下在37°C進(jìn)行偶 聯(lián)反應(yīng)過夜。隨后，分別用milliQ-純凈水、1. 5M NaCl、甲醇和乙腈將樹脂徹底和按順序洗滌兩 次。洗滌后是緩沖液交換步驟(即陽離子交換層析步驟)，以調(diào)節(jié)IOOmM NH4HCO3的終濃度。最后，在使用磁珠的情況下，例如通過離心或磁力分離，從樣品分離捕獲的翻譯后 修飾的蛋白和/或肽(即連接于結(jié)合成員和任選連接于任何固體支持物的蛋白和/或肽)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，分離步驟包括從至少第一亞組的分離的翻譯后 修飾的蛋白和/或肽除去翻譯后修飾，這促進(jìn)進(jìn)一步分離，并且也允許在分離的翻譯后修 飾的蛋白和/或肽的不同亞組之間進(jìn)行區(qū)分，其中要除去的翻譯后修飾是糖基化。本文使用的術(shù)語“至少第一亞組的分離的翻譯后修飾的蛋白和/或肽”應(yīng)以這樣 的方式理解即，它可以涉及存在的分離的翻譯后修飾的蛋白和/或肽的總數(shù)或涉及其特 定部分。本文使用的術(shù)語“除去”是指要分析的翻譯后修飾的完全消除，例如通過化學(xué)裂解 或酶作用(也參見下文的討論)。因此，從至少一個(gè)亞組的分離的翻譯后修飾的蛋白和/或 肽除去翻譯后修飾，也導(dǎo)致它們從結(jié)合成員(任選從固體支持物)的釋放。優(yōu)選地，通過特定糖苷酶，化學(xué)(例如經(jīng)β -消除)或酶促除去翻譯后修飾。在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，至少第一亞組的分離的糖蛋白和/或糖肽 包括N-糖基化蛋白和/或肽。從蛋白和/或肽除去N-連接的糖基修飾優(yōu)選可以通過以下方法實(shí)現(xiàn)用濃度為 500U(1 μ l)PNGase F/2_6mg粗蛋白的肽N-糖苷酶F(PNGase F)在37°C下從糖基部分酶 促切割N-連接的肽過夜。PNGase F是一種酰胺酶，其在最內(nèi)部的GIcNAC和天冬酰胺殘基 之間，從N-連接的糖蛋白切割出高甘露糖、雜合和復(fù)雜寡糖。可以通過離心收集含釋放的 去糖基化肽的上清液。因此，該程序使得能夠選擇性區(qū)分N-糖基化的蛋白和/或肽與其它 類型的糖蛋白和/或糖肽(即分別是0-糖基化的和GPI錨著的蛋白和/或肽)。盡管PNGase F去糖基化從糖肽除去糖部分，仍然可以通過質(zhì)譜分析檢測糖基化位 點(diǎn)，因?yàn)閷τ诿總€(gè)天冬酰胺，PNGase F去糖基化得到天冬氨酸(相應(yīng)于+IDa的質(zhì)量差異)。在另一個(gè)典型的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法，特別是分離步驟，進(jìn)一步包括在進(jìn)行 步驟(c)后使其余的蛋白分子亞組進(jìn)行另外的步驟(a)-(c)的循環(huán)，其中步驟(c)包括從 至少第二亞組的蛋白分子除去翻譯后修飾。在本發(fā)明方法的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，至少第二亞組的分離的糖蛋白和/或糖肽包括O-糖基化蛋白和/或肽?？梢酝ㄟ^采用特定0-糖苷酶的酶促裂解或化學(xué)方法例如通過β-消除(S卩，本領(lǐng) 域充分確立的一類消除反應(yīng)，其中從底物的兩個(gè)相鄰原子除去原子或原子基團(tuán)，同時(shí)形成 η鍵)，實(shí)現(xiàn)從蛋白和/或肽除去0-連接的糖基修飾。在其它實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括通過質(zhì)譜分析分離的翻譯后修飾的蛋白和 /或肽，質(zhì)譜是一種用于測量離子的質(zhì)量與電荷比的分析技術(shù)。采用的具體質(zhì)譜分析可以取 決于不同樣品中確定的蛋白和/或肽表達(dá)的水平。在一些實(shí)施方案中，以高通量形式執(zhí)行 本發(fā)明的方法。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本文描述的方法用于進(jìn)行定性和/或定量蛋 白組分析的用途。盡管針對某些優(yōu)選實(shí)施方案描述了上述發(fā)明，但這不以任何方式限制本發(fā)明的范 圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚地知道進(jìn)一步的實(shí)施方案和關(guān)于先前所述實(shí)施方案的改變?nèi)栽诒?發(fā)明的范圍內(nèi)。
