專利名稱：經(jīng)修飾的植物防衛(wèi)素的制作方法
經(jīng)修飾的植物防衛(wèi)素發(fā)明背景 植物以組成性或誘導(dǎo)型的方式產(chǎn)生各種化學(xué)化合物，以保護(hù)其自身免于環(huán)境脅 迫、創(chuàng)傷或微生物侵襲。在由植物精心制作的化學(xué)防御中，防御相關(guān)蛋白質(zhì)的從頭合成具有關(guān)鍵重要性 (參見(jiàn) Lay，F(xiàn). Τ.等人(2005)，Curr. Protein Pept. Sci. 6 85-101 以及其中所引用的參考 文獻(xiàn))。一套防御相關(guān)蛋白質(zhì)可以組成性地表達(dá)和/或由于食草動(dòng)物或微生物侵襲造成創(chuàng) 傷而被誘導(dǎo)。如此，這些蛋白質(zhì)分別形成感染前和感染后防御屏障。這些蛋白質(zhì)的例子包 括酶抑制劑例如α -淀粉酶和蛋白酶抑制劑，水解酶例如1，3_β -葡聚糖酶和殼多糖酶，以 及其他低分子量、富含半胱氨酸的抗微生物蛋白質(zhì)?？刮⑸锘衔锢缪趸宇?lèi)、單寧類(lèi) 和其他低分子量次生代謝物(例如植物抗毒素)的積累也在植物的化學(xué)防御策略中發(fā)揮重 要作用。在迄今已表征的植物抗微生物蛋白質(zhì)中，大部分共享共同特征。它們一般是小的 (< lOkDa)、高度堿性的蛋白質(zhì)，并且常常包含偶數(shù)數(shù)目的半胱氨酸殘基(通常為4、6或 8個(gè))。這些半胱氨酸全都參與分子內(nèi)二硫鍵，并且給所述蛋白質(zhì)提供了結(jié)構(gòu)和熱力學(xué)穩(wěn) 定性(Broekaert, W. F.等人(1997) Crit. Rev. Plant Sci. 16 :297_323)。基于氨基酸序列 同一性(主要關(guān)于半胱氨酸殘基的數(shù)目和間隔)，已定義了許多不同的家族。它們包括植 物防衛(wèi)素(Broekaert 等人(1997)同上；Broekaert, W. F.等人(1995) PlantPhysiol. 108 1353-1358 ；Lay, F. Τ.等人(2003)Plant Physiol. 131 1283-1293)、硫素(Bohlmann, H. (1994) Crit. Rev. Plant Sci. 13 1-16)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(Kader, J. C. (1997) Annu. Rev. PlantPhysiol. Plant Mol. Biol. 47 627-654 ；Kader, J. C. (1997)TrendsPlant Sci. 2 66-70)、橡膠蛋白(Broekaert，W. F.等人(1992)Biochemistry 32:4308-4314)和 knottin-類(lèi)型蛋白質(zhì)(Cammue, B. P.等人(1992)J. Biol. Chem. 267 :2228_2233)、以 及來(lái)自全緣葉澳洲堅(jiān)果(Macadamia integrifolia) (Marcus, J. P.等人(1997)Eur. J. Biochem. 244 :743_749 ；McManus, Α. Μ.等人(1999) J. Mol. Biol. 293 :629_638)和鳳仙 花(Impatiens balsamina)(Tailor, R. H.等人(1997)J. Biol. Chem. 272 :24480_24487 ； Patel，S. U.等人(1998)Biochemistry 37 :983_990)的抗微生物蛋白質(zhì)(表1)。所有這些 抗微生物蛋白質(zhì)看起來(lái)在靶微生物的質(zhì)膜水平上發(fā)揮其活性，盡管可能不同的蛋白質(zhì)家族 經(jīng)由不同的機(jī)制起作用(Broekaert等人(1997)同上)。大環(huán)寡肽(cyclotide)是小的、 富含半胱氨酸的植物肽的一個(gè)新家族，其在茜草科(Rubiaceae)和堇菜科(Violaceae)的 成員中常見(jiàn)(在 Craik, D. J.等人(1999) J. Mol. Biol. 294 1327-1336 ；Craik, D. J. (2001) Toxicon 39 1809 1813 ；Craik,D. J.等人(2004) Curr. Prot. Pept. Sci. 5 :297_315 中進(jìn)行 了綜述)。已將這些不尋常的環(huán)狀肽(表1)歸結(jié)于各種生物學(xué)活性，包括抗菌(Tam，J.P.等 人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96 :8913-8918)、抗-HIV (Gustafson，K. R.等人 (1994) J.Am. Chem. Soc. 116 :9337_9338)和殺昆蟲(chóng)(Jenning s, C.等人(2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 98 10614-10619)性質(zhì)。表 1
植物中的小的、富含半胱氨酸的抗微生物蛋白質(zhì) 顯示了植物抗微生物蛋白質(zhì)的代表性成員的成熟蛋白質(zhì)的大小和半胱氨酸殘基 的間隔。共有序列中的數(shù)目代表了高度保守的半胱氨酸殘基之間的氨基酸數(shù)目。二硫化物 連接狀況通過(guò)連接線給出。大環(huán)寡肽的環(huán)狀主鏈通過(guò)虛線來(lái)描繪。(來(lái)自Lay和Anderson 2005)植物防衛(wèi)素是小的( 5kDa，45至54個(gè)氨基酸)、堿性的、富含半胱氨酸的(通 常為8個(gè)半胱氨酸殘基)蛋白質(zhì)。這個(gè)家族的第一批成員分離自大麥(Mendez，E.等人 (1990)Eur. J. Biochem.，194 :533_539)和小麥(Colilla，F(xiàn). J.等人(1990)FEBS Lett. 270 191-194)的胚乳，并且被提出形成了硫素家族的新亞類(lèi)(Y-硫素)，其不同于α-和亞 類(lèi)(Bohlmarm等人(1994)同上)。因此，這些大麥和小麥蛋白質(zhì)分別被稱為Y 1_大麥硫 素(y Ι-hordothionin) ( γ 1_Η)以及 γ 1-和 γ 2-嘌呤硫素(Y I-P 和 Y 2-Ρ) (Mendez 等 人(1990)同上；Colilla等人(1990)同上)。它們最初被分配為硫素家族的Y -硫素亞類(lèi) 是基于在大小、電荷和半胱氨酸含量方面與α-和β-硫素的相似性，然而，半胱氨酸的間隔顯著不同(Bohlmann(1994)同上；Mendez等人(1990)同上；Colilla等人(1990)同上) (表1,

圖1)。在隨后數(shù)年中，鑒定出了眾多其他Y-硫素樣蛋白質(zhì)，作為純化的蛋白質(zhì)，或者從 單子葉和雙子葉植物的CDNA推導(dǎo)出的蛋白質(zhì)(在Broekaert等人(1997)和(1995)(同上) 中進(jìn)行了綜述)。“植物防衛(wèi)素”這一名稱在1995年由Terras及同事創(chuàng)造出，他們從蘿卜 種子中分離出了兩種抗真菌蛋白質(zhì)(Rs-AFPl和RS-AFP2)，并且注意到這些蛋白質(zhì)在一級(jí) 和三維結(jié)構(gòu)水平上與昆蟲(chóng)防衛(wèi)素比與植物硫素更相關(guān)(Terras，F(xiàn). R. G.等人(1995)Plant Cell 7:573-588)。
植物防衛(wèi)素具有遍及植物界的廣泛分布，并且可能存在于大多數(shù)(如果不是全 部)植物中(Broekaert (1997)和(1995)同上；Osborn, R. W.等人(1995) FEBS Lett. 368 257-262 ；Osborn, R. W.等人(1999) Seed proteins (Shewry, P. R.和 Casey，R.編輯)第 727-751 Μ, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht ；Shewry, P. R.等)κ (1997)Adv. Bot. Res. 26 135-192) 0大多數(shù)植物防衛(wèi)素已從豐富地含有它們的種子中分離出來(lái)，并 且已在分子、生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)水平上進(jìn)行了表征(Broekaert等人(1995)同上；Thomma， B. P. H. J.等人(2003) Curr. Drug. Targets-Infect. Dis. 3 :1_8)。還已在其他組織中鑒定出 了防衛(wèi)素，包括葉(Terras 等人(1995)同上；Kragh，K. M.等人(1995)Mol. Plant-Microbe Interact. 8 424-434 ；Yamada S.等人(1997)Plant Physiol. 115 314 ；Komori, T.等人 (1997) PlantPhysiol. 115 ；314 ；Segura, A.等人(1998) FEBS Lett. 435 :159_162)、莢果 (Chiang, C. C.等人(1991)Mol. Plant-MicrobeInteract. 4 :324_331)、塊莖(Moreno, M.等 人(1994)Eur. J. Biochem 223 :135_139)、果實(shí)(Meyer,B.等人(1996)Plant Physiol. 112 615-622 ；Aluru, M.等人(1999)Plant Physiol. 120 633 ；ffisniewski, Μ. Ε.等人(2003) Physiol. Plant. 119 :563_572)、根(Sharma,P.等人(1996)Plant Mol. Biol 31 :707_712)、 樹(shù)皮(ffisniewski等人(2003)同上)和花組織(Lay等人2003同上；Moreno等人(1994) 同上；Gu，Q.等人(1992)Mol. Gen. Genet. 234 :89-96 ;Milligan，S. B.等人(1995)Plant Mol. Biol. 28 :691_711 ；Karunanandaa, B.等人(1994)Plant Mol. Biol. 26 :459_464 ；Li, H. -Y.等人(1999) Plant Physiol. 120 633 ；Urdangarin,M. C.等人(2000) Plant Physiol. Biochem. 38 :253_258 ；van den Heuve 1, K. J. P. Τ.等人(2001) J. Exp. Bot. 52 1427-1436 ； Park, C. H.等人(2001) Plant Mol. Biol. 50 :59_69)。Lay等人(2005)(同上)發(fā)表了幾種鑒定出的防衛(wèi)素(作為純化的蛋白質(zhì)或從 cDNA推導(dǎo)出的蛋白質(zhì))的氨基酸序列比對(duì)。其他植物防衛(wèi)素公開(kāi)在于2003年6月28日 授權(quán)的美國(guó)專利6，911，577 ；于2000年3月2日公布的國(guó)際公開(kāi)WO 00/11196 ；和于2005 年2月15日授權(quán)的美國(guó)專利6，855，865中。植物防衛(wèi)素展現(xiàn)出清楚的(雖然相對(duì)有限的) 序列保守。嚴(yán)格保守的是8個(gè)半胱氨酸殘基(相對(duì)于RS-AFP2進(jìn)行編號(hào))。在大多數(shù)情況 下，兩個(gè)甘氨酸(位置13和34)、絲氨酸(位置8)、芳香族殘基(位置11)和谷氨酸(位置 29)也是保守的。兩類(lèi)植物防衛(wèi)素根據(jù)從cDNA克隆預(yù)測(cè)的前體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，可以將植物防衛(wèi)素分成兩個(gè)主要類(lèi) 別(Lay等人2003同上)(圖2A-2B)。在第一個(gè)目.最大的類(lèi)別中，前體蛋白質(zhì)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER) 信號(hào)序列和成熟防衛(wèi)素結(jié)構(gòu)域組成。這些蛋白質(zhì)進(jìn)入分泌途徑，并且不具有明顯的用于翻譯后修飾或亞細(xì)胞靶向的信號(hào)( Δ)。
第二類(lèi)防衛(wèi)素作為具有長(zhǎng)度為約33個(gè)氨基酸的C-末端前結(jié)構(gòu)域或前肽(CTPP) 的更大的前體而產(chǎn)生( 2)。大多數(shù)這些防衛(wèi)素已在茄科物種中得到鑒定，在這些茄 科物種中它們?cè)诨ńM織(Lay等人2003同上；Gu等人(1992)同上；Milligan, S. B.等人 (1995)PlantMol. Biol. 28 :691_711 ；Brandstadter, J.等人(1996)Mol. Gen. Genet. 252 146-154)和果實(shí)(Aluru等人(1999)同上)中組成性地表達(dá)。此外，也可以在某些煙草屬 (Nicotiana)物種的葉中通過(guò)鹽脅迫來(lái)誘導(dǎo)防衛(wèi)素表達(dá)(Yamada等人(1997)同上；Komori 等人(1997)同上)。來(lái)自花煙草(Nicotiana alata) (NaDl)和碧冬茄(Petunia hybrida) (PhDl和PhD2)的茄科防衛(wèi)素的前結(jié)構(gòu)域在成熟過(guò)程中通過(guò)蛋白水解而被去除(Lay等人 2003同上)。在茄科防衛(wèi)素上的C-末端前結(jié)構(gòu)域具有不尋常地高含量的酸性和疏水性氨 基酸(參考圖3A-3D)。有趣的是，在中性pH下，前結(jié)構(gòu)域的負(fù)電荷平衡防衛(wèi)素結(jié)構(gòu)域 的正電荷(圖3C)。這個(gè)特征令人想起哺乳動(dòng)物防衛(wèi)素(Michaelson，D.等人(1992) J. Leucoc. Biol. 51 :634_639 ；Yount, N. Y.等人(1995) J. Immunol. 155 4476-4484)和昆 蟲(chóng)防衛(wèi)素(Lowenberger, C. A.等人(1999) Insect Mol. Biol. 8 :107_118)，以及植物硫素 (Bohlmann (1994)同上；Romerο, A.等人(1997)Eur. J. Biochem. 243 :202_208)上存在的前 結(jié)構(gòu)域(也稱為前片或前區(qū)段)。然而，一個(gè)差異是哺乳動(dòng)物和昆蟲(chóng)防衛(wèi)素中的前結(jié)構(gòu)域位 于防衛(wèi)素結(jié)構(gòu)域的N-末端側(cè)上。盡管具有C-末端前結(jié)構(gòu)域的防衛(wèi)素在茄科中最常見(jiàn)，但 它們并不限于這個(gè)植物科。來(lái)自玉蜀黍(Zea mays)(禾本科(Poaceae))的ZmESR-6編碼 具有長(zhǎng)度為28個(gè)氨基酸的C-末端結(jié)構(gòu)域的防衛(wèi)素，該C-末端結(jié)構(gòu)域富含疏水和酸性氨基 酸并且是潛在的液泡靶向信號(hào)(圖3B，圖3D)。還鑒定了向日葵(菊科(Asteraceae))防 衛(wèi)素Ha-DEFl，其編碼具有C-末端前結(jié)構(gòu)域的前體蛋白質(zhì)(de Zelicourt A.等人(2007) Planta 226 :591_600)。有趣的是，它的長(zhǎng)度為30個(gè)氨基酸的C-末端結(jié)構(gòu)域攜帶不尋常的 總體正電荷。蛋白質(zhì)和DNA數(shù)據(jù)庫(kù)也描述了相應(yīng)于另一個(gè)類(lèi)別的嵌合防衛(wèi)素蛋白質(zhì)的序列 (S 3D)。這些嵌合防衛(wèi)素具有長(zhǎng)度為50個(gè)氨基酸或更多個(gè)氨基酸的C-末端結(jié)構(gòu)域，其富 含脯氨酸并且不類(lèi)似于液泡靶向信號(hào)(圖3D)。已提出了 C-末端前結(jié)構(gòu)域的幾種可能的作用。一種假設(shè)是，它可能充當(dāng)靶向序 列以用于亞細(xì)胞分選。對(duì)于人嗜中性粒細(xì)胞α _防衛(wèi)素1 (HNP-I)的前結(jié)構(gòu)域提出了此種 功能，在其中它可能對(duì)于正常的亞細(xì)胞運(yùn)輸和翻譯后蛋白水解加工是重要的[Liu，L.等人 (1995)Blood85 1095-1103]。類(lèi)似地，植物硫素上的前結(jié)構(gòu)域看起來(lái)在液泡靶向和加工中 具有作用(Romero等人(1997)同上)。在對(duì)花煙草花藥和子房的超薄切片施行的免疫金電子顯微鏡術(shù)實(shí)驗(yàn)中，Lay及同 事(Lay等人2003同上)證明，NaDl特異地位于液泡中。這與經(jīng)充分研究的缺乏前結(jié)構(gòu) 域的種子防衛(wèi)素例如Rs_AFP2(蘿卜)和alfAFP(苜蓿)的細(xì)胞外定位明顯不同(Terras 等人(1995)同上；Gao, A. G.等人(2000)Nat. Biotechnol. 18 1307-1310)。此外，盡管不 存在定義C-末端液泡分選決定簇的共有序列(Nielsen，K.J.等人(1996) Biochemistry 35 369-378 ；Neuhaus, J. -M. (1996)Plant Physiol. Biochem. 34 :217_221)，但在茄科防 衛(wèi)素的前結(jié)構(gòu)域中酸性和疏水性氨基酸的高含量與其他植物液泡分選決定簇相一致(Lay 等人2003同上)(H)。此外，前結(jié)構(gòu)域包含具有4個(gè)氨基酸的基序(在圖4中帶陰影的)，這些基序也存在于來(lái)自大麥凝集素(barley lectin)和小麥胚凝集素(wheat germ agglutinin)的液泡靶向序列中。在煙草防衛(wèi)素以及大麥凝集素和小麥胚凝集素上的液泡 靶向基序之間的相似性暗示，來(lái)自茄科防衛(wèi)素的C-末端前肽在單子葉以及雙子葉植物中 充當(dāng)液泡靶向信號(hào)。已知大麥凝集素中的VFAE(SEQ ID NO 43)序列(圖4)對(duì)于液泡靴 向來(lái)說(shuō)是足夠的(Bednarek，S. Y.和 Raikhel，N. V. (1992)Plant Mol Biol. 20 133-150)。 已描述了其他負(fù)責(zé)液泡靶向的C-末端序列(Shinshi等人，Plant Molec. Biol. 14 357-368(1990))。
