專利名稱：生產(chǎn)成熟的重組螨i類變應(yīng)原的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)成熟的重組螨I類變應(yīng)原的方法。
背景技術(shù)：
WO 01/29078，實(shí)施例2描述了在巴斯德畢赤氏酵母(Pichia Pastoris)中生產(chǎn) Der fl，包括在YPD培養(yǎng)基中pH 6下培養(yǎng)以生產(chǎn)pro-Der fl?；厥张囵B(yǎng)介質(zhì)的上清液并 用pH 4. 5緩沖液稀釋，并在用pH 4. 5緩沖液平衡的SP-S印harose柱中運(yùn)行。用20-25柱 體積的具有線性NaCl梯度的pH 4. 5緩沖液洗脫蛋白質(zhì)。這種方法生產(chǎn)Der Π的兩種成 熟形式，其中一種與另一種相比具有在氨基末端的兩個(gè)額外氨基酸。一般認(rèn)為，巴斯德畢 赤氏酵母(P.pastoris)能生產(chǎn)前體并將其裂解從而生產(chǎn)成熟形式。在WO 01/29078的實(shí) 施例12中，其推測(cè)pro-Der fl經(jīng)歷自處理并被制備成在活性部位具有突變的惰性突變體 (inactive mutant)。制備得到Der pi的相應(yīng)突變體。在實(shí)施例12中沒(méi)有指出表達(dá)所述 突變體的方法。
Yasuhara 等人(Clinical and Experimental Allergy, 2001, Volume 31, pages 116-124)描述了一種生產(chǎn)rDer fl的方法，其中野生型Der fl的前體的表達(dá)是在如下步驟 中獲得的使巴斯德畢赤氏酵母在BMMY培養(yǎng)基中pH 6.0下生長(zhǎng)48-72小時(shí)，然后通過(guò)離心 收獲上清液。通過(guò)在4°C下對(duì)IOOmM乙酸酯緩沖液(pH 4.0)透析48小時(shí)，自催化地實(shí)現(xiàn)體 外活化。Jacquet 等人(Clin Exp Allergy 2002，32_1048_1053)公開(kāi)了 Der pi 的生產(chǎn)，包 括在緩沖的最小葡萄糖(BMG)培養(yǎng)基中培育巴斯德畢赤氏酵母，所述巴斯德畢赤氏酵母含 有具有編碼proDer pi的cDNA的質(zhì)粒。通過(guò)每天加入甲醇0. 5%來(lái)誘導(dǎo)表達(dá)。通過(guò)離心 收集上清液。所收集的proDer pi在柱上并通過(guò)超濾進(jìn)行純化。通過(guò)Der pi的自催化處 理使純化的proDer pi經(jīng)受熟化，所述自催化處理是通過(guò)對(duì)IOOmM醋酸鈉緩沖液pH 4的透 析。De Halleux 等人(J Allergy Clin Immunol, 2006)公開(kāi)了野生型 rproDer pi 的 生產(chǎn)和rproDer pi的N52Q非糖基化突變體。使用pPICZ α C作為表達(dá)載體在巴斯德畢赤 氏酵母Χ-33中進(jìn)行表達(dá)。所述培養(yǎng)物在30°C下在指定的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后在30下 用甲醇誘導(dǎo)所述培養(yǎng)物3天。在培養(yǎng)和誘導(dǎo)期間將所述培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至6.0。對(duì)所述由 發(fā)酵產(chǎn)生的培養(yǎng)混合物進(jìn)行離心并將上清液對(duì)25mmol/L醋酸鈉緩沖液pH 4. 5進(jìn)行透析， 并且在4. 5C下保持約3-4天用于pro-Der pi和pro-Der plN52Q成為成熟的變應(yīng)原的自 熟化。然后通過(guò)在SP-S^harose上的陽(yáng)離子交換以及附加的步驟進(jìn)行純化。本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)重組成熟螨I類變應(yīng)原的改進(jìn)方法。發(fā)明概述本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了此目的，即涉及一種生產(chǎn)成熟的重組螨I類變應(yīng)原的方法，所述方 法包括以下步驟a)提供宿主細(xì)胞形式的變應(yīng)原表達(dá)系統(tǒng)，所述宿主細(xì)胞選自包含載體的酵母，所述載體含有編碼前變應(yīng)原的cDNA， b)在5. 5-7. 5的培養(yǎng)PH下培養(yǎng)所述變應(yīng)原表達(dá)系統(tǒng)一定的培養(yǎng)期以表達(dá)前變應(yīng)