實(shí)施例 實(shí)施例1按照制造商的說明書，分別使用商購的試劑ICAT和iTRAQ進(jìn)行要分析的樣品中包 含的蛋白的同位素和同量異位素標(biāo)記。在進(jìn)行ICAT標(biāo)記后，在加入iTRAQ試劑前，將蛋白 酶促切割為肽?；蛘?，通過標(biāo)記一半的樣品進(jìn)行同位素標(biāo)記步驟，所述標(biāo)記是通過蛋白酶介 導(dǎo)的、將16O或18O摻入樣品中存在的肽的C末端中而進(jìn)行的。隨后，使雙標(biāo)記的肽進(jìn)行糖肽捕獲程序。將干燥的胰蛋白酶消化的肽溶解于終濃 度為2mg/100y 1緩沖液的偶聯(lián)緩沖液(IOOmM醋酸鈉，150mM NaCl,pH 5. 5)中。通過離心 除去任何未溶解的固體。將上清液用于后面的反應(yīng)。首先通過加入IOmM高碘酸鈉(終濃度)并且在顛倒旋轉(zhuǎn)下在暗處在室溫下將樣 品溫育30分鐘，將碳水化合物的順式二醇基團(tuán)氧化為醛。隨后，加入20mM亞硫酸鈉(終濃 度)，并且在室溫下將樣品溫育10分鐘，以便滅活樣品中任何過量的氧化劑。通過在猝滅的樣品中引入終濃度為20mg/ml的商購酰胼樹脂(珠)而起始偶聯(lián)反 應(yīng)。為了確保固體與液體的比是1 5，在樣品中加入適量的偶聯(lián)緩沖液。在顛倒旋轉(zhuǎn)下 在37°C進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)過夜。隨后，分別用milliQ-純凈水、1. 5M NaCl、甲醇和乙腈將樹脂徹 底和按順序洗滌兩次。洗滌后是緩沖液交換步驟(即陽離子交換層析步驟)，以調(diào)節(jié)IOOmM NH4HCO3的終濃度。用濃度為500U(Iul)PNGase F/2_6mg粗蛋白的肽N-糖苷酶F(PNGase F)在37°C 下從糖基部分酶促切割N-連接的肽過夜。PNGase F是一種酰胺酶，其在最內(nèi)部的GIcNAC 和天冬酰胺殘基之間，從N-連接的糖蛋白切割出高甘露糖、雜合和復(fù)雜寡糖。通過離心收 集含釋放的去糖基化肽的上清液，與80%乙腈洗滌的上清液合并。此后，干燥溶液，用0. 甲酸中的乙腈重配，并且進(jìn)行質(zhì)譜(MS)分析。該程 序僅僅選擇N-連接的糖肽。盡管PNGase F去糖基化從糖肽除去糖部分，仍然可以通過質(zhì) 譜分析檢測糖基化位點(diǎn)，因?yàn)閷τ诿總€(gè)天冬酰胺，PNGase F去糖基化得到天冬氨酸?；蛘撸?可以通過特定0-糖苷酶或通過化學(xué)裂解，例如β -消除，選擇性切割0-連接的糖肽。
權(quán)利要求
用于從樣品選擇性富集和/或分離翻譯后修飾的蛋白和/或肽的方法，包括(a)對樣品中包含的蛋白和/或肽進(jìn)行單或雙化學(xué)標(biāo)記；(b)捕獲翻譯后修飾的蛋白和/或肽的亞組，所述蛋白和/或肽的亞組包含要分析的特定翻譯后修飾；和(c)分離捕獲的翻譯后修飾的蛋白和/或肽的亞組，其中所述要分析的翻譯后修飾是糖基化。
2.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在進(jìn)行步驟(a)之前和/或與進(jìn)行步驟(a)同時(shí) 將蛋白切割成肽。
3.權(quán)利要求1或2的任一項(xiàng)的方法，其中雙標(biāo)記包括同位素和同量異位素標(biāo)記。
4.權(quán)利要求3的方法，其中在同量異位素標(biāo)記之前進(jìn)行同位素標(biāo)記。
5.權(quán)利要求3或4的方法，其中在將蛋白切割成肽之前進(jìn)行同位素標(biāo)記。
6.權(quán)利要求1-5的任一項(xiàng)的方法，其中步驟(b)包括凝集素親和捕獲和糖蛋白化學(xué)捕 獲中的至少一種。
7.權(quán)利要求1-6的任一項(xiàng)的方法，其中步驟(c)包括從至少第一亞組的分離的翻譯后 修飾的蛋白和/或肽除去翻譯后修飾。
8.權(quán)利要求7的方法，其中化學(xué)或酶促除去翻譯后修飾。
9.權(quán)利要求7或8的方法，其中第一亞組的分離的翻譯后修飾的蛋白和/或肽包括 N-糖基化蛋白和/或肽。
10.權(quán)利要求9的方法，其中通過肽N-糖苷酶F，酶促除去糖基化。
11.權(quán)利要求7-10的任一項(xiàng)的方法，其中在進(jìn)行步驟(c)后，使蛋白分子的其余亞組進(jìn) 行另外的步驟(a)-(c)的循環(huán)，并且其中步驟(c)包括從至少第二亞組的蛋白分子除去翻 譯后修飾。
12.權(quán)利要求11的方法，其中第二亞組的分離的翻譯后修飾的蛋白和/或肽包括C-糖基化蛋白和/或肽。
13.權(quán)利要求1-12的任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括通過質(zhì)譜分析分離的蛋白和/或肽。
14.權(quán)利要求1-13的任一項(xiàng)的方法，其中該方法以高通量形式進(jìn)行。
15.權(quán)利要求1-14的任一項(xiàng)的方法用于進(jìn)行定性和/或定量蛋白組分析的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過使特定蛋白/肽標(biāo)記方案與待分析的翻譯后修飾的蛋白和/或肽的特異性選擇進(jìn)行組合，從復(fù)雜樣品中選擇性富集翻譯后修飾的蛋白和/或肽，其中所述翻譯后修飾是糖基化。
文檔編號C07K1/14GK101874037SQ200880117644
公開日2010年10月27日 申請日期2008年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月26日
發(fā)明者E·P·羅米恩, H·M·維澤, R·霍夫曼 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司