另一方面，在與防衛(wèi)素和前結(jié)構(gòu)域相關(guān)的靜電電荷方面的不同暗示，前結(jié)構(gòu)域可 以通過(guò)用作分子內(nèi)立體分子伴侶和/或通過(guò)阻止在經(jīng)由分泌途徑的易位過(guò)程中防衛(wèi)素和 其他細(xì)胞蛋白質(zhì)或脂質(zhì)膜之間的有害相互作用來(lái)幫助防衛(wèi)素成熟。已對(duì)于哺乳動(dòng)物α-防 衛(wèi)素、昆蟲(chóng)防衛(wèi)素和硫素提出了這些假設(shè)(Bohlmarm (1994)同上；Michaelson等人(1992) 同上；Liu 等人(1995)同上；Florack, D. Ε. A.等人(1994) Plant Mol. Biol. 26 :25_37 ； Florack, D. E.等人(1994) Plant Mol. Biol. 24 :83_96)。防衛(wèi)素作為多基因家族進(jìn)行表達(dá)如同許多其他植物防御相關(guān)蛋白質(zhì)一樣，植物防衛(wèi)素由多基因家族編碼。這在 擬南芥(Arabidopsis thaliana)和截形苜蓿(Medicagotruncatula)中特別充分地進(jìn)行 了闡明，其中公眾可得的序列數(shù)據(jù)庫(kù)的比較序列分析揭示出，存在有在這些植物中單獨(dú)存 在的幾百種防衛(wèi)素樣(DEFL)基因(Silverstein, K. Α.等人(2005)Plant Physiol. 138 600-610 ；Fedorova, Μ. J.等人(2002) Plant Physiol. 130 :519_537 ；Graham, M. A.等人 (2004) Plant Physiol. 135 :1179_1197 ；Mergaert, P. K.等人(2003) Plant Physiol. 132 161-173)。使用幾種擬南芥屬防衛(wèi)素來(lái)進(jìn)行的表達(dá)研究揭示出，這些基因展示出不同的器官 特異性表達(dá)模式(Epple, P.等人(1997)FEBS Lett. 400 168-172 ；Thomma, B. P. H. J.等 人(1998a) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 95 15107-15111 ；Thomma, B. P. H. J.等人(1998b) PlantPhysiol. Biochem. 36 :553_537)。某些是組成性表達(dá)的，而其他在病原體感染后在葉 中被上調(diào)(Epple等人(1997)同上；Thomma等人(1998-A)同上；Thomma等人(1998-B)同 上)。因此，大多數(shù)植物組織組成性地表達(dá)兩種或更多種防衛(wèi)素基因，這暗示獨(dú)個(gè)防衛(wèi)素在 特定環(huán)境下或在特定位點(diǎn)處表達(dá)。防衛(wèi)素的純化在最近的20年，已純化出了眾多植物防衛(wèi)素，特別是從相對(duì)豐富地含有這些蛋 白質(zhì)的種子中(Osborn 等人(1995)同上；Terras, F. R. G.等人(1992) J. Biol. Chem. 267 15301-15309)。盡管關(guān)于防衛(wèi)素純化已報(bào)道了幾種不同的方法，但這些方法中的許多依賴 于該蛋白質(zhì)的固有物理_生物化學(xué)性質(zhì)，例如它們的小尺寸、總體凈正電荷、對(duì)酸和有機(jī)溶 劑的耐受性、以及其熱穩(wěn)定性。類(lèi)似地，其他小的、堿性的、富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)例如硫素 (Bohlmann (1994)同上)和植物大環(huán)寡肽(Craik等人(1999)同上)的純化也利用了這些性 質(zhì)。這反映于在最初的提取中使用弱酸(例如50mM硫酸)(Lay等人2003同上；0zaki，Y.等 人(1980) J. Biochem. 187 :549_555 ；Zhang, N. Y.等人(1997-A) Cereal Chem. 74 119-122 ； Zhang, Y.和Lewis，K. (1997-B)FEMS Microbiol. Lett. 149 59-64)或有機(jī)溶劑(Craik等人 (1999)同上)，加熱樣品以去除熱不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)(Lay等人2003同上；Terras等人(1992)同上；Saitoh, H.等人(2001)Mol. Plant-Microbe Interact. 14 :111_115)，以及各種色譜 法步驟的組合，包括凝膠(大小排阻)過(guò)濾、離子交換和反相高效液相色譜法(Lay等人 2003 同上；Terras 等人(1992)同上；Zhang 等人(1997a)同上；Zhang 和 Lewis (1997-B)同 上)。已使用異源表達(dá)系統(tǒng)來(lái)大量地產(chǎn)生防衛(wèi)素。Vilas Alves, A. L.等人(1994)FEBS Lett. 348 :228-232 在釀酒酵母(S. cerevisiae)中產(chǎn)生了功能性 Rs_AFP2，而 Kristensen， Α. K.等人(1999)ProteinExpr. Purif. 16 377-387, Almeida, Μ. S.等人(2001)Arch. Biochem. Biophys. 395 199-207 和 ffisniewski, Μ. E.等人(2003)Physiol. Plant. 119 563-572分別在巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中表達(dá)了甜菜(AX2)、豌豆(Psdl)和 桃(PpDfnl)防衛(wèi)素。在更加新型的方法中，Saitoh等人(同上)通過(guò)用攜帶WTI cDNA的 馬鈴薯X病毒載體感染植物而在本氏煙草(Nicotiana benthamiana)的葉中產(chǎn)生了山崳 菜(wasabi)防衛(wèi)素(WTl)。在2002年，Chen及同事使用基于內(nèi)含肽的系統(tǒng)來(lái)在大腸桿 菌(Escherichia coli)中表達(dá)綠豆防衛(wèi)素(VrCRP) (Chen,K. C.等人(2002) J. Agric. Food Chem. 50 :7258_7263)。植物防衛(wèi)素的生物學(xué)活性 已將廣泛多樣的生物學(xué)活性歸因于植物防衛(wèi)素，包括對(duì)廣泛范圍的真菌 (Broekaert 等人(1997)同上；Lay 等人 2003 同上；Osborn 等人(1995)同上；Terras 等人 (1993)FEBS Lett. 316 :233_240)，以及革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌(Segura等人(1998) 同上；Moreno等人(1994)同上；Zhang等人(1997-B)同上)的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)。某些防衛(wèi) 素還是消化酶例如α-淀粉酶(Zhang等人(1997a)同上；Bloch C. Jr.等人(1991) FEBS Lett. 279 101-104)和絲氨酸蛋白酶(ffijaya, R.等人(2000)Plant Sci. 159 :243_2555 ； Melo, F. R.等人(2002)Proteins 48:311-319)的有效抑制劑，這兩種功能與在保護(hù)免于 昆蟲(chóng)取食中的作用相一致。這得到了下述觀察結(jié)果的支持當(dāng)以0.2% (w/w)摻入到人工 飲食中時(shí)，由細(xì)菌表達(dá)的綠豆防衛(wèi)素VrCRP對(duì)于綠豆象(Callosobruchus chinensis)是 致命的(Chen等人(2002)同上)。某些防衛(wèi)素還抑制蛋白質(zhì)翻譯(Mendez等人(1990)同 上；Colilla 等人(1990)同上；Mendez，Ε.等人(1996)Eur. J. Biochem. 239 67-73)或者 與離子通道結(jié)合(Kushmerick,C.等人(1998) FEBS Lett. 440-302-306)(表 2)。來(lái)自葉芽 擬南芥(Arabidopsis halleri)的防衛(wèi)素還賦予鋅耐受性，這暗示了在脅迫適應(yīng)中的作用 (Mirouze,M. J.等人(2007)Plant J. 47 :329_342)。更新近地，向日葵防衛(wèi)素顯示出在列當(dāng) 屬(Orobanche)寄生植物中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(de Z6licourt等人(2007)同上)。引人興趣的 是，獨(dú)個(gè)防衛(wèi)素展現(xiàn)出這些性質(zhì)中的一種或兩種，但并非這些性質(zhì)中的全部?？拐婢钚灾参锓佬l(wèi)素的經(jīng)最佳表征的活性是它們以各不相同的效力抑制大量真菌物種的 能力(例如，參見(jiàn)Broekaert等人(1997)同上；Lay等人2003同上；Osborn等人(1995)同 上)。例如，Rs-AFP2在1 μ g/mL時(shí)抑制甜菜莖點(diǎn)霉(Phoma betae)的生長(zhǎng)，但在100 μ g/mL 時(shí)針對(duì)核盤(pán)菌(Sclerotinia sclerotiorum)是無(wú)效的(Terras等人(1992)同上)?；?它們對(duì)于真菌黃色鐮孢(Fusarium culmorum)的生長(zhǎng)和形態(tài)的影響，可以區(qū)分出兩組防衛(wèi) 素。“形態(tài)發(fā)生”植物防衛(wèi)素引起減少的菌絲延長(zhǎng)，伴隨著菌絲分支的增加，而“非形態(tài)發(fā)生” 植物防衛(wèi)素減少菌絲延長(zhǎng)的速率，但不誘導(dǎo)顯著的形態(tài)變形(Osborn等人(1995)同上)。
許多防衛(wèi)素展示出抗真菌活性，但僅對(duì)于四種防衛(wèi)素闡述了關(guān)于此種活性的分 子基礎(chǔ)。DmAMPl和RsAFP2防衛(wèi)素與真菌膜中的不同鞘脂靶標(biāo)結(jié)合，并因而顯示出不同 的針對(duì)這些真菌的特異性。編碼肌醇磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因(IPTl)被鑒定為在釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)中決定了對(duì)于DmAMPl的敏感性。這種酶催化鞘脂甘露糖基 二肌醇磷酸神經(jīng)酰胺(M(IP)2C)的生物合成的最后一個(gè)步驟。缺乏功能性IPTl基因的突 變株在其質(zhì)膜中缺少M(fèi)(IP)2C,結(jié)合相比于野生型菌株而言更少的DmAMPl，并且變得對(duì)于由 DmAMPl介導(dǎo)的抑制具有高度的抗性。對(duì)于RsAFP2，巴斯德畢赤酵母中決定敏感性的基因是 GCS，其編碼葡糖神經(jīng)酰胺合酶，這是一種牽涉葡糖神經(jīng)酰胺的合成的酶。參見(jiàn)Lay，F(xiàn).T.等 人(2005)同上；Thevissen,K.等人(2003)FEBS Microbiol. Lett. 226 :169_173 ；Thevissen K.等人(2004) J. Biol. Chem. 279 :3900_3905。更新近地，已顯示，豌豆防衛(wèi)素Psdl被吸收入細(xì)胞中，并且進(jìn)入粗糙脈孢菌 (Neurospora crassa)的細(xì)胞核，在那里它與牽涉細(xì)胞周期控制的核細(xì)胞周期蛋白樣蛋 白質(zhì)相互作用(Lobo, D. S.等人(2007) Biochemistry46 :987_96)。對(duì)于 MsDefl (來(lái)自 苜蓿的防衛(wèi)素)，兩個(gè)促分裂原活化蛋白(MAP)激酶信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)在調(diào)節(jié)對(duì)于禾谷鐮孢 (Fusarium graminearum)的 MsDefl 活性中具有主要作用(Ramamoorthy，V.等人(2007) Cell Microbiol. 9 :1491-506)。在轉(zhuǎn)基因植物中利用植物防衛(wèi)素迄今，已用植物防衛(wèi)素基因轉(zhuǎn)化了幾種植物。這些基因、其接納體植物和靶病原 體的列表呈現(xiàn)于表2中。蘿卜防衛(wèi)素(RS-AFP2)的組成性表達(dá)增強(qiáng)了煙草植物對(duì)于真菌 葉病原體長(zhǎng)柄鏈格孢(Alternarialongipes)的抗性，和類(lèi)似地在番茄中增強(qiáng)了對(duì)于馬 鈴薯早疫病鏈格孢(A.solani)的抗性(Ohtani, S.等人(1977) J. Biochem. (Tokyo)82 753-7657)。組成性地表達(dá)豌豆防衛(wèi)素的卡諾拉油菜(canola)(歐洲油菜(Brassica napus))具有略微增強(qiáng)的針對(duì)黑脛病(斑點(diǎn)小球腔菌(L印tosphaeria maculans))的抗性 (Wang, Y.等人(1999)Mol. Plant-Microbe Interact. 12 :410_418)。然而，防衛(wèi)素在轉(zhuǎn)基因 農(nóng)作物中的潛力的最深入的研究和最佳的例子來(lái)自Gao及同事關(guān)于馬鈴薯中的苜蓿防衛(wèi) 素(alfAFP)的工作(Gao等人(2000)同上)。表 2轉(zhuǎn)基因植物中的植物防衛(wèi)素 Lay 禾口 Anderson (2005) Current Protein and Peptide Science 6:85—101. Sjahrill R，Chin DP, Khan RS, Yamamura S, Nakamura I, Amemiya Y, Miil M(2006)Plant Biotechnology 23:191—194.Khan RS, Nishihara M, Yamamura S, Nakamura I， Mii M (2006) PlantBiotechnology 23:179—183.Turrini A,Sbrana C,Pitto L,Ruffini Castiglione M,Giorgetti L,Briganti R, Bracci T, Evangelista M， Nuti MP, Giovannetti M(2004)New Phytologist 163 393-403.Zhu YJ, Agbayani R，Moore PH(2007) Planta 226:87-97.Gao及同事(Gao等人(2000)同上)證明，alfAFP (也稱為MsDefl)在馬鈴薯中的 組成性表達(dá)提供了強(qiáng)的針對(duì)農(nóng)藝學(xué)上重要的真菌大麗花輪枝孢的抗性。與未轉(zhuǎn)化的植物相 比較，在經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物中的真菌水平減少至大約1/6。由alfAFP轉(zhuǎn)基因所賦予的保護(hù)不僅 在溫室條件下得到維持，而且還在田間并且在不同地理位置處在數(shù)年內(nèi)得到維持(Gao等 人(2000)同上)。此外，在轉(zhuǎn)基因植物中的輪枝孢性萎蔫病(Verticillium wilt)抗性的 水平等于或大于用在經(jīng)煙熏的、未侵染的土壤中生長(zhǎng)的非轉(zhuǎn)基因植物獲得的抗性水平(Gao 等人(2000)同上)。美國(guó)專利7，041，877 (其通過(guò)提及而合并入本文，至與此相一致的程度)報(bào)道 了全長(zhǎng)NaDl在棉花和煙草中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。將所得的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物的葉飼喂給棉鈴蟲(chóng) (Helicoverpa armigera)和細(xì)點(diǎn)突夜蛾(H. punctigera)幼蟲(chóng)，導(dǎo)致相比于以對(duì)照飲食進(jìn) 行飼喂的幼蟲(chóng)而言出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制。美國(guó)專利7，041，877還報(bào)道了，純化的NaDl (減去了C-末端前結(jié)構(gòu)域)在體外抑制石竹尖鐮孢(Fusarium oxysporum f. sp. dianthi) Race 2和 灰葡萄孢的生長(zhǎng)。附圖簡(jiǎn)述
^！是基于Lay和Anderson 2005的植物防衛(wèi)素的通有序列。圖2A和圖2B圖解說(shuō)明了兩類(lèi)棺物防衛(wèi)素。圖2A 所有棺物防衛(wèi)素如此產(chǎn)牛, 其中除了成熟防衛(wèi)素結(jié)構(gòu)域外還具有ER信號(hào)序列。_:在某些植物中，特別是來(lái)自茄 科(Solanaceae)的那些植物，分離出了編碼具有另外的C-末端前結(jié)構(gòu)域的植物防衛(wèi)素的 cDNA克隆。在防衛(wèi)素結(jié)構(gòu)域中4個(gè)強(qiáng)烈保守的二硫鍵通過(guò)連接線來(lái)圖示。圖3A-3D提供具有和不具有C-末端前結(jié)構(gòu)域的防下.素前體蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)的氨某 酸序列的比較。M :ER信號(hào)序列的預(yù)測(cè)的切割位點(diǎn)用箭頭來(lái)標(biāo)明，并且防衛(wèi)素和C-末端 前結(jié)構(gòu)域(當(dāng)適用時(shí))之間的連接用三角形來(lái)標(biāo)示。已引入了間隔以使比對(duì)最大化。在某 些或大多數(shù)序列中相似或相同的殘基分別帶有灰色和黑色陰影。使用BioEdit序列比對(duì)編 輯器(版本 5. 0. 9)軟件來(lái)產(chǎn)生該比對(duì)(Hall，T. A. (1999) Nucl. Acids Symp. 41 :95_98)。關(guān) 于蛋白質(zhì)序列的參考文獻(xiàn)為 NaDl (SEQ IDNO 1)、PhDl (SEQ ID NO 2)和 PhD2 (SEQ ID NO: 3) (Lay, F. Τ.等人(2003) Plant Physiol. 131 :1283-1293)，F(xiàn)ST (SEQ ID NO 4) (Gu Q.等人 (1992)Mol Gen Genet 234 89-96),NaThiol(SEQ IDNO :5) (Lou,Y.和Baldwin，I. T. (2004) Plant Physiol. 135 :496-506)，NeThio2(SEQ ID NO 6) (Yamada, S.等人(1997)Plant Physiol. 115 :314)，NpThiol (SEQ ID NO 7) (Komori, Τ.等人(1997)Plant Physiol. 115 314)，TPP3(SEQ ID NO 8) (Mi 1 ligan, S. B.和 Gasser，C. S. (1995)Plant Mol Biol. 28 691-711)，CcDl (SEQ ID NO 9) (AF128239，Aluru，M.等人(1999) Plant Physiol. 120 :633)， Nt-硫素(SEQ ID NO 10)(登錄號(hào) BAA95697)，NTS13 (SEQ ID NO 11) (X99403) (Li,H. Y.禾口 Gray, J. E. (1999)Plant Physiol. 120 663), TGAS118(SEQ ID NO : 12) (Van den Heuvel, K. J. P. T.等人(2001) J Expt. Biol. 52 :1427-1436)，PPT (SEQ ID NO 13) (Karunanandaa, B.等人(1994) Plant Mol Biol. 26 :459_464)，Jl-1 (SEQ ID NO : 14)和 Jl-2 (SEQID NO: 15)(Meyer, B.等人(1996)Plant Physiol. 112 :615_622)，Rs-AFPl(SEQ ID NO 16)禾口 Rs-AFP2 (SEQ ID NO 17) (Terras, F. R. G.等人(1992) J. Biol. Chem. 267 :15301-15309)。 NaD2 相應(yīng)于 SEQ IDNO : 33。圖 3B 茄科防衛(wèi)素 NaDl (SEQ ID NO :1)與 ZmESR-6 (SEQ ID N0:18)(來(lái)自玉蜀 黍的具有C-末端前肽的防衛(wèi)素原(prodefensin))的氨基酸序列的比較(Balandin等人， (2005) Plant Mol Biol. 58 :269_282)。箭頭標(biāo)示了成熟防衛(wèi)素結(jié)構(gòu)域的N-末端，并且三角 形標(biāo)明了關(guān)于所比對(duì)的序列的C-末端前肽的N-末端。M3C 在中性pH下，在茄科和玉蜀黍防衛(wèi)素的防衛(wèi)素和C-末端前結(jié)構(gòu)域中帶電 荷的氨基酸的分布(從Lay和Anderson 2005修改的)。NaD 1、ZmESR-6、Art vl和SF18的 部分來(lái)自 SEQ ID NO :1、18、19 和 20。圖 3D =NaDl 和 ZmESR-6 的成熟防衛(wèi)素(SEQ ID NO :1，殘基 26-72 ； SEQ ID NO :18， 殘基 24-78)和 C-末端結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO :1，殘基 73-105 ;SEQ ID NO 18，殘基 79-106) 分別與艾蒿花粉的主要變應(yīng)原Art vl (SEQ ID NO 19，殘基1_53，成熟防衛(wèi)素)(AF493943， Himly，M.等人(2003)FASEB J 17 :106_108)和來(lái)自向日葵的防衛(wèi)素樣蛋白質(zhì)SF18 (SEQ ID NO :20，殘基 1-57，成熟防衛(wèi)素)(X53375，Domon，C.等人(1990)Plant Mol Biol 15:643-646)的比對(duì)。Art vl (SEQ ID NO 19)和SF18(SEQ ID NO 20)具有長(zhǎng)的富含脯氨酸的 C-末端結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO :19，殘基 53-108 ;SEQ ID NO :20，殘基 58-152)。