原，從而獲得包含前變應(yīng)原的培養(yǎng)混合物， C)將培養(yǎng)混合物的PH調(diào)節(jié)至3. 5-5. 0的熟化pH，d)將所述培養(yǎng)混合物在熟化pH下維持一定的熟化期以將所述前變應(yīng)原轉(zhuǎn)變成成 熟的變應(yīng)原，從而獲得產(chǎn)物混合物，和e)使所述產(chǎn)物混合物經(jīng)歷純化方法，以從產(chǎn)物混合物中分離成熟的變應(yīng)原。本發(fā)明是基于可能在培養(yǎng)混合物中進(jìn)行前變應(yīng)原的熟化以獲得成熟的變應(yīng)原的 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其中表達(dá)是在沒(méi)有任何從培養(yǎng)混合物中的在先分離或純化產(chǎn)物的情況下進(jìn)行 的。這種方法與現(xiàn)有技術(shù)方法相比具有許多優(yōu)點(diǎn)。第一，本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單，因?yàn)槠湓试S在 同一反應(yīng)器中進(jìn)行表達(dá)和熟化，由此省去了對(duì)單獨(dú)熟化步驟的需要。第二，在完成表達(dá)之后 可立即進(jìn)行熟化而無(wú)需任何居間的純化步驟，這使得可能更有效地控制熟化方法，特別是 避免在純化步驟下發(fā)生不受控制的熟化。本發(fā)明方法的第三個(gè)優(yōu)點(diǎn)是縮短成熟期，這對(duì)將前變應(yīng)原和成熟變應(yīng)原的降解減 到最小很重要，由此提高產(chǎn)率。第四個(gè)優(yōu)點(diǎn)是在熟化期期間中允許繼續(xù)表達(dá)和分泌，這提高了產(chǎn)率和/或允許縮 短表達(dá)期。第五個(gè)優(yōu)點(diǎn)是純化步驟簡(jiǎn)單化，因?yàn)閮H僅分離變應(yīng)原的成熟形式，而在現(xiàn)有技術(shù) 的方法中表達(dá)步驟通常會(huì)產(chǎn)生包含前變應(yīng)原和成熟變應(yīng)原的混合物的發(fā)酵產(chǎn)品，這使得需 要額外的純化步驟。


圖1顯示出在熟化期期間內(nèi)在0、3和18小時(shí)時(shí)獲得的培養(yǎng)混合物樣品的 SDS-PAGE。發(fā)明詳述螨I類變應(yīng)原通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的螨I類變應(yīng)原可以是任何已知的無(wú)氣門目 (orderAstigmata)的螨I類變應(yīng)原，特別是選自粉螨總科(Acaroidea)、嗜甜螨總科 (Glycyphagoidea)和羽螨總科(Analgoidea)的變應(yīng)原，更特別是選自粉螨科(Acaridae)、 嗜甜螨科(Glycyphagidae)、棘鼠螨科(Echimyopodidae)和蚍螨科(Pyroglyphidae)的變 應(yīng)原，更特別是選自粉螨屬(Acarus)、無(wú)爪螨屬(Blomia)、塵螨屬(Dermatophagoides)、嗜 霉螨屬(Euroglyphus)、食甜螨屬(Glycyphagus)、嗜鱗螨屬(L印idoglyphus)和食酪螨屬 (Tyrophagus)的變應(yīng)原。在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，所述螨I類變應(yīng)原選自Aca sUBlo tl、Der fl、Der pl、Eur mUGly dULep dl 和 Tyr pi。特別是所述螨 I 類變應(yīng)原選自 Blo tl、Der fl、Der pi和Eur ml。更具體而言，所述螨I類變應(yīng)原是Der pi。 此外，通過(guò)本發(fā)明方法生產(chǎn)的螨I類變應(yīng)原可以是上述變應(yīng)原的天然存在的同等 型，以及上述變應(yīng)原的突變的變體，例如通過(guò)重組技術(shù)制備的突變的變體。例如，可以進(jìn)行 突變以獲得野生型變應(yīng)原的低變應(yīng)原變體，以使變應(yīng)原更穩(wěn)定和/或更易于表達(dá)和純化以 及以改變變應(yīng)原的糖基化類型，例如通過(guò)取代帶有聚糖側(cè)鏈的氨基酸。
變應(yīng)原表汰系統(tǒng)所述宿主細(xì)胞可以是任何適于本目的的酵母，特別是酵母目 (Saccharomycetales)的酵母，更特別是選自畢赤氏酵母屬(Pichia)、糖酵母屬 (Saccharomyces)和假絲酵母屬(Candida)的酵母。在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是糖酵母科(saccharomycetaceae)的，更特別是選自畢赤氏酵母屬(Pichia)和糖酵 母屬(Saccharomyces)，以及最特別是選自巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastohs)和釀酒酵 母(Saccharomyces cerevisiae)。所述載體(vector)可以為用作編碼前變應(yīng)原的DNA的轉(zhuǎn)運(yùn)體(carrier)的任何 傳統(tǒng)載體，并且其可以被引入到寄主細(xì)胞中并在其中表達(dá)。所述載體特別可以是質(zhì)粒或噬 菌體。合適的載體的示例是大腸桿菌(E. coli)/巴斯德畢赤氏酵母穿梭載體pGAPZaA、 pPICZ α A、pPICZ α B、pPICZ α C、pPIC9K 和 pHIL-Sl。在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述載體包括組成型啟動(dòng)子，例如編碼甘油 醛-3-磷酸脫氫酶的GAP基因的啟動(dòng)子。在本發(fā)明另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述載體包 括甲醇-可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，例如AOX啟動(dòng)子。在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述載體包 括用于分泌的信號(hào)序列，例如釀酒酵母α因子和ΡΗ01。在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述酵母是巴斯德畢赤氏酵母且所述載體是 pGAPZa A。在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，修飾所述變應(yīng)原的氨基酸序列以使得在分子的 C-末端包含許多組氨酸殘基。這種組氨酸殘基的序列，通常被認(rèn)為是HIS-標(biāo)簽(HIS-tag)， 形成供親和色譜法使用的金屬結(jié)合位點(diǎn)，用于簡(jiǎn)化從發(fā)酵液體混合物中純化重組分子。前變應(yīng)原的表達(dá)在5. 5-7. 5的培養(yǎng)pH下培養(yǎng)所述變應(yīng)原表達(dá)系統(tǒng)一定的培養(yǎng)期以表達(dá)前變應(yīng)原， 從而獲得包含前變應(yīng)原的培養(yǎng)混合物。具體而言，所述培養(yǎng)PH為5. 8-7. 2之間，更優(yōu)選 6. 0-7. 0，更優(yōu)選 6. 2-6. 8。在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)期為12小時(shí)-144小時(shí)，優(yōu)選24小 時(shí)-120小時(shí)，更優(yōu)選48小時(shí)-96小時(shí)。proDer pi 向成熟 Der pi 的熟化將培養(yǎng)混合物的pH調(diào)節(jié)至3. 5-5. O的熟化pH。在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中， 所述熟化PH是3. 7-4. 8，更特別是3. 9-4. 6，并最特別是4. 0-4. 5。在本發(fā)明另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述熟化期是8小時(shí)-30小時(shí)，特別是12小 時(shí)-26小時(shí)，更特別是14小時(shí)-24小時(shí)，更特別是16小時(shí)-22小時(shí)并且最特別是17小 時(shí)-21小時(shí)。純化方法用于從發(fā)酵液體混合物中分離蛋白質(zhì)產(chǎn)物的任何常規(guī)方法都可以用在本發(fā)明的 方法中作為純化方法，以從熟化所得到的產(chǎn)物混合物中分離成熟的變應(yīng)原。合適的純化方法的實(shí)例是離心法、過(guò)濾法、超濾法、透濾法、透析法、膠濾法、沉淀 法、親和色譜法以及這些方法的組合。定義關(guān)于本發(fā)明，使用以下定義