圖4 提供了來(lái)自茄科防衛(wèi)素 NaDl (SEQ ID NO 1，殘基 73-105)、PhDl (SEQ ID NO: 2，殘基73-103)和PhD2 (SEQ ID NO :3，殘基75-101)的C-末端前結(jié)構(gòu)域與來(lái)自其他植物 蛋白質(zhì)的對(duì)于液泡靶向必需的C-末端前結(jié)構(gòu)域(SEQ ID N0:21-31、35、40和41)的比較。 帶陰影的序列突出顯示了在來(lái)自NaDl的C-末端前肽中以及在來(lái)自大麥凝集素和小麥胚凝 集素的那些中存在的基序。來(lái)自大麥凝集素的四氨基酸肽VFAE (SEQ ID NO :24的氨基酸 1-4)對(duì)于液泡靴向是足夠的(Bednarek，S. Y.和 Raikhel，N. V. (1992) Plant Mol. Biol. 20 133-150)。關(guān)于圖1-4中顯示的序列的參考文獻(xiàn)為Bednarek, S.等人(1990)Plant Cell 2 1145-1155 ；Bol, J. F.等人(1990)Annu RevPhytopathol 28 113-138 ；Cervelli, M.等 人(2004)Plant J40 :410_418 ；DeLoose, M.等人(1988)Gene 70 13-23 ；Frigerio, L.等 人(2001)J Plant Physiol. 158 499-503 ；Lay, F. Τ.等人(2003)Plant Physiol 131 1283-1293 ；Lou, Y.禾口 Baldwin，I. P. (2004)Plant Physiol. 136 :496_506 ；Melchers, L. S.等人(1993)PlantMol Biol 21 583-593 ；Miller, Ε. Α.等人(1999)Plant Cellll 1499-1508 ；Neuhaus, J. -Μ.等人(1991)Proc Natl Acad Sci USA88 10362-10366 ； Nishizawa, K.等人(2003)Plant J 34 647-659 ；Ponstein, Α. S.等人(1994)Plant Physiol 104 109-118 ；Raikhel, N.和 Wilkins，Τ. (1987)Proc Natl Acad Sci USA 84: 6745-6749 ；Saalbach, G.等人(1996)Plant Physiol 112 975-985 ；Saint-Jore-Dupas, C.等人(2005)Plant Cell Physiol46 :1603_1612 ；ffilkins,T.和Raikhel，N. (1989)Plant Celll :541-549oM5是PHEX22構(gòu)建體的圖示。(實(shí)施例1)將DNA插入到二元載體pBIN19的左和 右邊界之間(Bevan M. (1984，Nucleic AcidsResearch 12:8711-8721))。從 C-末端去除 NaDl基因的99bp，從而產(chǎn)生編碼SEQ ID NO :1的殘基1_72的NaDlm(SMA T)基因?？s寫(xiě)按 順時(shí)針順序?yàn)閛riV 植物復(fù)制起點(diǎn)；ColEl ori 源自大腸菌素El的復(fù)制起點(diǎn)；TDNA RB 根瘤土壤桿菌(ARrobacterium tumefacious) TDNA 的右邊界；Nos啟動(dòng)子胭脂堿合酶Nos基因的啟動(dòng)子；NPTII 編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II的遺傳序列；Nos終止子Nos基因的終止子序列；破裂的(disrupted) IacZ 編碼β -半乳糖苷酶的部分序列的DNA區(qū)段；CaMV 35S啟動(dòng)子花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S蛋白的啟動(dòng)子；SNaDl 編碼缺乏 CTPP 的 NaDl (SM Δ Τ)的 DNA ；CaMV 35S終止子編碼CaMV 35S蛋白的基因的終止子序列；Μ13 ori :M13病毒復(fù)制起點(diǎn)；TDNA LB =TDNA 左邊界；所有箭頭標(biāo)明了轉(zhuǎn)錄方向。顯示了用pHEX22轉(zhuǎn)化的原初(primary)轉(zhuǎn)基因植物83. 23. 2 (A)和83. 96. 2(B)的照片。(實(shí)施例1)植物83. 96. 2具有更高水平的NaDl表達(dá)，并且展示出有 著扭曲的葉和短的節(jié)間的更加異常的表型。圖7是條形圖，其顯示了在用DHEX22轉(zhuǎn)化的品系78. 131. 1的T2代的葉中通過(guò) ELISA測(cè)定的相對(duì)NaDl水平。植物b和1是無(wú)效分離子。(實(shí)施例1)在橫軸上的編號(hào)是指 原初轉(zhuǎn)基因植物78. 131. 1的子代。在490nm處的吸光度是指在實(shí)施例1中所描述的ELISA 測(cè)定法數(shù)據(jù)。 圖8是描繪了在圖7中所分析的品系78. 131. 1 T2植物中的某些植物的表型的 照片。道1 植物a ；道2 植物c ；道3 植物d ；道4 植物e(所有植物表達(dá)減去了 CTPP的 NaDl，SM Δ T) (SEQ ID NO :1，殘基1-72)；道5 植物b (無(wú)效分離子)。(實(shí)施例1)。圖8B。 經(jīng)Vcll消化的來(lái)自78. 131. 1 Tl植物的基因組DNA的Southern印跡，其顯示了與NaDl DNA 探針雜交的單個(gè)DNA片段的存在。_描繪了從來(lái)自用pHEX22轉(zhuǎn)化的棉花植物的葉中提取的總可溶性蛋白 質(zhì)的免疫印跡。(實(shí)施例 1)在 10-20 % Novex (Invitrogen, Carlsbad, CA 92008) Tricine SDS凝膠上分開(kāi)蛋白質(zhì)，并且轉(zhuǎn)移到0. 22微米硝酸纖維素膜上。泳道1 =SeeBlue Plus2 (Invitrogen, Carlsbad, CA 92008)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；在縱軸上的數(shù)字標(biāo)明了以千道爾 頓(kD)表示的蛋白質(zhì)分子量；泳道2 :50ng成熟NaDl (M) (SEQ IDNO :1，殘基26-72)；泳道 3 :150ng 成熟 NaDl(M)；泳道 4 35. 125. 1 (純合 T4 代)；泳道 5 78. 131. 1 (T2 代)；泳道 6 83. 68. 2 (T2 代)；泳道 7 83. 68. 2 (T2 代)；泳道 8 未轉(zhuǎn)化的 Coker 315 (Departmentof Primary Industries 和 Fisheries，Queensland)。在泳道4、5、6 和 7 中檢測(cè)出成熟 NaDl (M, SEQ ID N0:1，殘基26-72)(箭頭)。在泳道4 (35. 125. 1)中檢測(cè)出具有C-末端前肽的 NaDl (MT，SEQ IDNO :1，殘基 26-105)(箭頭)。圖10A-10D是顯微照片，其顯示了在表達(dá)來(lái)自構(gòu)建體的NaDl的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的棉花 植物中NaDl的亞細(xì)胞定位，所述構(gòu)建體編碼具有(pHEX3)和不具有(pHEX22)NaDlCTPP(T) 的NaDl。(實(shí)施例1)使用在經(jīng)石蠟包埋的葉切片上的免疫熒光(用抗NaDl抗體)來(lái)測(cè)定 NaDl定位。A和B 來(lái)自品系35. 125. l(pHEX3，SMT)的葉切片。A.抗NaDl抗體，其顯示出 NaDl定位在液泡中。B.免疫前抗體對(duì)照。C和D 來(lái)自品系78. 131. 1 (pHEX22，SM Δ T)的葉 切片。C.抗NaDl抗體，其顯示出NaDl不在液泡中而是可以在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外空間中檢測(cè) 到(箭頭所示的)。D.免疫前抗體對(duì)照。圖11描繪了從花煙草的未成熟芽(泳道1)和轉(zhuǎn)基因棉花品系35. 125的葉(泳道 2)中提取的蛋白質(zhì)的免疫印跡。泳道3包含50ng成熟NaDl (M) (SEQ ID NO :1，殘基26-72)。 (實(shí)施例 2)在 10-20% Novex (Invitrogen, Carlsbad, CA 92008) Tricine SDS-聚丙烯 酰胺凝膠上分開(kāi)蛋白質(zhì)，并且轉(zhuǎn)移到0.22微米硝酸纖維素膜上。A 用NaDl CTPP(T)抗體 探測(cè)的印跡；B 用NaDl (M)抗體探測(cè)的印跡。在泳道1和2中檢測(cè)出具有NaDlCTPP(T)的 NaDl(MT, SEQ ID NO 1殘基26-105)(箭頭)。在泳道1和3 (圖版B)中檢測(cè)出成熟NaDl (M， SEQ ID N0:1，殘基26-72)(箭頭)?？v軸描繪了分子量標(biāo)準(zhǔn)的條帶位置。ail是在溫室生物測(cè)定法中，針對(duì)播種后天數(shù)進(jìn)行作圖的用蝕脈尖鐮孢 (Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum) (Fov)感染的棉花植物的存活百分比(縱軸) 的圖。(實(shí)施例3)Coker 未轉(zhuǎn)化的Coker 315 ；品系Dl 轉(zhuǎn)基因品系35. 125. 1 (用pHEX3， SMT 轉(zhuǎn)化的 Coker 315) ；Siokra 1-4 (Cotton Seed Distributors Limited, ffeeffaa, NSffAustralia 2388)對(duì)于 Fov 易感的棉花品種；Sicot 189 (Cotton Seed Distributors Limited, Wee Waa, NSff Australia2388)對(duì)于Fov較不易感的品種，澳大利亞工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。
^13是關(guān)于表達(dá)NaDl的轉(zhuǎn)基因棉花的田間試驗(yàn)結(jié)果(實(shí)施例3)的圖。將用蝕 脈尖鐮孢(Fov)感染的棉花植物的存活百分比(縱軸)針對(duì)在田間播種后天數(shù)進(jìn)行作圖。 Coker 未轉(zhuǎn)化的Coker 315 ；品系Dl 用pHEX3, SMT轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因品系35. 125. 1 Coker 315 ；Sicot 189 對(duì)于Fov較不易感的品種，澳大利亞工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。圖14A-14E圖解說(shuō)明了由NaDl成熟結(jié)構(gòu)域和來(lái)自番茄防衛(wèi)素的CTPP組成的嵌合 防衛(wèi)素的表達(dá)(實(shí)施例4)。A :pHEX98構(gòu)建體的圖示。將編碼具有NaDl ER信號(hào)序列(S) 和來(lái)自番茄防衛(wèi)素TPP3 (圖3)的CTPP(T〃 )的成熟NaDl (M)的DNA插入到CaMV 35S啟動(dòng) 子和終止子之間，并且連接在二元載體PBIN19的左和右邊界之間(Bevan M. (1984，Nucleic Acids Research 12:8711-8721))其他縮寫(xiě)如對(duì)于圖5所描沭的。B :pHEX98蛋白質(zhì)產(chǎn)物 的圖示。C:通過(guò)ELISA測(cè)定的在番茄幼苗的葉中在pHEX43(SMT)和pHEX98(SMT〃 )的瞬 時(shí)表達(dá)期間產(chǎn)生的NaDl的相對(duì)水平。在ELISA中使用來(lái)自3個(gè)葉樣品的提取物(1 20， 鮮重緩沖液)。D 通過(guò)ELISA測(cè)定的在棉花子葉中在pHEX98(SMT" ) ；pHEX43 (SMT)； pHEX80(S' MT')和pHEX89(SMT')的瞬時(shí)表達(dá)期間產(chǎn)生的NaDl的相對(duì)水平。關(guān)于pHEX 構(gòu)建體列表，可參見(jiàn)表10。E 蛋白質(zhì)免疫印跡，其顯示了在棉花中在pHEX構(gòu)建體的穩(wěn)定或 瞬時(shí)表達(dá)期間產(chǎn)生的NaDl (M)禾Π NaDl (MT)。圖15A-15D圖解說(shuō)明了由NaDl成熟結(jié)構(gòu)域和來(lái)自多結(jié)構(gòu)域蛋白酶抑制劑NaPI的 CTPP組成的嵌合防衛(wèi)素的表達(dá)(實(shí)施例5)。A :ρΗΕΧ89構(gòu)建體的圖示，該構(gòu)建體在二元載體 中包含編碼具有NaDl ER信號(hào)序列(S)和來(lái)自NaPI的CTPP (T')的成熟NaDl (M)的DNA ； 其他縮寫(xiě)如在圖5中所詳述的。B :ρΗΕΧ89蛋白質(zhì)產(chǎn)物。C :ρΗΕΧ80的圖示，其在二元載體中 包含具有來(lái)自NaPI的ER信號(hào)序列(S')和CTPP(T')的NaDl (M)結(jié)構(gòu)域；其他縮寫(xiě)如在 圖5中所詳述的。D:pHEX80蛋白質(zhì)產(chǎn)物。圖16A和IM圖示了研究的基因構(gòu)建體㈧和顯微照片⑶，所述顯微照片顯示 了在各種GFP-CTPP嵌合體的瞬時(shí)表達(dá)后綠色熒光蛋白(GFP)在本氏煙草細(xì)胞中的定位。 (實(shí)施例5) A 基因構(gòu)建體的圖示，所述基因構(gòu)建體編碼一系列GFP-CTPP嵌合體以評(píng)估所述 CTPP序列是否足以將蛋白質(zhì)導(dǎo)向植物液泡。將所述構(gòu)建體插入到二元載體PBIN19中以用 于在植物細(xì)胞中表達(dá)。B:顯微照片，其顯示了在本氏煙草的葉中于在A中所顯示的構(gòu)建體 的瞬時(shí)表達(dá)期間產(chǎn)生的GFP的定位。左手圖版葉肉細(xì)胞的微分干涉相差(DIC)圖像。右 手圖版相同切片的綠色波長(zhǎng)分析(505-530nm)以鑒定GFP熒光。M 17A-17E圖解說(shuō)明了由NaDl成熟結(jié)構(gòu)域(M)和截短的NaDl CTPP (T')組成的 嵌合防衛(wèi)素的表達(dá)(實(shí)施例6)。A :pHEX44構(gòu)建體的圖示，該構(gòu)建體在二元載體中包含編碼 具有NaDlER信號(hào)序列(S)和來(lái)自NaDl CTPP的前4個(gè)氨基酸的成熟NaDl (M)的DNA ；其他 縮寫(xiě)如在圖5中所給出的。B :pHEX44蛋白質(zhì)產(chǎn)物的圖示。C 通過(guò)ELISA測(cè)定的在棉花子葉 中在pHEX44(SMT')和pHEX43 (SMT)的瞬時(shí)表達(dá)期間產(chǎn)生的NaDl的相對(duì)水平。在ELISA 中使用來(lái)自3株幼苗的提取物(1 100)。D 蛋白質(zhì)免疫印跡，其顯示了在本氏煙草葉中 在瞬時(shí)表達(dá)期間從pHEX43和44產(chǎn)生的NaDl (M)和NaDl (MT)。關(guān)于pHEX構(gòu)建體列表，可 參見(jiàn)表10。E 通過(guò)ELISA測(cè)定的在用pHEX44穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的棉花中產(chǎn)生的NaDl的相對(duì)水平。 在用NaDl抗體的ELISA中使用來(lái)自處于組織培養(yǎng)中的5株植物的葉提取物(1 500)。將從來(lái)自pHEX3純合子35. 125. 1的花和葉提取物中純化出的NaDl用作陽(yáng)性對(duì)照。SM圖解說(shuō)明了將NaDl CTPP添加至NaD2 (不含內(nèi)源CTPP的防衛(wèi)素)的影響(實(shí) 施例7)。A :pHEX92構(gòu)建體圖示，該構(gòu)建體在二元載體中包含編碼具有NaD2ER信號(hào)序列(S) 和來(lái)自NaDl的CTPP (T)的成熟NaD2 (M)的DNA 其他縮寫(xiě)如對(duì)于圖5所給出的。B :pHEX91 構(gòu)建體，其與PHEX92相同，除了不存在編碼來(lái)自NaDl的CTPP (T)的DNA外。C 由pHEX92 和91編碼的蛋白質(zhì)的圖示。D 通過(guò)ELISA測(cè)定的在棉花子葉中在pHEX92和91的瞬時(shí)表 達(dá)期間產(chǎn)生的NaD2的相對(duì)水平。在ELISA中使用來(lái)自3株幼苗的提取物(1 100)，所述 ELISA使用NaD2抗體以及作為陽(yáng)性對(duì)照的從花煙草的花中純化出的NaD2。E 使用NaD2抗 體的蛋白質(zhì)免疫印跡，其顯示了在瞬時(shí)表達(dá)期間從PHEX92和91構(gòu)建體產(chǎn)生的NaD2(箭頭 所示的)的相對(duì)水平。
MIS提供了 NaD2的核酸(編碼)和氨基酸序列(分別為SEQ IDNO 32和SEQ ID NO 33)。從分離自觀賞性煙草(花煙草)的花的mRNA產(chǎn)生編碼NaD2的cDNA。作為具有 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)序列和成熟防衛(wèi)素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)原而產(chǎn)生NaD2。它不具有天然的C-末端前 肽。ER信號(hào)和防衛(wèi)素結(jié)構(gòu)域之間的連接由箭頭標(biāo)明。圖20A-20C圖解說(shuō)明了由蘿卜防衛(wèi)素RsAFP2 (M)和來(lái)自NaDl的CTPP組成的嵌合 防衛(wèi)素的表達(dá)(實(shí)施例8)。A :pHEX76構(gòu)建體的圖示，該構(gòu)建體在二元載體中包含編碼具有 RsAFP2 ER信號(hào)序列(S')和來(lái)自NaDl的CTPP(T)的RsAFP2 (M)的DNA ；其他縮寫(xiě)如對(duì)于 _所示的。B :pHEX76蛋白質(zhì)產(chǎn)物。C 用針對(duì)來(lái)自NaDl的CTPP的抗體的蛋白質(zhì)免疫印 跡，通過(guò)ELISA測(cè)定。從瞬時(shí)表達(dá)pHEX76和pHEX43的棉花子葉中以及從用pHEX3穩(wěn)定轉(zhuǎn) 化的棉花的葉中制備提取物。關(guān)于PHEX構(gòu)建體列表，可參見(jiàn)表10。圖21A-21E圖解說(shuō)明了由NaDl成熟結(jié)構(gòu)域(M)和來(lái)自大麥凝集素的CTPP組成的 嵌合防衛(wèi)素的表達(dá)(實(shí)施例9)。A :pHEX63構(gòu)建體的圖示，該構(gòu)建體在二元載體中包含編碼 具有NaDl ER信號(hào)序列⑶和來(lái)自大麥凝集素前體的CTPP (T')的成熟NaDl (M)的DNA ； 其他縮寫(xiě)如對(duì)于圖5所示的。B :pHEX63蛋白質(zhì)產(chǎn)物的圖示。C 通過(guò)ELISA測(cè)定的在棉花子 葉中在 ρΗΕΧ63、ρΗΕΧ62 (編碼 NaDl [M] +Zm ESR-6CTPP[T“])和 pHEX43 的瞬時(shí)表達(dá)期間產(chǎn) 生的NaDl的相對(duì)水平。在用NaDl抗體的ELISA中使用來(lái)自2株幼苗的提取物(1 100)。 D 在本氏煙草的葉中從相同構(gòu)建體中的NaDl的瞬時(shí)表達(dá)。在ELISA中使用來(lái)自2片葉的 提取物(1 500)。E 蛋白質(zhì)免疫印跡，其顯示了在本氏煙草中在瞬時(shí)表達(dá)期間從pHEX43、 62和63產(chǎn)生的NaDl (M)和NaDl (MT)。關(guān)于pHEX構(gòu)建體列表，可參見(jiàn)表10。圖22A-C圖解說(shuō)明了由NaDl防衛(wèi)素(M)和來(lái)自玉蜀黍防衛(wèi)素ZmESR-6的 CTPP(T")組成的嵌合防衛(wèi)素。A ΦΗΕΧ62構(gòu)建體的圖示，該構(gòu)建體在二元載體中包含編碼 具有NaDl ER信號(hào)序列(S)和來(lái)自ZmESR-6防衛(wèi)素的CTPP (T〃 )的NaDl (M)的DNA ；其他 縮寫(xiě)如對(duì)于圖5所示的。B :ρΗΕΧ62蛋白質(zhì)產(chǎn)物。C 通過(guò)用NaDl抗體的ELISA測(cè)定的在用 ΡΗΕΧ62穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的棉花中產(chǎn)生的NaDl的相對(duì)水平。葉提取物進(jìn)行1 500稀釋。發(fā)明_既述盡管公開(kāi)有關(guān)于在某些特定的轉(zhuǎn)基因植物中成功表達(dá)某些特定的功能性植物防 衛(wèi)素的報(bào)告，但現(xiàn)在本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以轉(zhuǎn)基因方式表達(dá)時(shí)，某些防衛(wèi)素具有毒性效應(yīng)。此 夕卜，本發(fā)明人在此了解到，所述毒性效應(yīng)與防衛(wèi)素表達(dá)水平相關(guān)。在此，本發(fā)明包括用于減 少或消除在宿主植物中轉(zhuǎn)基因防衛(wèi)素表達(dá)的毒性效應(yīng)的一般方法。本發(fā)明還包括用于修飾編碼防衛(wèi)素的核酸的方法，由此修飾的核酸，和由經(jīng)修飾的核酸序列編碼的經(jīng)修飾的防衛(wèi) 素。本發(fā)明還包括包含并表達(dá)經(jīng)修飾的編碼防衛(wèi)素的核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物，所述植物展 現(xiàn)出相比于在其他方面相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)未修飾的防衛(wèi)素的轉(zhuǎn)基因植物而言減少或消除的防衛(wèi) 素毒性效應(yīng)。該經(jīng)修飾的防衛(wèi)素被稱為嵌合防衛(wèi)素，所述嵌合防衛(wèi)素具有與第二植物防衛(wèi) 素或非防衛(wèi)素植物液泡易位肽(VTP)的C-末端前肽結(jié)構(gòu)域相組合的第一植物防衛(wèi)素的成 熟防衛(wèi)素結(jié)構(gòu)域。SEQ IDNO的完整列表顯示在表11中。
發(fā)明詳述術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)域”在本文和本領(lǐng)域中用于指肽的一部分，所述部分具有明確且可識(shí)別 的功能，并且常常通過(guò)翻譯后加工而與所述肽的其他部分分開(kāi)。為了避免含糊不清，本文 中采用了確定的術(shù)語(yǔ)。如上文所指出的，大多數(shù)已知的植物防衛(wèi)素由編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)序列 (在下文中縮寫(xiě)為“S”)和成熟防衛(wèi)素結(jié)構(gòu)域(在下文中縮寫(xiě)為“M”)的DNA編碼。此類(lèi)防 衛(wèi)素在文獻(xiàn)中也稱為“種子防衛(wèi)素”，但它們可以獲自除種子外的其他植物來(lái)源。這些在本 文中被稱為SM類(lèi)型防衛(wèi)素。少數(shù)已知的防衛(wèi)素由這樣的DNA區(qū)段編碼，所述DNA區(qū)段編碼 另外的C-末端前結(jié)構(gòu)域/前肽(CTPP)，有時(shí)也稱為“酸性尾”(在下文中縮寫(xiě)為“T”)。此 類(lèi)防衛(wèi)素(有時(shí)叫作“花防衛(wèi)素”)被稱為SMT類(lèi)型防衛(wèi)素。名稱“SM”和“SMT”自始至終 用于指天然存在的防衛(wèi)素。術(shù)語(yǔ)“嵌合防衛(wèi)素”在本文中用于指本發(fā)明的防衛(wèi)素。嵌合防衛(wèi) 素可以具有5種一般類(lèi)別(1)與外源來(lái)源的T相組合的SM類(lèi)型防衛(wèi)素(SMT' ) ； (2) SMT 類(lèi)型防衛(wèi)素，其中不同SMT-類(lèi)型防衛(wèi)素或其他非防衛(wèi)素植物VTP的外源T取代了天然存在 的T(SMT" ) ;(3)SM或SMT類(lèi)型防衛(wèi)素，其具有外源的取代的S區(qū)段(S' MT)。類(lèi)似地，可 以構(gòu)建(4)S' MT'和(5)S' MT"嵌合防衛(wèi)素，如本領(lǐng)域中將會(huì)理解的。本文還描述了其中 表達(dá)缺失了 T的SMT防衛(wèi)素的情形。這些通過(guò)在防衛(wèi)素名稱后加上得兒塔(Δ)符號(hào)來(lái)命 名。例如，當(dāng)以無(wú)尾或缺失了 T的形式進(jìn)行表達(dá)時(shí)，NaDl (SMT防衛(wèi)素)被命名為NaDlAT。根據(jù)本發(fā)明，待在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的防衛(wèi)素編碼序列通過(guò)添加C-末端前結(jié)構(gòu) 域(CTPP)作為天然編碼序列的C-末端延伸來(lái)進(jìn)行修飾，(SMT'或SMT" )。CTPP(T'或 T")使得嵌合防衛(wèi)素能夠在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞內(nèi)易位至液泡。作為嵌合防衛(wèi)素進(jìn)行表達(dá)保護(hù)了 細(xì)胞免受SM或△ T防衛(wèi)素在宿主細(xì)胞中可能發(fā)揮的任何毒性效應(yīng)的影響。該方法可以使 用各種已知的CTPP編碼核酸區(qū)段中的任何一種來(lái)進(jìn)行，例如但不限于，在某些SMT防衛(wèi)素 中發(fā)現(xiàn)的酸性結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)段(圖4)。作為N-末端肽區(qū)段存在的液泡易位肽(VTP)也是已知的。本文中用于N-末端 VTP的縮寫(xiě)是“X”。具有N-末端VTP的嵌合防衛(wèi)素具有一般結(jié)構(gòu)SXM，其中S和M具有其先 前定義的含義。在此處有用的N-末端VTP的例子顯示在表3中。表3液泡植物蛋白質(zhì)的N-末端前肽(VTP)的例子 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，產(chǎn)生了具有在本文中稱為SMT' , SMT"或SXM類(lèi)型的新 型嵌合防衛(wèi)素。N-末端信號(hào)肽⑶的存在致使蛋白質(zhì)進(jìn)入分泌途徑，在那里信號(hào)肽被去除。 信號(hào)序列S的去除暴露了在N-末端處的X，并且允許XM與高爾基體中的受體結(jié)合，從而最 終導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡。本發(fā)明的新型嵌合防衛(wèi)素對(duì)于在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)是有利的，在所 述轉(zhuǎn)基因植物中它們?cè)试S相比于表達(dá)未修飾的防衛(wèi)素或缺失了尾的防衛(wèi)素的轉(zhuǎn)基因植物 而言更高水平的防衛(wèi)素表達(dá)，并且伴隨著減少的對(duì)于宿主植物的毒性效應(yīng)。本發(fā)明在其最廣泛的方面包括S'、T'和X結(jié)構(gòu)域的靶向使用，以優(yōu)化成熟防衛(wèi) 素在轉(zhuǎn)基因植物中的功效?？梢酝ㄟ^(guò)使用嵌合防衛(wèi)素S' M來(lái)在轉(zhuǎn)基因宿主物種的細(xì)胞中 優(yōu)化內(nèi)部細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和輸出，其中M結(jié)構(gòu)域(就其活性進(jìn)行選擇)與信號(hào)肽S (其與宿主細(xì)胞 種類(lèi)相容)相組合。當(dāng)所選擇的SM類(lèi)型防衛(wèi)素在轉(zhuǎn)基因宿主中弱表達(dá)或者有毒性時(shí)，可 以提供嵌合SMT'或SXM防衛(wèi)素以為了在轉(zhuǎn)基因宿主中的最佳防衛(wèi)素功效。其他嵌合組合 (包括S' MT'、S' MT〃、S〃 MT, S' XM等)在某些特定情況下將會(huì)被認(rèn)為是有用的，如 本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解的。超過(guò)60種植物防衛(wèi)素已得到了鑒定并且通過(guò)氨基酸序列進(jìn)行了表征(Lay和 Anderson 2005 Current Protein and Peptide Science6 :85_101,其通過(guò)提及而合 并入本文，至與此不相矛盾的程度)。全部都被表達(dá)為具有N-末端信號(hào)肽的前防衛(wèi)素 (pre-defensin) 0絕大多數(shù)已知的植物防衛(wèi)素以沒(méi)有CTPP的形式進(jìn)行表達(dá)(SM類(lèi)型)。 罕見(jiàn)地，主要是在茄科物種的花組織中，某些特定的防衛(wèi)素被表達(dá)為除了信號(hào)肽外還具有 CTPP 的前防衛(wèi)素原(pre-prodefensin) (SMT 類(lèi)型)。在進(jìn)行翻譯后加工之后，成熟防衛(wèi)素(M)的長(zhǎng)度為45-54個(gè)氨基酸。全部都具有 至少8個(gè)形成特征性的二硫鍵模式的半胱氨酸殘基。如果從N-末端到C-末端對(duì)這8個(gè)C 殘基依次進(jìn)行編號(hào)，那么植物防衛(wèi)素的二硫鍵模式可以表征為1-8、2-5、3-6和4-7 (參見(jiàn)上文的表1)。已在至少兩種植物防衛(wèi)素中鑒定出了第5個(gè)二硫鍵(Lay和AnderSOn2005)。 在前述的結(jié)構(gòu)框架內(nèi)，極少的氨基酸是保守的，除了所述C殘基外，特別是G34，其為在位置 11處的芳香族氨基酸，隨后為G13、S8和E29 (參見(jiàn)Ml中的通有序列)。所有具有所描述 的對(duì)于植物防衛(wèi)素而言特征性的C-殘基的布置和交聯(lián)模式的M結(jié)構(gòu)域肽在本文中均被定 義為植物防衛(wèi)素，無(wú)論是從自然界中分離的，還是通過(guò)合成或組合方法獲得的。
在本文所描述的某些實(shí)施例中，CTPP由花煙草的花防衛(wèi)素NaDl的33個(gè)氨基酸 (SEQ ID NO :1，殘基73-105)的C-末端延伸來(lái)代表。本文中的其他實(shí)施例通過(guò)證明來(lái)自番 茄(西紅柿(Solanumlycopersicon))防衛(wèi)素TPP3、玉米(玉蜀黍)的防衛(wèi)素ZmESR-6、大 麥凝集素、和從花煙草中分離的蛋白酶抑制劑NaPI的CTPP的VTP功能，而闡明了本發(fā)明的 突破。其他此類(lèi)C-末端結(jié)構(gòu)域是已知的，包括來(lái)自碧冬茄的2種，即PhDl(SEQ ID NO :2， 殘基73-103)和PhD2(SEQ ID NO :3，殘基75-101)。本發(fā)明人現(xiàn)在已證實(shí)了，這些延伸(也 稱為酸性結(jié)構(gòu)域或尾)充當(dāng)在細(xì)胞內(nèi)將轉(zhuǎn)運(yùn)靶向至貯存液泡的前結(jié)構(gòu)域。許多其他液泡易 位肽(VTP)已被鑒定為C-或N-末端前結(jié)構(gòu)域(CTPP和NTPP)，其在除防衛(wèi)素外的其他蛋白 質(zhì)的液泡易位中起作用(圖4 :SEQ ID N0:21-31、35和40-45)。一般而言，已知的C-末端前肽(CTPP)傾向于具有高比例的酸性氨基酸和疏水性 氨基酸?？梢栽诒景l(fā)明中使用任何已知的CTPP或其部分。合適的CTPP的選擇將依賴于對(duì) 于在預(yù)期宿主細(xì)胞內(nèi)的使用而言的適宜性。將SM或SM Δ T防衛(wèi)素的編碼序列與編碼CTPP或者C-或N-末端VTP的序列相組合 導(dǎo)致獲得嵌合防衛(wèi)素原。應(yīng)當(dāng)理解，在轉(zhuǎn)基因宿主中表達(dá)的防衛(wèi)素對(duì)于宿主發(fā)揮各不相同 的水平的毒性，從無(wú)毒到極毒，這依賴于防衛(wèi)素的功能活性和宿主的性質(zhì)。毒性效應(yīng)可以以 本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)識(shí)的許多方式來(lái)表現(xiàn)。所述效應(yīng)可以包括例如細(xì)胞生長(zhǎng)減少、再生效 率降低、再生出的轉(zhuǎn)基因植物的能育性降低以及再生出的植物的異常形態(tài)。毒性程度也可 以響應(yīng)于防衛(wèi)素表達(dá)水平、表達(dá)的組織特異性、當(dāng)表達(dá)發(fā)生時(shí)宿主植物的發(fā)育階段等而發(fā) 生改變。在觀察到表達(dá)防衛(wèi)素的毒性效應(yīng)的任何情況下，可以通過(guò)修飾防衛(wèi)素(經(jīng)由添加 CTPP)來(lái)減少或消除毒性效應(yīng)。所述經(jīng)修飾的防衛(wèi)素在本文中稱為嵌合防衛(wèi)素。當(dāng)在本文 中使用該術(shù)語(yǔ)時(shí)，嵌合防衛(wèi)素(SMT'、SMT"或SXM)區(qū)別于在自然界中存在的具有CTPP的 防衛(wèi)素(SMT類(lèi)型)。裝備有在自然界中不與之相連接的CTPP的任何防衛(wèi)素，SMT'、SMT" 或SXM，被認(rèn)為是嵌合防衛(wèi)素并且構(gòu)成了本發(fā)明的一部分。關(guān)于嵌合防衛(wèi)素的表達(dá)減少或消除未修飾的防衛(wèi)素表達(dá)的毒性效應(yīng)所經(jīng)由的運(yùn) 作方式，申請(qǐng)人未進(jìn)行陳述。盡管申請(qǐng)人已觀察到了作為防衛(wèi)素原進(jìn)行表達(dá)、減少或消除的 毒性和所表達(dá)的防衛(wèi)素原易位至貯存液泡之間的相關(guān)性，以及缺乏CTPP、增加的毒性和缺 乏液泡貯存之間的逆相關(guān)性，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，由CTPP的存在所賦予的其他 活性也可以減少毒性。嵌合防衛(wèi)素轉(zhuǎn)運(yùn)到貯存液泡中可以賦予其他優(yōu)點(diǎn)。一旦它轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中，所表達(dá) 的嵌合防衛(wèi)素就可能被阻止在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮毒性效應(yīng)。宿主細(xì)胞可以耐受比未修飾的防衛(wèi)素 更高水平的嵌合防衛(wèi)素表達(dá)。然而，當(dāng)昆蟲(chóng)或侵襲性真菌引起細(xì)胞的破壞、釋放出防衛(wèi)素并 且病原體暴露于防衛(wèi)素時(shí)，嵌合防衛(wèi)素的表達(dá)為宿主植物提供了針對(duì)致病體的作用的保護(hù) 效應(yīng)。備選地，可以從宿主植物細(xì)胞中收獲嵌合防衛(wèi)素，以在植物外使用，例如作為抗真菌 齊U，或者用于利用防衛(wèi)素的生物學(xué)活性的其他目的。
待表達(dá)的防衛(wèi)素的選擇依賴于所希望的生物學(xué)活性和待表達(dá)的防衛(wèi)素的已知性 質(zhì)。防衛(wèi)素活性可以通過(guò)用于在對(duì)于防衛(wèi)素結(jié)構(gòu)和功能來(lái)說(shuō)不是必需的任意氨基酸位置處 引入單個(gè)或多個(gè)氨基酸替代的組合方法(combinatorial method)來(lái)進(jìn)行優(yōu)化，只要關(guān)于防 衛(wèi)素活性的定量測(cè)定法是可得的。待與所選擇的防衛(wèi)素相組合的CTPP的選擇受宿主植物物種的影響。源自第一植 物物種的CTPP可以在第二植物物種中可比較地起作用。例如，來(lái)自煙草屬(Nicotiana)物 種的CTPP已顯示在轉(zhuǎn)基因棉屬(Gossypium)物種中提供了有效的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和減少的毒 性?？梢酝ㄟ^(guò)使用在其中發(fā)生重組防衛(wèi)素原的表達(dá)的宿主物種的CTPP，或者通過(guò)使用與所 希望的宿主相關(guān)的物種的CTPP，來(lái)優(yōu)化功效。例如，編碼從來(lái)自玉蜀黍的防衛(wèi)素預(yù)測(cè)出的 CTPP (圖 3B 禾口 3D :SEQ ID NO 18，殘基 80-107)的 ZmESR_6cDNA 可以在表達(dá) NaDl 的轉(zhuǎn)基因 玉米中提供最佳保護(hù)，以增加那種農(nóng)作物中的真菌抗性。
可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法常規(guī)地產(chǎn)生雙子葉和單子葉轉(zhuǎn)基因植物?？梢栽趽饺?到植物轉(zhuǎn)化載體中后，在植物或植物細(xì)胞中表達(dá)嵌合防衛(wèi)素。許多植物轉(zhuǎn)化載體是本領(lǐng)域 技術(shù)人員眾所周知且可得的，例如 BIN19(Bevan，(1984)Nucl. Acid Res. 12 :8711_8721)、 pBI 121 (Chen，P-Y 等人，(2003)Molecular Breeding 11 :287_293)、pHEX22 (美國(guó)專利 7，041，877)以及本文中所例示的載體。此類(lèi)載體是本領(lǐng)域眾所周知的，由于其在細(xì)菌例如 根瘤土壤桿菌(Agrobacterimtumefaciens)中和在植物細(xì)胞中復(fù)制的能力而通常稱為“二 元”載體。典型的植物轉(zhuǎn)化載體，例如本文中所例示的，包括用于在待轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中具 有活性的合適的啟動(dòng)子和終止子序列(下文中稱為“植物活性”啟動(dòng)子或終止子)的控制 下表達(dá)選擇標(biāo)記例如NPTII的遺傳元件，用于插入目的基因(包括在合適的植物活性啟動(dòng) 子和植物活性終止子序列的表達(dá)控制下的嵌合防衛(wèi)素基因)的位點(diǎn)，以及位于防衛(wèi)素和選 擇標(biāo)記側(cè)翼的T-DNA邊界(以將基因整合到植物基因組中)。使用根瘤土壤桿菌的菌株，通常是可廣泛獲得的菌株LBA4404，來(lái)轉(zhuǎn)化植物。在構(gòu) 建出攜帶編碼所需蛋白質(zhì)的DNA區(qū)段的植物轉(zhuǎn)化載體后，將該載體用于轉(zhuǎn)化根瘤土壤桿菌 菌株例如LBA4404。然后，將經(jīng)轉(zhuǎn)化的LBA4404用于轉(zhuǎn)化所希望的植物細(xì)胞，其中使用適合 于待轉(zhuǎn)化的植物物種的本領(lǐng)域已知的方案。采用用于選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞以及所選細(xì)胞 的增殖和再生的標(biāo)準(zhǔn)和本領(lǐng)域認(rèn)可的方案，以獲得轉(zhuǎn)基因植物。本文中的實(shí)施例進(jìn)一步公 開(kāi)了用于棉花植物的轉(zhuǎn)化和再生的方法和材料，以及被各種天然和嵌合防衛(wèi)素轉(zhuǎn)化并表達(dá) 各種天然和嵌合防衛(wèi)素的轉(zhuǎn)基因棉花植物。除本文中所例示的那些外，還可以通過(guò)幾種已 知方法中的任何一種，將所希望的DNA區(qū)段轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中。眾所周知的方法的例子包 括微粒轟擊、電穿孔以及其他生物學(xué)載體(包括其他細(xì)菌或病毒)。可以在任何單子葉或雙子葉植物中表達(dá)嵌合防衛(wèi)素。特別地，有用的植物是食物 作物例如玉米(玉蜀黍)、小麥、稻、大麥、大豆、番茄、馬鈴薯和甘蔗，以及油籽作物例如向 日葵和油菜。特別有用的非食物常見(jiàn)作物包括棉花、亞麻和其他纖維作物。花和觀賞性作 物包括玫瑰、康乃馨、碧冬茄、洋桔梗(Iisianthus)、百合、鳶尾、郁金香、香雪蘭、翠雀花、補(bǔ) 血草和天竺葵。用于將載體、嵌合遺傳構(gòu)建體等引入細(xì)胞中的技術(shù)包括但不限于，使用CaCl2的轉(zhuǎn) 化及其變化形式、直接的向原生質(zhì)體中的DNA攝入、PEG介導(dǎo)的向原生質(zhì)體中的攝入、微粒 轟擊、電穿孔、DNA的顯微注射、組織外植體或細(xì)胞的微粒轟擊、核酸對(duì)組織的真空-滲透(vacuum-infiltration)、以及T-DNA介導(dǎo)的從土壤桿菌向植物組織的轉(zhuǎn)移。關(guān)于細(xì)胞的微粒轟擊，將微粒推進(jìn)到細(xì)胞中以產(chǎn)生經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。任何合適的 射彈細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法和裝置可以用于施行本發(fā)明。示例性的操作程序公開(kāi)于Sanford和 Wolf (美國(guó)專利號(hào) 4，945，050,5, 036，006,5, 100，792,5, 371，015)中。當(dāng)使用射彈轉(zhuǎn)化操作 程序時(shí)，遺傳構(gòu)建體可以摻入能夠在待轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中復(fù)制的質(zhì)粒。適合于在此類(lèi)系統(tǒng)中使用的微粒的例子包括0. 1-10 μ m，和更特別地10.5-5 μ m 的鎢或金球體?？梢酝ㄟ^(guò)任何合適的技術(shù)，例如通過(guò)沉淀，來(lái)將DNA構(gòu)建體沉積在微粒上。如本文中所例示的，可以用本發(fā)明的天然或嵌合防衛(wèi)素基因來(lái)轉(zhuǎn)化能夠隨后進(jìn)行 克隆繁殖(無(wú)論是通過(guò)器官發(fā)生，還是通過(guò)胚胎發(fā)生)的植物組織，并由此產(chǎn)生出全植物。 取決于對(duì)于被轉(zhuǎn)化的具體物種而言可獲得并且最適合的克隆繁殖系統(tǒng)，所選擇的具體組織 將會(huì)發(fā)生變化。組織靶的例子包括葉盤(pán)、花粉、胚胎、子葉、下胚軸、雌配子、愈傷組織、現(xiàn)有 的分生組織(例如頂端分生組織、腋芽和根分生組織)、以及誘導(dǎo)的分生組織(例如子葉分 生組織和下胚軸分生組織)?？梢酝ㄟ^(guò)各種方法，例如通過(guò)克隆繁殖或常規(guī)育種技術(shù)，來(lái)繁殖再生出的經(jīng)轉(zhuǎn)化 的植物。例如，第一代(或Tl)經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物可以進(jìn)行自交以產(chǎn)生純合的第二代(或T2) 轉(zhuǎn)化體，和T2植物通過(guò)常規(guī)育種技術(shù)進(jìn)一步進(jìn)行繁殖。因此，在其涉及植物的范圍內(nèi)，本發(fā)明的這個(gè)方面進(jìn)一步延伸至經(jīng)改造從而表達(dá) 本發(fā)明的嵌合防衛(wèi)素的核酸的植物的子代，以及所述植物的營(yíng)養(yǎng)、繁殖和生殖部分，例如花 (包括切割或切斷的花)，植株的部分，來(lái)自植物(例如，棉花)的纖維材料，和生殖部分(包 括插條、花粉、種子和愈傷組織)。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或多細(xì)胞植物或其子代或者 經(jīng)遺傳修飾的植物的部分，其能夠產(chǎn)生由本文所描述的嵌合防衛(wèi)素基因編碼的蛋白質(zhì)或 肽，其中所述轉(zhuǎn)基因植物已獲得與所述蛋白質(zhì)或肽的表達(dá)相關(guān)的新型表型性狀。