術(shù)語(yǔ)“前變應(yīng)原”是指變應(yīng)原分子的前體，即包含成熟部分和分子的前肽的變應(yīng)原分子。
實(shí)施例實(shí)施例1 重組Der pi的牛產(chǎn)本實(shí)施例提供一種在巴斯德畢赤氏酵母中表達(dá)pro-Der pi型之后生產(chǎn)成熟的重 組Der pi的方法。前體的熟化是在發(fā)酵容器中進(jìn)行的，通過(guò)在確定的時(shí)段內(nèi)調(diào)節(jié)pH至4. 0 以使所有的pro-Der pi都被加工成隨后被純化的成熟的Der pi分子。rproDer pi 變體的構(gòu)建通過(guò)PCR構(gòu)建局部遺傳密碼最優(yōu)化的rproderpl野生型(wt)(從現(xiàn)在起寫為 rproderpl)cDNA，所述cDNA包含用于rproDer plwt (從現(xiàn)在起寫為rproDer pi)的完整編 碼區(qū)域并具有額外的IOaa C-末端His標(biāo)簽。所述編碼的rproDerpl蛋白質(zhì)相當(dāng)于具有額 外V204A的UniProt登記號(hào)P08176的proDer pi區(qū)域(aa 19-320)(貫穿本實(shí)施例的aa編 號(hào)是從proDer pi的第一個(gè)aa開(kāi)始)，其是天然存在的變體。分別使用正向引物和反向引 物以產(chǎn)生在5'和3'末端附近具有引入的Xhol和Xbal限制性位點(diǎn)的964bp片段。將該 rproderpl基因克隆到pCR4_TOP0中，轉(zhuǎn)化到TOPlO(Invitrogen)中并驗(yàn)證序列。隨后使 用限制酶Xhol和Xbal通過(guò)定向克隆將rproder pi基因再克隆到大腸桿菌/巴斯德畢赤 氏酵母穿梭載體PGAPZaA中。這產(chǎn)生具有釀酒酵母α因子下游的rproDer pi編碼區(qū)域的 質(zhì)粒rproderpl，所述釀酒酵母α因子在兩個(gè)蛋白質(zhì)之間具有促進(jìn)重組蛋白質(zhì)分泌的Kex2 裂解位點(diǎn)。所述質(zhì)體最初被轉(zhuǎn)化入E. coli T0P10細(xì)胞中。通過(guò)重疊延伸法(overlap extension method)完成位點(diǎn)特異突變體W32D的構(gòu) 建。簡(jiǎn)言之，在一個(gè)PCR反應(yīng)中，正向引物1與反向引物7—起使用，在另一個(gè)PCR反應(yīng)中 反向引物3與正向引物6 —起使用，以及在第三個(gè)PCR反應(yīng)中反向引物2與正向引物8 一 起使用，所有都以proderpl作為模板。通過(guò)在最后的PCR反應(yīng)中一起使用所述三個(gè)生成 的PCR產(chǎn)物以及引物1和2產(chǎn)生含有突變得完全片段，繼之以將957bp Xhol-Xbal片段定 向克隆到pGAPZaA中，如為proderpl所描述的，產(chǎn)生質(zhì)體rproderpl_N132D (從現(xiàn)在起寫為 rproderpl-N)。rproDer pi變體的表達(dá)和純化根據(jù)制造商的操作流程將pGAPZ α A-rproderp 1_Ν轉(zhuǎn)化到巴斯德畢赤氏酵母 X33wt菌株(Invitrogen)中。將克隆重復(fù)劃線在YPDZ-瓊脂平板上并檢查表達(dá)。如制造 商(Invitrogen)提供的操作流程所描述，培養(yǎng)表達(dá)rproDer pl_N132E的巴斯德畢赤氏酵 母X33: :rproder pl_N克隆(從現(xiàn)在起寫為rproDer pl_N)，簡(jiǎn)言之，用來(lái)自單個(gè)菌落的 細(xì)胞接種5ml YPDZ培養(yǎng)基(YPD+100 μ g/ml Zeocin)并使其在震蕩器中于220rpm 30°C下 生長(zhǎng)過(guò)夜。2ml的該培養(yǎng)物用于接種400ml的新鮮YPD (酵母提取物/蛋白胨/葡萄糖)培 養(yǎng)基，在使用所述YPD培養(yǎng)基用于接種待用于發(fā)酵的3. 61的YPD培養(yǎng)基之前，先將所述YPD 培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜。在 5L 最大容量的容器中，在 B. Braun-Biotech Internationalsystem(BI0STAT B-DCU型)中以以下基本發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵
-溫度30°C_800rpm的攪拌速度-0. 8體積每分鐘的氣流供給_pH最初控制在pH 6. 5，通過(guò)自動(dòng)加入30% NH4OH或5% H2S04。發(fā)酵是在稱為YPD的復(fù)合物培養(yǎng)基中進(jìn)行的，所述YPD的成份為酵母提取物、 2%大豆蛋白胨和2%葡萄糖。通過(guò)在600nm處的光密度測(cè)量來(lái)控制生長(zhǎng)培養(yǎng)物的細(xì)胞密 度?？刂评肞O2電極測(cè)量的溶解氧以便于進(jìn)行細(xì)胞分裂(低的PO2水平表明由于高細(xì)胞 活動(dòng)的高耗氧量，而增加的PO2水平表明由于例如碳源耗盡的低細(xì)胞活動(dòng)或細(xì)胞分裂)。如 果加入碳源是必需的，將包含5%葡萄糖、13. 4%酵母氮堿(YNB)和0. 02%生物素的溶液加 入到進(jìn)行中的培養(yǎng)物。pH調(diào)節(jié)以及proDer pi向成熟Der pi的熟化以6. 5的受控pH發(fā)酵48h之后，所表達(dá)的重組產(chǎn)物是r-pro-Der pl，其可以通過(guò) SDS-PAGE進(jìn)行驗(yàn)證。為了開(kāi)始熟化過(guò)程，將pH減小至pH 4. 0并維持在該水平上，同時(shí)使 其它發(fā)酵條件保護(hù)不變。在酸性PH下18小時(shí)后，觀察到僅有成熟的r-Der pl作為重組產(chǎn) 物，參見(jiàn)圖1。在進(jìn)行分離成熟的r-Der pl時(shí)，為了避免更多的蛋白酶活性，將pH升至pH 8.0，并收集培養(yǎng)物。純化方法通過(guò)離心和隨后的過(guò)濾從酵母細(xì)胞中澄清(clarify)并分離包含所分泌的重組產(chǎn)物的培養(yǎng)液。分兩步進(jìn)行(NH4) 2S04(硫酸銨)沉淀法，第一步達(dá)到1. 8M的(NH4)2SO4濃度， 繼之分離沉淀的和可溶的產(chǎn)物，和在第二步中，使第一步后獲得的上清液達(dá)到3. 2M的鹽濃 度。這樣高的鹽濃度誘導(dǎo)重組產(chǎn)物從來(lái)自第一步的上清液(其包含許多蛋白質(zhì)污染物)中 選擇性沉淀，由此使得所述重組產(chǎn)物的純化。所有這些步驟都是在4°C下進(jìn)行。離心后，使 成團(tuán)塊的沉淀物從在高鹽濃度下可溶的組分中分離，并將所述團(tuán)塊貯藏在-20°C下。通過(guò)親和色譜法，根據(jù)透析樣品的BD-TALON金屬親合力(BD Biosciences)實(shí)現(xiàn) 重組產(chǎn)物(成熟的r-Der pl)的進(jìn)一步純化。通過(guò)組氨酸標(biāo)簽將所述重組產(chǎn)物精特異性地 與柱結(jié)合，并通過(guò)加入咪唑的色譜緩沖液(50mM磷酸鈉，300mMNaCl，pH 8.0)至300mM的終 濃度進(jìn)行洗脫。在4°C下，在AKTAexplorer平臺(tái)上進(jìn)行色譜步驟。將洗脫峰對(duì)緩沖液鹽水 進(jìn)行透析并且樣品保持冷藏。結(jié)論從上可知，本實(shí)施例表明可以在同一反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)以表達(dá)所述前變應(yīng)原及其 熟化，即在熟化之前沒(méi)有任何從培養(yǎng)混合物的殘余組分中分離前變應(yīng)原的步驟。同時(shí)，該實(shí) 施例表明可在比較短的時(shí)段(18小時(shí))內(nèi)進(jìn)行熟化。
權(quán)利要求
一種生產(chǎn)成熟的重組螨I類變應(yīng)原的方法，包含以下步驟a)提供宿主細(xì)胞形式的變應(yīng)原表達(dá)系統(tǒng)，所述宿主細(xì)胞選自包含載體的酵母，所述載體含有編碼前變應(yīng)原的cDNA，b)在5.5-7.5的培養(yǎng)pH下培養(yǎng)所述變應(yīng)原表達(dá)系統(tǒng)一定的培養(yǎng)期以表達(dá)前變應(yīng)原，從而獲得包含前變應(yīng)原的培養(yǎng)混合物，c)將培養(yǎng)混合物的pH調(diào)節(jié)至3.5-5.0的熟化pH，d)將所述培養(yǎng)混合物在熟化pH下維持一定的熟化期以將所述前變應(yīng)原轉(zhuǎn)變成成熟的變應(yīng)原，從而獲得產(chǎn)物混合物，和e)使所述產(chǎn)物混合物經(jīng)歷純化方法，以從產(chǎn)物混合物中分離成熟的變應(yīng)原。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述酵母選自由畢赤氏酵母屬、糖酵母屬和假絲酵 母屬組成的組。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述酵母是巴斯德畢赤氏酵母。