實(shí)施例實(shí)施例1 表達(dá)成熟NaDl (減去尾)(SEQ ID NO :31，殘基26-72)的轉(zhuǎn)基因棉花植 物的產(chǎn)生和表征1.轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生使用基因構(gòu)建體PHEX22 (圖5)，由轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因棉花植物。pHEX22包含缺 乏編碼C-末端前結(jié)構(gòu)域的序列的抗真菌NaDl基因(SMA T)。進(jìn)行了兩個(gè)棉花轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(CT 78和CT 83，表4)。使用標(biāo)準(zhǔn)方案(Umbeck P. (1991)Genetic engineering of cotton plants andlines.美國(guó)專利5，004，863),通過(guò) 土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因棉花品系。通過(guò)電穿孔將二元載體PHEX22轉(zhuǎn)移到根瘤 土壤桿菌菌株LBA4404中，并且通過(guò)凝膠電泳來(lái)證實(shí)該質(zhì)粒的存在。將土壤桿菌的培養(yǎng)物 用于感染棉花栽培種Coker 315的下胚軸切片。在35mg/L的抗生素卡那霉素上選擇胚胎發(fā) 生愈傷組織，并且使用用于棉花的標(biāo)準(zhǔn)方案來(lái)使胚胎萌發(fā)。將小植株轉(zhuǎn)移至土壤，并且通過(guò) 免疫印跡分析和ELISA (使用特異性抗血清)來(lái)測(cè)定從編碼SMA T的DNA上的NaDl (SEQID NO :1，殘基26-72)的表達(dá)。表 4
使用pHEX22構(gòu)建體的兩個(gè)棉花轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的概括 2.檢測(cè)在轉(zhuǎn)基因葉組織中的NaDl和植物表型用于NaDl M結(jié)構(gòu)域的ELISA測(cè)定法的方法ELISA 平板(Nunc Maxisorp (In Vitro, Noble Park VIC 3174)#442404)用 100 μ L/孔的在PBS中的一抗(50ng/孔的NaDl抗體(通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法針對(duì)成熟NaDl結(jié)構(gòu) 域(M，SEQ ID N0:1，殘基26-72)而產(chǎn)生的經(jīng)A蛋白純化的多克隆兔抗體))進(jìn)行包被，并 且在潮濕的盒中于4°C溫育過(guò)夜。第二天，用PBS/0.05% (vAOTween 20洗滌平板，2分鐘X4。然后，平板用 200 μ L/孔的在 PBS 中的 3% (w/v) BSA (Sigma A (CastIeHi 11, NSff Australia 1765)-7030 98% ELISA級(jí)別)進(jìn)行封閉，并且于25°C溫育2小時(shí)，隨后用PBS/0. 05% (v/v)Tween 20 進(jìn)行洗滌，2分鐘X 4。關(guān)于葉樣品的制備，使用混合式磨機(jī)(mixer mill)以頻率30將IOOmg冷凍的棉花 葉組織在液氮中研磨2X10秒。向每個(gè)樣品中添加ImL 2% (w/v)不溶性PVP(Polyclar)/ PBS/0. 05% (v/v)Tween20并且使混合物渦旋，離心10分鐘，并收集上清液。在PBS/0. 05% (v/v) Tween 20中制備棉花蛋白質(zhì)提取物的稀釋物，施加至每個(gè)孔(100 μ L/孔)，并且于 25°C溫育2小時(shí)。用PBS/0. 05% (v/v) Tween 20 洗滌平板，2 分鐘 X 4。將在 PBS 中的二抗(50ng/ 孔的經(jīng)生物素標(biāo)記的抗NaDl，其針對(duì)成熟防衛(wèi)素結(jié)構(gòu)域而產(chǎn)生)以IOOyL/孔施加至每個(gè) 孔，并且于25°C溫育1小時(shí)。用PBS/0.05% (v/v) Tween 20 洗滌平板，2 分鐘 X 4。將在 PBS 中的 NeutriAvidin HRP-綴合物(Pierce，Rockford，Il 61105)#31001 ；1 1000稀釋；0. 1 μ L/孔)以 100 μ L/ 孔施加至每個(gè)孔，并且于25°C溫育1小時(shí)。平板用PBS/0.05% Tween 20進(jìn)行洗滌，2分鐘X 4，隨后用H2O進(jìn)行洗滌，2分 鐘X2。通過(guò)下列方式來(lái)制備新鮮的底物將1片ImmunoPure OPD(過(guò)氧化物酶底物) (Pierce, Rockford, Il 61105#34006)溶解在9mL水中，然后添加ImL穩(wěn)定的過(guò)氧化物緩沖 液(10x, Pierce, Rockford, Il 61105#34062)。向每個(gè)孔中添加底物(100 μ L/孔)，并且 于251進(jìn)行溫育。用5(^1^ 2. 5Μ硫酸來(lái)終止反應(yīng)，并且在平板閱讀器中測(cè)量在490nm處的 吸光度。用于Southern印跡分析的方法根據(jù)制造商的指導(dǎo)，使用Qiagen DNeasy 植物小型試劑盒(cat#69104)來(lái)提 取棉花基因組DNA，用30個(gè)單位的限制酶Bcl 1 (Promega, cat#R6651)于37°C對(duì)基因組DNA(10 μ g)消化過(guò)夜。將經(jīng)消化的基因組DNA以35V在0. 8%瓊脂糖凝膠(在IXTBE中) 上電泳16小時(shí)。在轉(zhuǎn)移至膜前，凝膠在0. 2M HCl中處理10分鐘，在1. 5M NaCUO. 5M NaOH 中處理30分鐘，和在IM Tris-HCL pH 7. 5,1. 5M NaCl中處理30分鐘。在室溫下在10XSSC 中通過(guò)毛細(xì)管轉(zhuǎn)移使 DNA 向尼龍膜(Hybond N+, Amersham Biosciences, cat#RPN203B)轉(zhuǎn) 移過(guò)夜。使用1200μ J的UV光(Hoefer UV crosslinker)，將DNA交聯(lián)至膜。使膜于42°C 在 50% ν/ν 甲酰胺、5XSSPE、5X Denhardt，s 溶液、0. 5% SDS w/v和 0. lmg/mL酸降解的鯡精 DNA的溶液中預(yù)雜交6小時(shí)。使用Prim-a-gene標(biāo)記系統(tǒng)，用經(jīng)P32標(biāo)記的dCTP (Promegia, cat#U1100)制備放射性探針。將膜與探針一起于42°C溫育過(guò)夜。將膜于42°C在2XSSC和 0. 1% SDS的溶液中洗滌兩次30分鐘，以去除未結(jié)合的探針。在顯影前，于-80°C使印跡暴 露于 X-RAY 膠片(Fuji，cat#10335)5 天。結(jié)果
通過(guò)ELISA對(duì)原初轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行篩選導(dǎo)致鑒定出表達(dá)可檢測(cè)水平的成熟NaDl 的10株植物(1株植物來(lái)自CT 78，而9株植物來(lái)自CT 83)。成熟NaDl (SEQ ID N0:1，殘基 26-72)的水平在植物中是變化的(表4)。除品系83. 68. 2外，表達(dá)成熟NaDl的所有植物 具有扭曲的或小的葉，常常伴隨有短的節(jié)間(H)。10個(gè)原初轉(zhuǎn)化體中的7個(gè)是不育的， 而其他3個(gè)品系產(chǎn)生具有數(shù)目減少了的種子的棉鈴(78. 131. 1,83. 102,83. 68. 2) 0這些結(jié) 果暗示，成熟NaDl (M結(jié)構(gòu)域)(SEQ ID NO :1，殘基26-72)的存在直接影響了轉(zhuǎn)基因植物的 生長(zhǎng)和發(fā)育。讓ELISA陰性的(即，無(wú)NaDl表達(dá))來(lái)自用pHEX22進(jìn)行的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的11株植物 繼續(xù)在溫室中生長(zhǎng)。這些植物中的9株(82%)具有正常表型，而其他2株具有輕微扭曲的 葉(18%)。這個(gè)結(jié)果類(lèi)似于用棉花進(jìn)行的其他轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。例如，始終存在低數(shù)目的具有不 尋常的表型的植物(小于20%)，這明顯是由于所使用的棉花胚胎發(fā)生再生方法。改變的 表型歸因于通過(guò)組織培養(yǎng)的細(xì)胞傳代。應(yīng)當(dāng)指出，我們先前已產(chǎn)生了表達(dá)編碼具有尾的NaDl (SEQ ID NO :1，殘基1-105) 的DNA的轉(zhuǎn)基因棉花(實(shí)驗(yàn)CT 35，美國(guó)專利7，041，877 ；還可參見(jiàn)實(shí)施例3)。在這個(gè)實(shí)驗(yàn) 中產(chǎn)生的11株小植株中，2株植物(18%)具有不尋常的表型。這兩株植物均沒(méi)有被發(fā)現(xiàn) 表達(dá)NaDl。重要的是，來(lái)自實(shí)驗(yàn)CT 35的3株最高表達(dá)NaDl (加上CTPP) (SEQ IDNO :1，殘 基1-105)的植物(35. 9. 1,35. 105. 1和35. 125. 1)(參見(jiàn)實(shí)施例3)具有正常表型并且是能 育的?；诜珠_(kāi)的ELISA的估計(jì)暗示，在具有防衛(wèi)素加上尾(SMT)的植物中NaDlM結(jié)構(gòu) 域的水平顯著高于在表達(dá)NaDl減去尾(SMAT)的植物中的水平。一個(gè)例外可能是品系 78. 131. 1，其表達(dá)非常高水平的成熟NaDl (SMAT)。這株植物具有扭曲的葉和小的棉鈴。置 6顯示了 2株原初轉(zhuǎn)基因植物82. 23. 2 (A)和83. 96. 2 (B)。植物83. 96. 2具有更高水平的 NaDl表達(dá)(參見(jiàn)表5)并且展示出更嚴(yán)重的表型變異。這兩株植物都是不育的。表 5在實(shí)驗(yàn)CT 78和CT 83中產(chǎn)生的表達(dá)SM Δ T的原初轉(zhuǎn)基因植物的表征。將ELISA結(jié)果評(píng)定為從+(低表達(dá))到++++(最高表達(dá))的等級(jí)。 分離T2植物的評(píng)估使原初轉(zhuǎn)基因品系78. 131. 1進(jìn)行自花傳粉，并且對(duì)子代植物進(jìn)行評(píng)估以測(cè)定異 常表型是否與防衛(wèi)素基因分離。通過(guò)ELISA來(lái)測(cè)定NaDl(M結(jié)構(gòu)域)的表達(dá)(表6)。代表 性的ELISA顯示在圖7中。表6在來(lái)自原初轉(zhuǎn)基因品系78. 131. 1的子代植物中NaDl的表達(dá) 所有表達(dá)NaPI(M結(jié)構(gòu)域)的子代植物展示出與親本轉(zhuǎn)基因植物相同的異常表型(即，嚴(yán)重扭曲的葉)，而所有不表達(dá)NaDl的植物具有正常的表型。圖8A顯示了對(duì)于 78. 131. 1子代植物的觀察的照片。在78. 131. 1的子代中NaDl表達(dá)的分離與原初轉(zhuǎn)基因植物具有一個(gè)拷貝的NaDl 基因相一致(表6)。這通過(guò)Southern印跡分析而得到證實(shí)(圖8B)。這些結(jié)果證實(shí)，缺乏CTPP的成熟NaDl的存在導(dǎo)致不尋常的異常表型。可以得出 結(jié)論，成熟NaDl對(duì)于植物是有毒性的。用包含C-末端尾的NaDl基因(SMT)轉(zhuǎn)化的植物沒(méi) 有展現(xiàn)出異常表型，這暗示CTPP(SEQ ID NO :1，殘基73-105)保護(hù)植物不受該分子的毒性 部分的影響，或者它將該蛋白質(zhì)靶向至液泡，在液泡中該蛋白質(zhì)被隔離起來(lái)。3.免疫印跡分析通過(guò)免疫印跡分析來(lái)評(píng)估通過(guò)ELISA而被確定關(guān)于NaDl而言陽(yáng)性的植物。在 丙酮中從lOOmg葉組織(第一片完全展開(kāi)的葉)之中提取總蛋白質(zhì)，并且使沉淀的蛋白 質(zhì)重懸浮于具有3% PVPP的PBS-T中。在離心后，將上清液調(diào)整至IX LDS樣品緩沖液 (NuPAGE (Invitrogen,Carlsbad,CA 92008))和 5% (v/v) 3 -巰基乙醇。NaDl 抗體(針對(duì) 具有尾的NaDl而制備的)以lmg/ml儲(chǔ)液的1/1000稀釋物進(jìn)行使用。對(duì)照是150或50ng 純化的NaDl，35. 125. 1植物(具有尾的NaDl，純合的)，未轉(zhuǎn)化的Coker。在品系35. 125. 1 (SMT 構(gòu)建體)、78. 131. 1(SMAT|^JM#)和 83. 68. 2 (SM A T 構(gòu)建 體)中檢測(cè)出成熟NaDl (SEQ ID NO :1，殘基26-72)(圖9)。在品系35. 125. 1中檢測(cè)出成 熟NaDl加上CTPP (圖9)。4. NaDl的亞細(xì)胞定位使用免疫熒光(用抗NaDl抗體)來(lái)測(cè)定NaDl在轉(zhuǎn)基因植物中的亞細(xì)胞定位。在固定時(shí)，從相同的葉獲取樣品，并且如上所概述的通過(guò)ELISA測(cè)定法來(lái)測(cè)定 NaDl水平。在品系35. 125. 1和78. 131. 1中的NaDl水平分別為0. 01%和0. 02%的總可溶 性蛋白質(zhì)。將來(lái)自非轉(zhuǎn)基因的Coker、品系35. 125. 1 (用pHEX 3NaDl，SMT構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的)和 品系78. 131. 1(用pHEX22NaDl，SMAT構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的)的葉片段在4%低聚甲醛中進(jìn)行固 定并包埋在石蠟中，并且通過(guò)Austin Health進(jìn)行切片。將切片與抗NaDl抗體(50 y G/mL， 在封閉溶液中)
一起溫育60分鐘，并且在施 加二抗[Alex FlllOr Molecular Probes，在封閉溶液中以1 200進(jìn)行稀釋]之前用 1XPBS進(jìn)行洗滌。切片在Olympus BX50顯微鏡上進(jìn)行顯現(xiàn)，并且使用具有點(diǎn)RT軟件的單色 點(diǎn)照相機(jī)(spotcamera)來(lái)捕獲圖像。防衛(wèi)素，NaDl，存在于來(lái)自品系35. 125. 1的葉細(xì)胞的液泡中，所述品系35. 125. 1 表達(dá)具有CTPP尾的NaDl (SMT構(gòu)建體)(圖10A)。在與免疫前血清進(jìn)行溫育的對(duì)照中，未 觀察到免疫熒光(圖10B)。相反地，NaDl明顯不存在于品系78. 131. 1的液泡中，所述品系 78. 131. 1表達(dá)不含CTPP尾的NaDl (SM AT構(gòu)建體)(圖10C)。這些細(xì)胞中的NaDl在細(xì)胞質(zhì) 和細(xì)胞外空間中形成點(diǎn)狀沉積物。在與免疫前血清一起進(jìn)行溫育的對(duì)照中，在液泡中未檢 測(cè)出熒光，未觀察到免疫熒光(圖10D)。與在35. 125. 1轉(zhuǎn)化體(具有CTPP尾的NaDl)中 的葉細(xì)胞相比較，在78. 131. 1轉(zhuǎn)化體中的葉細(xì)胞看起來(lái)更小，并且具有更不規(guī)則的形狀。 這個(gè)觀察結(jié)果可以解釋圖8中所呈現(xiàn)的改變的葉形態(tài)。實(shí)施例2 在轉(zhuǎn)基因植物中具有C-末端前肽的防衛(wèi)素前體的鑒定
使用CTPP特異性抗體，如實(shí)施例1中所描述的，通過(guò)免疫印跡分析來(lái)測(cè)試來(lái)自花 煙草的未成熟芽和來(lái)自轉(zhuǎn)基因棉花品系35. 125. 1 (具有尾的NaDl，純合的)的葉的蛋白質(zhì) 樣品(ill)。轉(zhuǎn)基因棉花品系35. 125. 1先前在美國(guó)專利7，041，877中進(jìn)行了描述，該專 利通過(guò)提及而合并入本文。它的實(shí)施例11公開(kāi)了用編碼NaDl (在那里稱為NaPdfl)的全 長(zhǎng)(SMT)核酸轉(zhuǎn)化的品系35. 125. 1。在提取緩沖液(lOOmMTris HClUOmM EDTA、2mM CaCl2 禾日 15mM 3 -巰基乙醇， 1 4)中，從未成熟的花煙草芽中提取總可溶性蛋白質(zhì)。在丙酮中，從35. 125. 1的葉組織 中提取蛋白質(zhì)，并且使粒狀沉淀重懸浮于提取緩沖液中。在離心后，將上清液調(diào)整至1XLDS 樣品緩沖液(NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad, CA 92008))和 5% (v/v) 3 -巰基乙醇。經(jīng) A 蛋白純化的CTPP抗體以lmg/ml儲(chǔ)液的1/500稀釋物進(jìn)行使用。對(duì)照是lug純化的NaDl。關(guān)于CTPP抗體的產(chǎn)生，化學(xué)合成NaDl的具有33個(gè)氨基酸的CTPP(SEQ ID NO 1，殘基73-105)(其在C-末端處具有額外的半胱氨酸殘基)(VFDEKMTKTGAEILAEEAKTLAAA LLEEEIMDNC) (SEQ ID NO :42)，以促進(jìn)所述肽與載體蛋白的綴合。根據(jù)制造商的指導(dǎo)，將所 述CTPP肽化學(xué)交聯(lián)至經(jīng)馬來(lái)酰亞胺活化的大匙孔帽貝(Megathuracrenulata)匙孔血藍(lán) 蛋白(KLH) ( Imject ，來(lái)自 Pierce，Rockford，II 61105)。使經(jīng)綴合的肽在 PD-10 柱 (Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)上進(jìn)行脫鹽，然后注射入兔中以用于產(chǎn)生 多克隆抗體，如先前在Lay等人(2003，同上)中所描述的。在花煙草的未成熟芽中和在品系35. 125. 1的葉中檢測(cè)出成熟NaDl加上CTPP(SEQ ID NO :1，殘基 26-105)(圖 11A)。緊在用CTPP抗體進(jìn)行探測(cè)后，印跡用NaDl抗體(lmg/ml儲(chǔ)液的1/1000稀釋物) 再次探測(cè)過(guò)夜。在未成熟芽中檢測(cè)出成熟NaDl (SEQID NO :1，殘基26-72)(圖11B)。結(jié)果證明，通過(guò)編碼全長(zhǎng)NaDl (SMT)的DNA轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因棉花植物表達(dá)成熟結(jié)構(gòu) 域(M)和成熟結(jié)構(gòu)域加上尾(MT)，如在實(shí)施例1，圖9，泳道4中所描述的，并且通過(guò)如上 所述使用針對(duì)NaDl CTPP的多肽特異性抗體而得到證實(shí)。此處的數(shù)據(jù)不同于在美國(guó)專利 7，041，877中報(bào)道的數(shù)據(jù)(參見(jiàn)例如，那里的圖14),其顯示出從轉(zhuǎn)基因煙草中提取的與抗 體具有反應(yīng)性的NaDl的單個(gè)條帶。這一明顯差異的解釋被認(rèn)為是由于經(jīng)改善的提取，特別 是在丙酮沉淀的使用方面?，F(xiàn)在，顯然的是，在全長(zhǎng)(SMT)NaDl的翻譯后加工之后，保留了 一部分的 NaDl CTPP。實(shí)施例3 在表達(dá)NaDl的轉(zhuǎn)基因棉花中蝕脈尖鐮孢(Fov)感染的抑制轉(zhuǎn)基因棉花品系35. 125. 1先前在美國(guó)專利7，041，877中進(jìn)行了描述，該專利通過(guò) 提及而合并入本文。它的實(shí)施例11公開(kāi)了用編碼NaDl (在那里稱為NaPdfl)的全長(zhǎng)(SMT) 核酸轉(zhuǎn)化的品系35. 125. 1。它的實(shí)施例8公開(kāi)了，20iig/mL的純化的NaDIM結(jié)構(gòu)域在體外 抑制了灰葡萄孢和石竹尖鐮孢的生長(zhǎng)。使用受感染的土壤的溫室生物測(cè)定法溫室受感染土壤生物測(cè)定法用于評(píng)估品系35. 125. 1中對(duì)于Fov的抗性水平。在 粟中制備Fov(從棉花中分離的澳大利亞分離物VCG01111#24500。來(lái)自Wayne 0，Neill, Farming Systems Institute,DPI, Queensland, Australia)白勺.# ，#_@^#入± 壤混合物中。在1/4強(qiáng)度的馬鈴薯右旋糖培養(yǎng)液(6g/L馬鈴薯右旋糖)中制備Fov的培養(yǎng) 物，并且于26°C生長(zhǎng)約1周。將該培養(yǎng)物(5-10mL)用于感染經(jīng)高壓滅菌的脫殼的粟，隨后讓
35其在室溫下生長(zhǎng)2-3周。通過(guò)在200L堆肥大玻璃杯中用力混合，將受感染的粟以(v/v) 摻入到經(jīng)巴氏滅菌的基于泥炭的土壤混合物中。將受感染的土壤轉(zhuǎn)移至塑料容器(10L混 合物/13.5L容器)。對(duì)照土壤包含未感染的粟。將受感染的土壤用于生長(zhǎng)品系35. 125. 1、 Siokra 1-4 (對(duì)于Fov易感的)、Sicot 189 (較不易感的；工業(yè)標(biāo)準(zhǔn))和未轉(zhuǎn)化的Coker。 種植每個(gè)品種/品系的八十七粒(87)種子。將種子直接播種到容器中，12粒種子/盒，以 3X4陣列。在每個(gè)盒中隨機(jī)播種每個(gè)品系的2-3粒種子，并且使盒每周進(jìn)行旋轉(zhuǎn)和移動(dòng)，以 減少由于在溫室中的位置而可能出現(xiàn)的變化。使植物生長(zhǎng)8周。在該試驗(yàn)自始至終測(cè)量高 度和癥狀發(fā)展，并且在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)通過(guò)破壞性取樣來(lái)測(cè)定疾病得分。結(jié)果疾病發(fā)生率在該生物測(cè)定法中是高的，并且追蹤疾病的進(jìn)程8周。易感的品種 Siokra 1-4和未轉(zhuǎn)化的Coker首先顯示出在葉中的萎蔫，而較不易感的品種Sicot 189(澳 大利亞棉花工業(yè)標(biāo)準(zhǔn))和轉(zhuǎn)基因品系35. 125. 1 (D1)在幾天后才開(kāi)始顯示萎蔫癥狀。到第 33天時(shí)，約83%的Siokra 1-4和76%的未轉(zhuǎn)化的Coker植物顯示出癥狀，而對(duì)于Sicot 189和轉(zhuǎn)基因品系35. 125. 1 (D1)來(lái)說(shuō)，分別僅26%和36%顯示出癥狀。在植物存活方面可見(jiàn)類(lèi)似的傾向(圖12)。易感的品種Siokra 1-4的植物首先死 亡，并且到該生物測(cè)定法結(jié)束時(shí)，僅5%的Siokra 1-4植物存活。未轉(zhuǎn)化的Coker植物的存 活是中等的(最終存活為38%)，而Sicot 189和品系35. 125. 1的植物具有顯著更低的死 亡率(最終存活分別為61%和57%，表7)。在該生物測(cè)定法結(jié)束時(shí)，通過(guò)對(duì)在每株植物的橫截面中維管變褐的量進(jìn)行評(píng)分， 來(lái)就疾病對(duì)植物進(jìn)行評(píng)估(表7)。易感的品種Siokral-4具有最高的疾病得分(4. 9)，而 較不易感的品種Sicot 189和轉(zhuǎn)基因品系35. 125. 1具有最低的疾病得分(3. 3和3. 6)。未 轉(zhuǎn)化的Coker對(duì)照具有4. 0的疾病得分，這在較不易感的品種(Sicot 189)和易感的品種 (Siokra 1-4)中間。使用順序邏輯回歸(ordinal logistic regression)來(lái)分析疾病得分，并且使用 邏輯回歸(logistic regression)來(lái)分析死亡率。表8顯示了所測(cè)試的4個(gè)品系的疾病得 分的成對(duì)比較。所有品系(未轉(zhuǎn)化的Coker、Sicot 189和品系35. 125. 1)顯著優(yōu)于Siokra 1-4，以< 0. 001的p值。在轉(zhuǎn)基因品系35. 125. 1和親本Coker的疾病得分之間存在顯著 差異(P = 0. 04)。對(duì)于植物死亡率也看到了類(lèi)似的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表9)。表7在溫室中的受鐮孢感染的土壤的生物測(cè)定法的結(jié)果 *所有發(fā)芽的種子的平均值。0 =無(wú)癥狀，1 =維管變褐至莖的基部，2 =維管變褐 至子葉，3 =維管變褐越過(guò)子葉，4 =維管變褐至真葉，5 =死亡。表8疾病得分?jǐn)?shù)據(jù)的分析 表9植物死亡率數(shù)據(jù)的分析 田間試驗(yàn)在2006-2007年的棉花季節(jié)，在田間試驗(yàn)中評(píng)估轉(zhuǎn)基因品系35. 125. 1 (品系D1)、 未轉(zhuǎn)化的Coker 315和較不易感的品種Sicot 189 (澳大利亞工業(yè)標(biāo)準(zhǔn))。植物在澳大利 亞昆士蘭州的Darling Downs地區(qū)中的農(nóng)場(chǎng)之中生長(zhǎng)。用手將種子種植到已知受Fov感 染的土壤中。在4個(gè)重復(fù)地塊中種植總共800粒種子/品種，每個(gè)地塊包含200粒種子/ 品種。記錄出苗和植物存活。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，通過(guò)測(cè)量在盡可行地接近地平面處切下的主 莖的橫截面中可見(jiàn)的維管變色，來(lái)就疾病對(duì)植物進(jìn)行評(píng)估(csd. net. au/，在萬(wàn)維網(wǎng)上，2007 Variety Guide)。結(jié)果
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在該季節(jié)早期種植下種子和有利的天氣條件(早雨和幾天的低溫)導(dǎo)致非常高的 疾病發(fā)生率。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)關(guān)于植物存活的結(jié)果顯示在_中。關(guān)于未轉(zhuǎn)化的Coker看 到最高的死亡率，其中僅7. 5%的植物存活。轉(zhuǎn)基因品系D1具有22%的植物存活，和Si cot 189具有36%的植物存活(圖13)。此外，轉(zhuǎn)基因品系D1具有比非轉(zhuǎn)基因Coker對(duì)照(疾 病得分24)更高的疾病得分(66)，即更高的對(duì)于尖鐮孢的抗性?？傮w轉(zhuǎn)基因品系D1具有比 存活的非轉(zhuǎn)基因Coker對(duì)照植物高10-12%的產(chǎn)量(棉鈴重量)?！捌骄a(chǎn)量/植物”對(duì)于 品系D1來(lái)說(shuō)為52g，而對(duì)于Coker對(duì)照來(lái)說(shuō)為45g。這些結(jié)果類(lèi)似于溫室生物測(cè)定法數(shù)據(jù)， 并且顯示，轉(zhuǎn)基因品系具有相比于未轉(zhuǎn)化的Coker 315親本而言經(jīng)改善的對(duì)于Fov的抗性。實(shí)施例4使用構(gòu)津體dHEX98(圖14A)在番茄葉和棉花子葉中瞬時(shí)表達(dá)嵌合防衛(wèi)素，SMT" 類(lèi)型。S和M結(jié)構(gòu)域是NaDl的序列(SEQ ID NO :1，殘基1-72) ；T"獲自TPP3 (SEQ ID NO: 8)，番茄(西紅柿(Solanumlycopersicum))的防衛(wèi)素。C-末端TPP3酸性結(jié)構(gòu)域(T")的 氨基酸序列(SEQ ID NO :8，殘基74-105 和圖3A)在Lay等人(2003，同上)和Genbank登 錄號(hào)U20591中給出。例示的嵌合防衛(wèi)素圖示在圖14B中。將DHEX98(圖14A)引入到根瘤土壤桿菌中，并且使用棉花子葉或番茄葉通過(guò)瞬 時(shí)測(cè)定法來(lái)測(cè)定NaDl的表達(dá)。將土壤桿菌的細(xì)菌“菌苔”涂布在選擇性平板上，并且在黑 暗中于30°C生長(zhǎng)3天。然后，將細(xì)菌在滲透緩沖液(10mM氯化鎂和lOym乙酰丁香酮(在 DMS0中的0. 1M儲(chǔ)液))中重懸浮至1. 0的0D60CL，并且在室溫下溫育2_4小時(shí)。在滲透之 前，讓棉花植物在控溫生長(zhǎng)箱(25°C，16小時(shí)/8小時(shí)的光照/黑暗循環(huán))中生長(zhǎng)8天。通 過(guò)將lmL注射器輕輕按壓在子葉上并且用土壤桿菌懸浮液充滿子葉腔，來(lái)對(duì)子葉的下側(cè)進(jìn) 行滲透。在子葉的頂側(cè)上注意到滲透區(qū)域(通過(guò)變黑來(lái)指明)。每個(gè)子葉施行最多4次滲 透。讓植物再生長(zhǎng)4天。然后，切掉經(jīng)滲透的區(qū)域，稱重，并在液氮中進(jìn)行冷凍。對(duì)于來(lái)自3 周齡番茄幼苗的葉使用相同操作程序。如實(shí)施例1和3中所描述的，通過(guò)ELISA和免疫印 跡來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)表達(dá)。關(guān)于在番茄葉(圖14C)和棉花子葉(圖14D)中的NaDl表達(dá)的ELISA測(cè)定法闡 明了，從PHEX98構(gòu)建體上表達(dá)出NaDl，并且用TPP3尾(T 〃 )替代NaDl尾(T)對(duì)于NaDl 積累沒(méi)有顯著影響。也就是說(shuō)，TPP3尾與NaDl尾一樣有效。所表達(dá)的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印 跡分析(圖14E)顯示，從PHEX98構(gòu)建體產(chǎn)生的防衛(wèi)素主要是成熟NaDl。也就是說(shuō)，TPP3 尾被有效地從成熟NaDl結(jié)構(gòu)域(M)上加工下來(lái)。使用pHEX98構(gòu)建體在轉(zhuǎn)基因番茄中穩(wěn)定表達(dá)上文所描述的嵌合防衛(wèi)素。由于轉(zhuǎn) 基因番茄中的NaDl表達(dá)，所述嵌合防衛(wèi)素提供了增強(qiáng)的真菌抗性。TPP3尾的使用提供了轉(zhuǎn) 運(yùn)功能，以用于使NaDl移動(dòng)至貯存液泡和用于改善NaDl M結(jié)構(gòu)域在轉(zhuǎn)基因番茄細(xì)胞中的 毒性效應(yīng)。通過(guò)用于番茄轉(zhuǎn)化的已知技術(shù)來(lái)施行轉(zhuǎn)化，其中使用具有上文所描述的SMT'嵌 合序列的二元載體(McCormick，S.等人(1986)PlantCell R印.5 :81_84)。通過(guò)已知的番茄轉(zhuǎn)化方法來(lái)再生轉(zhuǎn)化體。使用實(shí)施例1-3中所描述的ELISA測(cè)試， 就NaDl (M結(jié)構(gòu)域)表達(dá)來(lái)檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基因植物的幼苗。基本上如本文中所述的，就真菌抗性和 對(duì)昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的毒性來(lái)測(cè)試具有正常形態(tài)且表達(dá)可檢測(cè)量的NaDl的植物?？梢酝ㄟ^(guò)下列方式來(lái)達(dá)到表達(dá)的進(jìn)一步優(yōu)化將TPP3的S(SEQ IDN0 :8，殘基1-25)和T(SEQ ID NO :8，殘基74-105)結(jié)構(gòu)域與NaDl的成熟(M)防衛(wèi)素結(jié)構(gòu)域相組合，以 形成被設(shè)計(jì)用于在轉(zhuǎn)基因番茄中NaDl成熟結(jié)構(gòu)域的最佳表達(dá)的S' MT'的嵌合防衛(wèi)素。實(shí)施例5使用構(gòu)津體dHEX89(圖15A)在棉花子葉中瞬時(shí)表汰嵌合防衛(wèi)素，SMT'類(lèi)型。S和 M結(jié)構(gòu)域是NaDl的序列(SEQ ID N0:1，殘基1_72) ；T'獲自NaPI，來(lái)自花煙草的蛋白酶抑 制劑(SEQ ID N0:35 還可參見(jiàn)圖4 (圖15B))。C-末端NaPI液泡靶向序列的氨基酸序列 在美國(guó)專利6，031，087中給出，所述專利通過(guò)提及而合并入本文，至與此不相矛盾的程度。 例示的嵌合防衛(wèi)素圖示在圖15B中?？梢酝ㄟ^(guò)下列方式來(lái)達(dá)到表達(dá)的進(jìn)一步優(yōu)化將NaPI的信號(hào)肽(S')和C-末端 液泡靶向序列(T')與NaDl的成熟(M)防衛(wèi)素結(jié)構(gòu)域相組合，以形成被設(shè)計(jì)用于在轉(zhuǎn)基因 棉花中NaDl成熟結(jié)構(gòu)域的最佳表達(dá)的S' MT'的嵌合防衛(wèi)素。用于表達(dá)S' MT'的構(gòu)建 體PHEX80在圖15C中給出，并且蛋白質(zhì)產(chǎn)物的圖示呈現(xiàn)在圖15D中。如實(shí)施例4中所述的，進(jìn)行在棉花子葉中pHEX89和pHEX80的瞬時(shí)表達(dá)。通過(guò) ELISA對(duì)于NaDl表汰的定量旱.現(xiàn)在圖14D中。從pHEX89 (SMT‘)和pHEX80 (S‘ MT‘)構(gòu) 建體表達(dá)出NaDl。在棉花中的瞬時(shí)表達(dá)期間，用NaPI尾替代NaDl尾對(duì)于NaDl積累沒(méi)有 顯著影響。在PHEX80構(gòu)建體中用NaPI的信號(hào)序列替代NaDl信號(hào)序列增加了 NaDl的表達(dá) (圖14D)。所表達(dá)的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印跡分析(圖14E)顯示，成熟防衛(wèi)素在從PHEX89和 PHEX80構(gòu)建體上表達(dá)期間積累。也就是說(shuō)，NaPI尾被有效地從成熟NaDl防衛(wèi)素結(jié)構(gòu)域(M) 上去除。為了證實(shí)NaPI尾足以將NaDl靶向液泡，制備了這樣的DNA構(gòu)建體，所述DNA 構(gòu)建體在綠色熒光蛋白(GFP)以及隨后的NaPI CTPP的編碼序列之前編碼NaPI信號(hào)肽 (PHEX96)。還制備了不含編碼NaPICTPP的DNA的相同構(gòu)建體(pHEX97)(圖16A)。將編碼 具有NaPI信號(hào)肽和NaDl CTPP的GFP的pHEX70用于證明，NaDlCTPP也足以將蛋白質(zhì)導(dǎo)向 液泡。如在實(shí)施例4中對(duì)于棉花所描述的，在本氏煙草的葉中瞬時(shí)表達(dá)這些構(gòu)建體，并且使 用Leica共焦顯微鏡來(lái)檢查GFP熒光。 從pHEX96和pHEX70 [GFP+NaPI CTPP]構(gòu)建體產(chǎn)生的GFP在液泡中積累，而在細(xì)胞 質(zhì)和細(xì)胞外空間中檢測(cè)出來(lái)自PHEX97構(gòu)建體的GFP (無(wú)CTPP的GFP)(圖16B)。使用pHEX89構(gòu)建體在轉(zhuǎn)基因棉花中穩(wěn)定表達(dá)SMT'類(lèi)型嵌合防衛(wèi)素。由于轉(zhuǎn)基因 棉花中的NaDl表達(dá)，該嵌合防衛(wèi)素提供了相比于未轉(zhuǎn)化的親本品系而言增強(qiáng)的真菌抗性。 NaPI尾的使用提供了轉(zhuǎn)運(yùn)功能，以用于使NaDl移動(dòng)至貯存液泡和用于改善NaDl M結(jié)構(gòu)域 在轉(zhuǎn)基因棉花細(xì)胞中的毒性效應(yīng)。通過(guò)用于棉花轉(zhuǎn)化的已知技術(shù)來(lái)施行轉(zhuǎn)化，其中使用具有上文所描述的SMT'嵌 合序列的二元載體。通過(guò)已知的棉花轉(zhuǎn)化方法來(lái)再生轉(zhuǎn)化體(實(shí)施例1)。使用實(shí)施例1-3中所描述 的ELISA測(cè)試，就NaDl表達(dá)來(lái)檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基因植物的幼苗?；旧先绫疚闹兴龅?，就真菌抗 性來(lái)測(cè)試具有正常形態(tài)且表達(dá)可檢測(cè)量的NaDl的植物?？梢酝ㄟ^(guò)下列方式來(lái)達(dá)到表達(dá)的進(jìn)一步優(yōu)化將NaPI的S和C_末端液泡靶向序 列與NaDl的成熟(M)防衛(wèi)素結(jié)構(gòu)域相組合，以形成被設(shè)計(jì)用于在轉(zhuǎn)基因棉花中NaDl成熟 結(jié)構(gòu)域的最佳表達(dá)的S' MT'的嵌合防衛(wèi)素。
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實(shí)施例6使用DHEX44(圖17A)在棉花和本氏煙草中瞬時(shí)表汰嵌合防衛(wèi)素，SMT'類(lèi)型。本氏 煙草是來(lái)自 Richard McKnight,University of Utago，New Zealand的贈(zèng)予。該植物也可得 自商業(yè)來(lái)源。S和M結(jié)構(gòu)域是先前所描述的NaDl的序列；T'是截短形式的NaDl CTPP(^ 17B)。所述 CTPP 由 NaDl CTPP 的前 4 個(gè)氨基酸(VDFE)(圖 4 ；SEQ ID NO :1，殘基 73-76) 組成。如實(shí)施例4中所述的，進(jìn)行在棉花子葉中PHEX44的瞬時(shí)表達(dá)。通過(guò)ELISA對(duì)于 NaDl表汰的定量旱.現(xiàn)在圖17C中。將完整的具有33個(gè)氨基酸的NaDlCTPP⑴截短至4個(gè) 氨基酸(VFDE)并沒(méi)有取消NaDl表達(dá)，但導(dǎo)致NaDl積累大為減少。當(dāng)構(gòu)建體在本氏煙草中 瞬時(shí)表達(dá)并且在蛋白質(zhì)印跡上檢查NaDl產(chǎn)生時(shí)，從具有截短的CTPP的構(gòu)建體(pHEX44)上 NaDl產(chǎn)生的減少也是明顯的(圖17D)。使用pHEX44構(gòu)建體來(lái)進(jìn)行棉花轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。如實(shí)施例1中所述的，通過(guò)土壤桿菌介 導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因棉花品系。如實(shí)施例1中所述的，通過(guò)使用特異性抗血清的ELISA 來(lái)測(cè)定從編碼SMT'的DNA上NaDl(SEQ ID NO :1，殘基26-72)的表達(dá)。從處于組織培養(yǎng)中 的小植株收集葉樣品。鑒定出表達(dá)可檢測(cè)水平的成熟NaDl的5株植物(圖17E)。表達(dá)水平低于當(dāng)使用 已用pHEX3構(gòu)建體(SMT)轉(zhuǎn)化的純合品系35. 125. 1 (美國(guó)專利7，041，877)時(shí)通常獲得的 那些表達(dá)水平(圖17E)?？傊?，四氨基酸元件(VFDE，通4)對(duì)于NaDl (M)的完全表達(dá)來(lái)說(shuō)不是足夠的。然而， 例示的嵌合防衛(wèi)素可以提供增強(qiáng)的通過(guò)在轉(zhuǎn)基因棉花和煙草中的NaDl表達(dá)而提供的真菌 抗性。實(shí)施例7使用DNA構(gòu)建體pHEX92 (圖18A)在棉花子葉中瞬時(shí)表達(dá)嵌合防衛(wèi)素，SMT"類(lèi)型 (參見(jiàn)實(shí)施例4)。S和M結(jié)構(gòu)域是NaD2的序列(SEQID NO 33) ；T"獲自NaDl (SEQ ID NO 1，殘基73-105)(圖18B)。為了進(jìn)行比較，還在棉花子葉中瞬時(shí)表達(dá)了編碼不含C-末端尾 (T)的NaD2的S和M結(jié)構(gòu)域(圖18C)的第二種構(gòu)建體pHEX91 (圖18B)。NaD2 (SM)的核酸 和氨基酸序列呈現(xiàn)在圖19中。如實(shí)施例4中所述的，進(jìn)行在棉花子葉中pHEX92和91的瞬時(shí)表達(dá)。通過(guò)ELISA對(duì) 于NaD2表達(dá)的定量呈現(xiàn)在圖18D中。與從pHEX91構(gòu)建體(其編碼不含C-末端尾的NaD2) 產(chǎn)生的NaD2的水平相比較，向NaD2防衛(wèi)素(M)添加NaDl尾增加了在瞬時(shí)表達(dá)期間積累的 NaD2的水平。使用NaD2抗體的免疫印跡證實(shí)，從pHEX92構(gòu)建體(NaD2防衛(wèi)素加上NaDl CTPP)產(chǎn)生了更多的NaD2，并且NaDlCTPP已通過(guò)蛋白水解而被去除(圖18E)。使用pHEX92構(gòu)建體在轉(zhuǎn)基因擬南芥和棉花中穩(wěn)定表達(dá)SMT"類(lèi)型嵌合防衛(wèi)素。由 于轉(zhuǎn)基因棉花中的NaD2表達(dá)，該嵌合防衛(wèi)素提供了相比于未轉(zhuǎn)化的親本品系而言增強(qiáng)的 真菌抗性。NaDl尾的使用提供了轉(zhuǎn)運(yùn)功能，以用于使NaD2移動(dòng)至貯存液泡和用于改善以不 含尾形式表達(dá)的NaD2在轉(zhuǎn)基因棉花細(xì)胞中的毒性效應(yīng)。通過(guò)用于棉花轉(zhuǎn)化的已知技術(shù)來(lái)施行轉(zhuǎn)化，其中使用具有上文所描述的SMT'嵌 合序列的二元載體。通過(guò)已知的棉花轉(zhuǎn)化方法來(lái)再生轉(zhuǎn)化體。使用實(shí)施例1-3中任一個(gè)之中所描述的ELISA測(cè)試，就NaD2(M結(jié)構(gòu)域)表達(dá)來(lái)檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基因植物的幼苗，除了針對(duì)NaD2(SEQ ID NO: 33，殘基32-78)來(lái)制備抗體外?