4.如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述載體選自質(zhì)粒和噬菌體。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述載體是質(zhì)粒。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述載體選自pGAPZα A、pPICZ α A、pPICZ α B、 pPICZα C、pPIC9K 和 pHIL-Sl。
7 如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述載體是pGAPZα A。
8.如權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述培養(yǎng)期為12小時(shí)-144小時(shí)，優(yōu)選 24小時(shí)-120小時(shí)，更優(yōu)選48小時(shí)-96小時(shí)。
9.如權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述熟化期是8小時(shí)-30小時(shí)，優(yōu)選 12小時(shí)-26小時(shí)，更優(yōu)選14小時(shí)-24小時(shí)，更優(yōu)選16小時(shí)-22小時(shí)和最優(yōu)選17小時(shí)-21 小時(shí)。
10.如權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述培養(yǎng)pH為5.8-7. 2，更優(yōu)選 6. 0-7. 0，更優(yōu)選 6. 2-6. 8。
11.如權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述熟化pH是3.7-4. 8，更優(yōu)選 3. 9-4. 6，并最優(yōu)選 4. 0-4. 5。
12.如權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述螨I類變應(yīng)原選自Acasl、 Blotl、Derfl、Derpl、Eurml、Gydl、I^pdl 禾口 Tyrpl0
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述螨I類變應(yīng)原選自Blotl、DerfUDerpl和 Eurml。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述螨I類變應(yīng)原是Derpl。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)成熟的重組螨I類變應(yīng)原的方法，所述方法包括以下步驟a)提供宿主細(xì)胞形式的變應(yīng)原表達(dá)系統(tǒng)，所述宿主細(xì)胞選自包含載體的酵母，所述載體含有編碼前變應(yīng)原的cDNA，b)在5.5-7.5的培養(yǎng)pH下培養(yǎng)所述變應(yīng)原表達(dá)系統(tǒng)一定的培養(yǎng)期以表達(dá)前變應(yīng)原，從而獲得包含前變應(yīng)原的培養(yǎng)混合物，c)將培養(yǎng)混合物的pH調(diào)節(jié)至3.5-5.0的熟化pH，d)將所述培養(yǎng)混合物在熟化pH下維持一定的熟化期以將所述前變應(yīng)原轉(zhuǎn)變成成熟的變應(yīng)原，從而獲得產(chǎn)物混合物，和e)使所述產(chǎn)物混合物經(jīng)歷純化方法，以從產(chǎn)物混合物中分離成熟的變應(yīng)原。
文檔編號(hào)C07K14/435GK101821286SQ200880110787
公開(kāi)日2010年9月1日 申請(qǐng)日期2008年10月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月8日
發(fā)明者D·B·埃爾南德斯, R·I·孟薩爾維克萊門蒂 申請(qǐng)人:阿爾克-阿貝洛有限公司