；旧先绫疚闹兴龅模驼婢剐詠?lái)測(cè)試具有正常形態(tài) 且表達(dá)可檢測(cè)量的NaD2(SEQ ID NO 33)的植物。實(shí)施例8使用DNA構(gòu)津體dHEX76(圖20A)在棉花子葉中瞬時(shí)表達(dá)嵌合防衛(wèi)素，SMT 〃類(lèi) 型。S 和 M 結(jié)構(gòu)域是 Rs-AFP2 的序列(SEQ ID NO 16) ；T〃 獲自 NaDl(SEQ ID N0:1，殘基 73-105)。Rs-AFP2的氨基酸序列旱現(xiàn)在圖3和SEQ ID NO: 17中。如實(shí)施例4中所述的，進(jìn)行在棉花子葉中PHEX76的瞬時(shí)表達(dá)。使用針對(duì)來(lái)自NaDl 的CTPP的抗體(關(guān)于該抗體的描述可參見(jiàn)實(shí)施例2)，采用蛋白質(zhì)印跡來(lái)達(dá)到蛋白質(zhì)表達(dá) 的分析。從pHEX76構(gòu)建體產(chǎn)生Rs-AFP2加上CTPP(MT〃 )(圖20C)。有趣的是，從pHEX76 上的表達(dá)看起來(lái)高于從PHEX43和pHEX3構(gòu)建體上的表達(dá)，所述pHEX43和pHEX3構(gòu)建體編 碼NaDl (M)+NaDlCTPP(T)。這個(gè)結(jié)果可能是所產(chǎn)生的防衛(wèi)素的水平或從成熟防衛(wèi)素結(jié)構(gòu)域 上去除NaDlCTPP(T)的速率的反映。對(duì)于評(píng)估Rs_AFP(M)積累，針對(duì)Rs_AFP(M)的抗體是 不可用的。在轉(zhuǎn)基因棉花棺物中穩(wěn)定表汰圖20A和20B的SMT'嵌合防衛(wèi)素。例示的嵌合 防衛(wèi)素「圖20B1提供了增強(qiáng)的通過(guò)在轉(zhuǎn)基因棺物中的Rs-AFP2(SEQ ID N0:17)表達(dá)而 提供的真菌抗性。NaDl尾(SEQ IDN0 :1，殘基73-105)的使用提供了轉(zhuǎn)運(yùn)功能，以用于使 Rs-AFP2 (SEQID NO 17)移動(dòng)至貯存液泡和改善Rs_AFP2在轉(zhuǎn)基因雙子葉和單子葉細(xì)胞中 的毒性效應(yīng)。如本文實(shí)施例1中所述的，進(jìn)行棉花的轉(zhuǎn)化和再生。使用針對(duì)RS-AFP2而產(chǎn)生的 抗體，采用ELISA測(cè)試就Rs-AFP2(M結(jié)構(gòu)域)(SEQID N0 :17，殘基30-80)表達(dá)來(lái)檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基 因植物的幼苗?；旧先绫疚闹兴龅?，就真菌抗性來(lái)測(cè)試具有正常形態(tài)且表達(dá)可檢測(cè)量 的Rs-AFP2的植物。實(shí)施例9使用DNA構(gòu)建體pHEX63 (圖21A)在棉花子葉和本氏煙草葉中瞬時(shí)表達(dá)嵌合防衛(wèi) 素，SMT'類(lèi)型。S和M結(jié)構(gòu)域是NaDl的序列(SEQ IDN0 :1，殘基1-72) ；T'獲自BL，大麥 (Hordeum vulgare)的凝集素(SEQ ID NO 24)(圖21B)。來(lái)自大麥凝集素(BL)的C-末端 液泡靶向序列的氨基酸序列在圖4中給出。如實(shí)施例4中所述的，進(jìn)行PHEX63的瞬時(shí)表達(dá)。通過(guò)ELISA來(lái)進(jìn)行在棉花子葉中 蛋白質(zhì)表達(dá)的分析(圖21C)。當(dāng)考慮幼苗間的變化時(shí)，將NaDl CTPP(T)交換成來(lái)自大麥凝 集素的CTPP序列對(duì)于表達(dá)水平?jīng)]有重大影響。在本氏煙草葉中瞬時(shí)表達(dá)PHEX63期間獲得 了類(lèi)似的結(jié)果(圖21D)。有趣的是，所表達(dá)的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印跡分析(圖21E)表明，大 麥凝集素CTPP結(jié)構(gòu)域比NaDl CTPP(T)更加有效地被從NaDl成熟防衛(wèi)素(M)上加工下來(lái)。使用DNA構(gòu)建體pHEX63在經(jīng)轉(zhuǎn)化的棉花植物中穩(wěn)定表達(dá)圖21B的SMT ‘類(lèi)型嵌合 防衛(wèi)素。如實(shí)施例1中所述的進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其中使用具有上文所描述的SMT'嵌合序列的二元 載體。如先前所描述的，再生轉(zhuǎn)化體。使用實(shí)施例1-3中任一個(gè)之中所描述的ELISA測(cè) 試，就NaDl (M結(jié)構(gòu)域)表達(dá)來(lái)檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基因植物的幼苗?；旧先绫疚乃龅模驼婢剐?來(lái)測(cè)試具有正常形態(tài)且表達(dá)可檢測(cè)量的NaDl的植物。
例示的嵌合防衛(wèi)素提供了增強(qiáng)的通過(guò)在轉(zhuǎn)基因植物中的NaDl表達(dá)而提供的真菌 抗性。BL尾的使用提供了轉(zhuǎn)運(yùn)功能，以用于使NaDl移動(dòng)至貯存液泡和改善NaDl在轉(zhuǎn)基因 雙子葉和單子葉細(xì)胞中的毒性效應(yīng)。實(shí)施例10使用DNA構(gòu)建體pHEX62 (圖22A)在棉花子葉中瞬時(shí)表達(dá)嵌合防衛(wèi)素，SMT"類(lèi)型。 S和M結(jié)構(gòu)域是NaDl的序列(SEQ ID NO :1，殘基1-72) ；T"獲自ZmESR-6，玉米(玉蜀黍) 的防衛(wèi)素(SEQ ID NO :18，殘基80-107)「圖22B1。來(lái)自ZmESR-6的C-末端靶向序列的氨 基酸序列在a^s和迎中給出。如實(shí)施例4中所述的，進(jìn)行PHEX63的瞬時(shí)表達(dá)。通過(guò)ELISA來(lái)進(jìn)行在棉花子葉 (圖21C)和本氏煙草葉(圖21D)中蛋白質(zhì)表達(dá)的分析。如在實(shí)施例9中對(duì)于大麥凝集素 CTPP所觀察到的，用來(lái)自玉蜀黍防衛(wèi)素(ZmESR-6)的CTPP(T〃 )置換NaDlCTPP(T)對(duì)于 在瞬時(shí)表達(dá)期間產(chǎn)生的NaDl的水平?jīng)]有顯著影響(圖21C和21D)。此外，免疫印跡證明， ZmESR-6CTPP也比NAD1-CTPP更加有效地被從NaDl成熟結(jié)構(gòu)域上加工下來(lái)(圖21E)。因 此，來(lái)自單子葉植物的CTPP序列在雙子葉植物中對(duì)于防衛(wèi)素(M結(jié)構(gòu)域)的有效表達(dá)來(lái)說(shuō) 是起作用的。使用pHEX62構(gòu)建體來(lái)進(jìn)行棉花轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。如實(shí)施例1中所述的，通過(guò)土壤桿菌介 導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因棉花品系。如實(shí)施例1中所述的，通過(guò)使用特異性抗血清的ELISA 來(lái)測(cè)定從編碼SMT"的DNA上NaDl(SEQ ID NO :1，殘基26-72)的表達(dá)。從處于組織培養(yǎng)中 的小植株收集葉樣品。鑒定出2株表達(dá)可檢測(cè)水平的成熟NaDl的植物(圖21F)?；旧先绫疚闹兴龅?，就真菌抗性來(lái)測(cè)試具有正常形態(tài)且表達(dá)可檢測(cè)量的NaDl 的植物。例示的嵌合防衛(wèi)素提供了增強(qiáng)的通過(guò)在轉(zhuǎn)基因植物中的NaDl表達(dá)而提供的真菌 抗性。ZmESR-6C-末端序列(或其部分)的使用提供了轉(zhuǎn)運(yùn)功能，以用于使NaDl移動(dòng)至貯 存液泡和改善NaDl在轉(zhuǎn)基因單子葉和雙子葉植物細(xì)胞中的毒性效應(yīng)。如本文所使用的，“包含”與“包括”、“含有”或“特征在于”同義，并且是包括式的 或開(kāi)放式的，和不排除另外的、未描述的元素或方法步驟。如本文所使用的，“由……組成” 排除了在該權(quán)利要求要素中未指定的任何元素、步驟或成分。如本文所使用的，“基本上 由……組成”不排除實(shí)質(zhì)上不影響該權(quán)利要求的基本和新型特征的材料或步驟。在本文中 術(shù)語(yǔ)“包含”的任何描述，特別是在組合物的組分的描述或裝置的元件的描述中，應(yīng)當(dāng)被理 解為包括基本上由所述組分或元素組成的那些組合物和方法，以及由所述組分或元素組成 的那些組合物和方法。在本文中適當(dāng)?shù)嘏e例說(shuō)明性地描述的本發(fā)明可以在不存在本文未具 體公開(kāi)的任何一種或多種元素、一種或多種限制的情況下進(jìn)行實(shí)施。將已使用的術(shù)語(yǔ)和表述用作描述性而非限制性的術(shù)語(yǔ)，并且不希望此類(lèi)術(shù)語(yǔ)和表 述的使用排除了所顯示和描述的特征的任何等價(jià)物或其部分，但應(yīng)認(rèn)識(shí)到各種修飾在所要 求保護(hù)的本發(fā)明的范圍內(nèi)都是可能的。因此，應(yīng)當(dāng)理解，盡管本發(fā)明已通過(guò)優(yōu)選的實(shí)施方案 和任選的特征而進(jìn)行了具體公開(kāi)，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采取本文公開(kāi)的概念的修飾和變 化形式，并且此類(lèi)修飾和變化形式被視為在由所附權(quán)利要求定義的本發(fā)明的范圍內(nèi)?！愣裕疚氖褂玫男g(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)具有其在本領(lǐng)域中所公認(rèn)的含義，這可以通過(guò) 參考本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)教科書(shū)、期刊參考文獻(xiàn)和上下文而找到。提供了下述定義以澄清其在本發(fā)明的背景中的具體用途。說(shuō)明書(shū)中提及的所有專利和出版物通過(guò)提及而合并，至與本公開(kāi)內(nèi)容不相矛盾的 程度，并且那些參考文獻(xiàn)反映了本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的技術(shù)水平。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易地意識(shí)到，本發(fā)明完全適合于實(shí)現(xiàn)所提及的目的并獲得所 提及的結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)，以及本發(fā)明中所固有的那些。在本文中作為優(yōu)選實(shí)施方案的目前代表 而描述的方法、組分、材料和尺度是作為例子而提供的，并不希望作為對(duì)于本發(fā)明的范圍的 限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)想起在本發(fā)明的精神內(nèi)所包括的其中變化和其他用途，它們包 括在權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。盡管本文的描述包括某些具體信息和例子，但它們不應(yīng)被解釋為限制了本發(fā)明的 范圍，而應(yīng)被解釋為僅僅提供了本發(fā)明的某些實(shí)施方案的舉例說(shuō)明。因此，另外的實(shí)施方案 也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，并且在下述權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。表10構(gòu)建體列表防衛(wèi)素構(gòu)建體 GFP構(gòu)建體
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表11
權(quán)利要求
嵌合植物防衛(wèi)素，所述防衛(wèi)素為基本上由信號(hào)肽(S)、成熟(M)結(jié)構(gòu)域和C-末端前肽尾(T)結(jié)構(gòu)域組成的肽，所述M結(jié)構(gòu)域?yàn)榈谝恢参锓佬l(wèi)素的成熟結(jié)構(gòu)域，并且所述T結(jié)構(gòu)域?yàn)榈诙参锓佬l(wèi)素或非防衛(wèi)素植物液泡易位肽的C-末端前肽尾結(jié)構(gòu)域。
2.權(quán)利要求1的嵌合植物防衛(wèi)素，其中所述M結(jié)構(gòu)域選自具有下述序列的植物M結(jié)構(gòu)域X1X2X3X4X5X6X7C8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19C20X21X22X23X24X25X26X27X28C29X30X31X32 乂34乂35乂36乂37乂38乂39乂40乂41乂42乂43乂44乂45乂46匚47乂48乂49乂50乂51乂52乂53乂54乂55匚56乂57匚58乂59乂60乂61匚62乂63 其中 X1-Xp X26_28、X63為無(wú)氨基酸或任意氨基酸， 乂6、乂7、乂9-12、Xl4、Xl5、乂17、乂19、乂21-25、乂30-32、乂46、乂57、乂59-61 ΛΙ MMiSfe X13為S、Α、C、V、K、P或無(wú)氨基酸， X16 為 F、W、Y 或 H， X18*G、F、K 或 S， X34-37為任意氨基酸，或X34-37中至多兩個(gè)為無(wú)氨基酸， X39-44為任意氨基酸，或X39-44中至多兩個(gè)為無(wú)氨基酸， X38 為 E 或 A， X45 為 G 或 A， X48-S5為任意氨基酸，或X48_55中至多三個(gè)為無(wú)氨基酸， C8與C62以二硫鍵鍵合， C20與C47以二硫鍵鍵合， C29與C56以二硫鍵鍵合，和 C33與C58以二硫鍵鍵合，并且所述T結(jié)構(gòu)域?yàn)檫x自由下述序列組成的T結(jié)構(gòu)域肽的肽SEQ ID NO :1，氨基酸 73-105 ；SEQ ID NO :1，氨基酸 73-76 ；SEQ ID NO :2，氨基酸 73-103 ；SEQ ID NO :3，氨基酸 75-101 ；SEQ ID NO :5，氨基酸 74-106 ；SEQ ID NO :6，氨基酸 73-106 ；SEQ ID NO :7，氨基酸 74-106 ；SEQ ID NO :8，氨基酸 74-105 ；SEQ ID NO :9，氨基酸 76-107 ；SEQ ID NO :18，氨基酸 80-107 ；SEQ ID NO :19，氨基酸 54-108 ；SEQ ID NO :20，氨基酸 58-154 ；SEQ ID NO :21-31，35，40-44，整個(gè)序列。
3.權(quán)利要求2的嵌合防衛(wèi)素，其中所述M結(jié)構(gòu)域?yàn)檫x自由下述序列組成的植物M結(jié)構(gòu) 域的肽SEQ ID NO :1，氨基酸 26-72 ；SEQ ID NO :2，氨基酸 26-72 ； SEQ ID NO :3，氨基酸 26-74 ； SEQ ID NO :4，氨基酸 26-72 ； SEQ ID NO :5，氨基酸 26-73 ； SEQ ID NO :6，氨基酸 26-72 ； SEQ ID NO :7，氨基酸 26-73 ； SEQ ID NO :8，氨基酸 26-73 ； SEQ ID NO :9，氨基酸 27-75 ； SEQ ID NO :10，氨基酸 31-77 ； SEQ ID NO :11，氨基酸 31-77 ； SEQ ID NO 12，氨基酸 25-72 ； SEQ ID NO :13，氨基酸 31-77 ； SEQ ID NO 14，氨基酸 28-75 ； SEQ ID NO 15，氨基酸 28-74 ； SEQ ID NO 16，氨基酸 30-80 ； SEQ ID NO 17，氨基酸 30-80 ； SEQ ID NO 18，氨基酸 26-79 ； SEQ ID NO 19，氨基酸 1-53 ； SEQ ID NO :20，氨基酸 1-57 ；或 SEQ ID NO :33，氨基酸 32-78。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的嵌合防衛(wèi)素，其中所述M結(jié)構(gòu)域?yàn)檫x自由下述序列組成的植物防 衛(wèi)素M結(jié)構(gòu)域的肽SEQ ID NO :1，氨基酸 26-72 ； SEQ ID NO :2，氨基酸 26-72 ； SEQ ID NO :3，氨基酸 26-74 ； SEQ ID NO :4，氨基酸 26-72 ； SEQ ID NO :5，氨基酸 26-73 ； SEQ ID NO :6，氨基酸 26-72 ； SEQ ID NO :7，氨基酸 26-73 ； SEQ ID NO :8，氨基酸 26-73 ； SEQ ID NO :9，氨基酸 27-75 ； SEQ ID NO :10，氨基酸 31-77 ； SEQ ID NO :11，氨基酸 31-77 ； SEQ ID NO 12，氨基酸 25-72 ； SEQ ID NO :13，氨基酸 31-77 ； SEQ ID NO 14，氨基酸 28-75 ； SEQ ID NO 15，氨基酸 28-74 ； SEQ ID NO 16，氨基酸 30-80 ； SEQ ID NO 17，氨基酸 30-80 ；SEQ ID NO : 18，氨基酸 26-79 ； SEQ ID NO : 19，氨基酸 1-53 ； SEQ ID NO :20，氨基酸 1-57 ；或 SEQ ID NO :33，氨基酸 32-78，并且所述T結(jié)構(gòu)域?yàn)檫x自由下述序列組成的T結(jié)構(gòu)域肽的肽SEQ ID NO :1，氨基酸 73-105 ；SEQ ID NO :1，氨基酸 73-76 ；SEQ ID NO :2，氨基酸 73-103 ；SEQ ID NO :3，氨基酸 75-101 ； SEQ ID NO :5，氨基酸 74-106 ；SEQ ID NO :6，氨基酸 73-106 ；SEQ ID NO :7，氨基酸 74-106 ；SEQ ID NO :8，氨基酸 74-105 ；SEQ ID NO :9，氨基酸 76-107 ；SEQ ID NO :18，氨基酸 80-107 ；SEQ ID NO :19，氨基酸 54-108 ；SEQ ID NO :20，氨基酸 58-154 ；或SEQ ID NO :21-31，35，40-44，整個(gè)序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的嵌合防衛(wèi)素，其中所述T結(jié)構(gòu)域?yàn)檫x自由下述序列組成的T結(jié)構(gòu) 域肽的肽SEQ ID NO :1，氨基酸 73-105 ； SEQ ID NO :1，氨基酸 73-76 ； SEQ ID NO :8，氨基酸 74-105 ； SEQ ID NO :35，(整個(gè)序列)； SEQ ID NO :24，(整個(gè)序列)；或 SEQ ID NO :18，氨基酸 80-107。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的嵌合防衛(wèi)素，其中所述T結(jié)構(gòu)域?yàn)榘琒EQIDNO :1的氨基酸 73-105 的肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的嵌合防衛(wèi)素，其中所述T結(jié)構(gòu)域?yàn)榘琒EQIDNO :35的肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求4的嵌合防衛(wèi)素，其中所述M結(jié)構(gòu)域?yàn)橛蒘EQID NO 1的氨基酸26-72 的氨基酸序列組成的肽，并且所述T結(jié)構(gòu)域?yàn)檫x自由下述序列組成的T結(jié)構(gòu)域肽的肽SEQ ID NO :1，氨基酸 73-76 ； SEQ ID NO :8，氨基酸 74-105 ； SEQ ID NO :35，(整個(gè)序列)； SEQ ID NO :24，(整個(gè)序列)；或 SEQ ID NO :18，氨基酸 80-107。
9.根據(jù)權(quán)利要求5的嵌合防衛(wèi)素，其中所述M結(jié)構(gòu)域?yàn)橛蒘EQID N0:17的氨基酸 30-80的氨基酸序列組成的肽。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的嵌合防衛(wèi)素，其中所述M結(jié)構(gòu)域?yàn)檫x自SEQIDNO :1的氨基酸28-72或SEQ ID NO 18的氨基酸26-79的肽。
11.權(quán)利要求1的嵌合植物防衛(wèi)素，其進(jìn)一步包含信號(hào)序列(S)。
12.權(quán)利要求2的嵌合植物防衛(wèi)素，其進(jìn)一步包含選自由下述序列組成的信號(hào)肽的信 號(hào)序列⑶SEQ ID NO :1，氨基酸 1-25 ； SEQ ID NO :2，氨基酸 1-25 ； SEQ ID NO :3，氨基酸 1-25 ； SEQ ID NO :4，氨基酸 1-25 ； SEQ ID NO :5，氨基酸 1-25 ； SEQ ID NO :6，氨基酸 1-25 ； SEQ ID NO :7，氨基酸 1-25 ； SEQ ID NO :8，氨基酸 1-25 ； SEQ ID NO :9，氨基酸 1-26 ； SEQ ID NO 10，氨基酸 1-30 ； SEQ ID NO 11，氨基酸 1-30 ； SEQ ID NO 12，氨基酸 1-24 ； SEQ ID NO 13，氨基酸 1-30 ； SEQ ID NO 14，氨基酸 1-27 ； SEQ ID NO 15，氨基酸 1-27 ； SEQ ID NO 16，氨基酸 1-29 ； SEQ ID NO 17，氨基酸 1-29 ； SEQ ID NO :18，氨基酸 1-25 ；或 SEQ ID NO :44，整個(gè)序列。
13.權(quán)利要求4的嵌合植物防衛(wèi)素，其進(jìn)一步包含選自由下述序列組成的信號(hào)肽的信 號(hào)序列(S)SEQ ID NO :1，氨基酸 1-25 ； SEQ ID NO :2，氨基酸 1-25 ； SEQ ID NO :3，氨基酸 1-25 ； SEQ ID NO :4，氨基酸 1-25 ； SEQ ID NO :5，氨基酸 1-25 ； SEQ ID NO :6，氨基酸 1-25 ； SEQ ID NO :7，氨基酸 1-25 ； SEQ ID NO :8，氨基酸 1-25 ； SEQ ID NO :9，氨基酸 1-26 ； SEQ ID NO 10，氨基酸 1-30 ； SEQ ID NO 11，氨基酸 1-30 ； SEQ ID NO 12，氨基酸 1-24 ； SEQ ID NO 13，氨基酸 1-30 ； SEQ ID NO 14，氨基酸 1-27 ；SEQ ID NO : 15，氨基酸 1-27 ； SEQ ID NO : 16，氨基酸 1-29 ； SEQ ID NO : 17，氨基酸 1-29 ； SEQ ID NO :18，氨基酸 1-25 ；或 SEQ ID NO :44，整個(gè)序列。
14.權(quán)利要求13的嵌合植物防衛(wèi)素，其中所述信號(hào)肽⑶包含SEQIDNO 1的氨基酸 1-25，所述M結(jié)構(gòu)域選自由SEQ ID NO 1的氨基酸73-105或SEQ ID NO :33的氨基酸32-78 組成的肽，并且所述T結(jié)構(gòu)域?yàn)檫x自由SEQ ID N0:35或SEQ ID NO 18的氨基酸80-107組 成的肽的肽。
15.權(quán)利要求13的嵌合植物防衛(wèi)素，其中所述信號(hào)肽(S)由SEQIDNO :44組成，所述M 結(jié)構(gòu)域?yàn)檫x自由SEQ ID NO 1的氨基酸73-105或SEQID NO 33的氨基酸32-78組成的肽 的肽，并且所述T結(jié)構(gòu)域?yàn)檫x自SEQ IDNO 1的氨基酸73-105、SEQ ID NO 35的整個(gè)序列 或SEQ ID NO 18的氨基酸80-107的肽。
16.用于制備表達(dá)嵌合植物防衛(wèi)素的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括用編碼嵌合植 物防衛(wèi)素的DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，由此產(chǎn)生表達(dá)所述嵌合植物防衛(wèi)素的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞， 并且使所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生從而產(chǎn)生表達(dá)嵌合植物防衛(wèi)素的成體轉(zhuǎn)基因植物，其中 所述防衛(wèi)素為基本上由成熟(M)結(jié)構(gòu)域和C-末端前肽尾(T)結(jié)構(gòu)域組成的肽，所述M結(jié)構(gòu) 域?yàn)榈谝恢参锓佬l(wèi)素的成熟結(jié)構(gòu)域，并且所述T結(jié)構(gòu)域?yàn)榈诙参锓佬l(wèi)素或非防衛(wèi)素植物 液泡易位肽的C-末端前肽尾結(jié)構(gòu)域。
17.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述嵌合防衛(wèi)素M結(jié)構(gòu)域選自具有下述序列的植物M 結(jié)構(gòu)域肽X1X2X3X4X5X6X7C8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19C20X21X22X23X24X25X26X27X28C29X30X31X32 乂34乂35乂36乂37乂38乂39乂40乂41乂42乂43乂44乂45乂46匚47乂48乂49乂50乂51乂52乂53乂54乂55匚56乂57匚58乂59乂60乂61匚62乂63 其中 X1-Xp X26_28、X63為無(wú)氨基酸或任意氨基酸， 乂6、乂7、乂9-12、Xl4、Xl5、乂17、乂19、乂21-25、乂30-32、乂46、乂57、乂59-61 ΛΙ MMiSfe X13為S、Α、C、V、K、P或無(wú)氨基酸， X16 為 F、W、Y 或 H， X18*G、F、K 或 S， X34-37為任意氨基酸，或X34-37中至多兩個(gè)為無(wú)氨基酸， X39-44為任意氨基酸，或X39-44中至多兩個(gè)為無(wú)氨基酸， X38 為 E 或 A， X45 為 G 或 A， X48-S5為任意氨基酸，或X48_55中至多三個(gè)為無(wú)氨基酸， C8與C62以二硫鍵鍵合， C20與C47以二硫鍵鍵合， C29與C56以二硫鍵鍵合，和 C33與C58以二硫鍵鍵合，由此產(chǎn)生表達(dá)所述嵌合植物防衛(wèi)素的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，并且使所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生從而產(chǎn)生表達(dá)嵌合植物防衛(wèi)素的成體轉(zhuǎn)基因植物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述嵌合防衛(wèi)素M結(jié)構(gòu)域?yàn)檫x自由下述序列組成的 植物M結(jié)構(gòu)域肽的肽SEQ ID NO :1，氨基酸 26-72 ； SEQ ID NO :2，氨基酸 26-72 ； SEQ ID NO :3，氨基酸 26-74 ； SEQ ID NO :4，氨基酸 26-72 ； SEQ ID NO :5，氨基酸 26-73 ； SEQ ID NO :6，氨基酸 26-72 ； SEQ ID NO :7，氨基酸 26-73 ； SEQ ID NO :8，氨基酸 26-73 ； SEQ ID NO :9，氨基酸 27-75 ； SEQ ID NO :10，氨基酸 31-77 ； SEQ ID NO :11，氨基酸 31-77 ； SEQ ID NO 12，氨基酸 25-72 ； SEQ ID NO :13，氨基酸 31-77 ； SEQ ID NO 14，氨基酸 28-75 ； SEQ ID NO 15，氨基酸 28-74 ； SEQ ID NO 16，氨基酸 30-80 ； SEQ ID NO 17，氨基酸 30-80 ； SEQ ID NO 18，氨基酸 26-79 ； SEQ ID NO 19，氨基酸 1-53 ； SEQ ID NO :20，氨基酸 1-57 ；或 SEQ ID NO :33，氨基酸 32-78，由此產(chǎn)生表達(dá)所述嵌合植物防衛(wèi)素的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，并且使所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì) 胞再生從而產(chǎn)生表達(dá)嵌合植物防衛(wèi)素的成體轉(zhuǎn)基因植物。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的用于制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述嵌合防衛(wèi)素T結(jié)構(gòu)域?yàn)?選自由下述序列組成的T結(jié)構(gòu)域肽的肽SEQ ID NO :1，氨基酸 73-105 ； SEQ ID NO :1，氨基酸 73-76 ； SEQ ID NO :2，氨基酸 73-103 ； SEQ ID NO :3，氨基酸 75-101 ； SEQ ID NO :5，氨基酸 74-106 ； SEQ ID NO :6，氨基酸 73-106 ； SEQ ID NO :7，氨基酸 74-106 ； SEQ ID NO :8，氨基酸 74-105 ； SEQ ID NO :9，氨基酸 76-107 ； SEQ ID NO :18，氨基酸 80-107 ； SEQ ID NO :19，氨基酸 54-108 ；SEQID NO :20，氨基酸 58-154 ；或 SEQID NO :21-31，35，40-44，整個(gè)序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求16的用于制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述嵌合防衛(wèi)素M結(jié)構(gòu)域選 自由下述序列組成的植物M結(jié)構(gòu)域SEQID NO :1，氨基酸 26-72 ；SEQID NO :2，氨基酸 26-72 ；SEQID NO :3，氨基酸 26-74 ；SEQID NO :4，氨基酸 26-72 ；SEQID NO :5，氨基酸 26-73 ；SEQID NO :6，氨基酸 26-72 ；SEQID NO :7，氨基酸 26-73 ；SEQID NO :8，氨基酸 26-73 ；SEQID NO :9，氨基酸 27-75 ；SEQID NO :10，氨基酸 31-77 ；SEQID NO :11，氨基酸 31-77 ；SEQID NO 12，氨基酸 25-72 ；SEQID NO :13，氨基酸 31-77 ；SEQID NO 14，氨基酸 28-75 ；SEQID NO 15，氨基酸 28-74 ；SEQID NO 16，氨基酸 30-80 ；SEQID NO 17，氨基酸 30-80 ；SEQID NO 18，氨基酸 26-79 ；SEQID NO 19，氨基酸 1-53 ；SEQID NO :20，氨基酸 1-57 ；或SEQID NO :33，氨基酸 32-78，并且所述嵌合防衛(wèi)素T結(jié)構(gòu)域?yàn)檫x自由下述序列組成的植物T結(jié)構(gòu)域肽的肽SEQID NO :1，氨基酸 73-105 ；SEQID NO :1，氨基酸 73-76 ；SEQID NO :2，氨基酸 73-103 ；SEQID NO :3，氨基酸 75-101 ；SEQID NO :5，氨基酸 74-106 ；SEQID NO :6，氨基酸 73-106 ；SEQID NO :7，氨基酸 74-106 ；SEQID NO :8，氨基酸 74-105 ；SEQID NO :9，氨基酸 76-107 ；SEQID NO :18，氨基酸 80-107 ；SEQID NO :19，氨基酸 54-108 ； SEQID NO :20，氨基酸 58-154 ；或SEQID NO :21-31，35，40-44，整個(gè)序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的用于制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述嵌合防衛(wèi)素T結(jié)構(gòu)域?yàn)?選自由下述序列組成的T結(jié)構(gòu)域肽的肽SEQ ID NO :1，氨基酸 73-105 ； SEQ ID NO :1，氨基酸 73-76 ； SEQ ID NO :8，氨基酸 74-105 ； SEQ ID NO :35，(整個(gè)序列)； SEQ ID NO :24，(整個(gè)序列)； SEQ ID NO :18，氨基酸 80-107 ；或 SEQ ID NO :44，整個(gè)序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的用于制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述T結(jié)構(gòu)域?yàn)榘琒EQID NO 1的氨基酸73-105的肽，并且所述M結(jié)構(gòu)域不為SEQ ID NO 1的氨基酸26-73。
23.根據(jù)權(quán)利要求20的用于制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述T結(jié)構(gòu)域?yàn)榘琒EQID NO 35的肽。
24.根據(jù)權(quán)利要求20的用于制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述M結(jié)構(gòu)域?yàn)橛蒘EQID NO 1的氨基酸26-72的氨基酸序列組成的肽，并且所述T結(jié)構(gòu)域?yàn)檫x自由下述序列組成的 T結(jié)構(gòu)域肽的肽SEQ ID NO :1，氨基酸 73-76 SEQ ID NO :8，氨基酸 74-105 ； SEQ ID NO :35，(整個(gè)序列)； SEQ ID NO :24，(整個(gè)序列)；或 SEQ ID NO :18，氨基酸 80-107。
25.根據(jù)權(quán)利要求20的用于制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述M結(jié)構(gòu)域?yàn)榘琒EQID NO 17的氨基酸30-80的氨基酸序列的肽。
26.根據(jù)權(quán)利要求23的用于制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述M結(jié)構(gòu)域?yàn)檫x自由SEQ ID NO 1的氨基酸28-72或SEQ ID NO 18的氨基酸26-79組成的M結(jié)構(gòu)域多肽的肽。
27.依照權(quán)利要求16的方法制備的轉(zhuǎn)基因植物。
28.依照權(quán)利要求20的方法制備的轉(zhuǎn)基因植物。
29.依照權(quán)利要求22的方法制備的轉(zhuǎn)基因植物。
30.依照權(quán)利要求23的方法制備的轉(zhuǎn)基因植物。
31.依照權(quán)利要求24的方法制備的轉(zhuǎn)基因植物。
32.依照權(quán)利要求25的方法制備的轉(zhuǎn)基因植物。
33.依照權(quán)利要求26的方法制備的轉(zhuǎn)基因植物。
34.通過(guò)在具有編碼防衛(wèi)素的核酸的讀碼框相中提供編碼液泡易位肽的核酸來(lái)減少在 轉(zhuǎn)基因植物中防衛(wèi)素表達(dá)的毒性效應(yīng)的方法，其中通過(guò)相比于表達(dá)不含液泡靶向肽的防衛(wèi) 素的植物而言在表達(dá)連同液泡易位肽一起的防衛(wèi)素的植物中正?；谋硇突蛟黾拥谋磉_(dá) 水平，來(lái)評(píng)估所述毒性效應(yīng)。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物為棉花。
36.權(quán)利要求34的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物為油菜。
37.權(quán)利要求34的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物為玉蜀黍。
38.權(quán)利要求34的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物選自大豆、稻、小麥或向日葵。
39.權(quán)利要求35的方法，其中所述防衛(wèi)素為選自由下述序列組成的M結(jié)構(gòu)域的防衛(wèi)素 M結(jié)構(gòu)域肽SEQID NO :1，氨基酸 26-72 ；SEQID NO :2，氨基酸 26-72 ；SEQID NO :3，氨基酸 26-74 ；SEQID NO :4，氨基酸 26-72 ；SEQID NO :5，氨基酸 26-73 ；SEQID NO :6，氨基酸 26-72 ；SEQID NO :7，氨基酸 26-73 ；SEQID NO :8，氨基酸 26-73 ；SEQID NO :9，氨基酸 27-75 ；SEQID NO :10，氨基酸 31-77 ；SEQID NO :11，氨基酸 31-77 ；SEQID NO 12，氨基酸 25-72 ；SEQID NO :13，氨基酸 31-77 ；SEQID NO 14，氨基酸 28-75 ；SEQID NO 15，氨基酸 28-74 ；SEQID NO 16，氨基酸 30-80 ；SEQID NO 17，氨基酸 30-80 ；SEQID NO 18，氨基酸 26-79 ；SEQID NO 19，氨基酸 1-53 ；SEQID NO :20，氨基酸 1-57 ；或SEQID NO :33，氨基酸 32-78。
40.權(quán)利要求35的方法，其中所述液泡易位肽選自由下述序列組成的肽 SEQID NO :1，氨基酸 73-105 ；SEQID NO :1，氨基酸 73-76 ；SEQID NO :2，氨基酸 73-103 ；SEQID NO :3，氨基酸 75-101 ；SEQID NO :5，氨基酸 74-106 ；SEQID NO :6，氨基酸 73-106 ；SEQID NO :7，氨基酸 74-106 ；SEQID NO :8，氨基酸 74-105 ；SEQID NO :9，氨基酸 76-107 ；SEQID NO :18，氨基酸 80-107 ；SEQID NO :19，氨基酸 54-108 ；SEQID NO :20，氨基酸 58-154 ；或SEQID NO :21-31，35，40-44，整個(gè)序列。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述防衛(wèi)素為SEQID NO=I的氨基酸26-72的M結(jié)構(gòu)域肽的防衛(wèi)素。
42.權(quán)利要求39的方法，其中所述液泡易位肽為SEQID NO 1的氨基酸73-105的肽。
43.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物為棉花植物。
44.通過(guò)權(quán)利要求17的方法制備的轉(zhuǎn)基因植物。
45.通過(guò)權(quán)利要求18的方法制備的轉(zhuǎn)基因植物。
46.用于增加植物品種中的真菌抗性的方法，所述方法包括用編碼嵌合植物防衛(wèi)素的 DNA轉(zhuǎn)化所述植物品種的植物細(xì)胞，所述嵌合植物防衛(wèi)素包含信號(hào)結(jié)構(gòu)域(S)和成熟結(jié)構(gòu) 域(M)以及C-末端前肽尾結(jié)構(gòu)域(T)，所述信號(hào)結(jié)構(gòu)域和所述成熟結(jié)構(gòu)域一起具有SEQ ID NO :1 (殘基1-72)所示的氨基酸序列，并且所述C-末端前肽尾結(jié)構(gòu)域具有選自由下述序列 組成的T結(jié)構(gòu)域肽的氨基酸序列SEQ ID NO :2，氨基酸 72-103 ； SEQ ID NO :3，氨基酸 75-101 ； SEQ ID NO :4，氨基酸 73-105 ； SEQ ID NO :5，氨基酸 74-106 ； SEQ ID NO :6，氨基酸 73-105 ； SEQ ID NO :7，氨基酸 74-106 ； SEQ ID NO :8，氨基酸 74-105 ； SEQ ID NO :9，氨基酸 76-107 ； SEQ ID NO :18，氨基酸 80-107 ； SEQ ID NO :19，氨基酸 53-107 ； SEQ ID NO :20，氨基酸 58-154 ；或 SEQ ID NO :44，整個(gè)序列。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述植物品種為棉花品種。
48.用于增加棉花品種中的真菌抗性的方法，所述方法包括用編碼具有SEQID NO 1 的氨基酸序列的防衛(wèi)素的DNA轉(zhuǎn)化棉花品種細(xì)胞，由此產(chǎn)生表達(dá)所述防衛(wèi)素的棉花品種細(xì) 胞，并且使所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生從而產(chǎn)生表達(dá)所述防衛(wèi)素的成體轉(zhuǎn)基因棉花植物，由此 將增加的真菌抗性賦予給了所述棉花品種。
全文摘要
在此，本發(fā)明包括用于減少或消除在宿主植物中轉(zhuǎn)基因防衛(wèi)素表達(dá)的毒性效應(yīng)的一般方法。本發(fā)明還包括用于修飾編碼防衛(wèi)素的核酸的方法，由此修飾的核酸，和由經(jīng)修飾的核酸序列編碼的經(jīng)修飾的防衛(wèi)素。本發(fā)明還包括包含并表達(dá)經(jīng)修飾的編碼防衛(wèi)素的核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物，所述植物展現(xiàn)出相比于在其他方面相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)未修飾的防衛(wèi)素的轉(zhuǎn)基因植物而言減少或消除的防衛(wèi)素毒性效應(yīng)。該經(jīng)修飾的防衛(wèi)素被稱為嵌合防衛(wèi)素，所述嵌合防衛(wèi)素具有與第二植物防衛(wèi)素或液泡易位肽的C-末端前肽結(jié)構(gòu)域相組合的第一植物防衛(wèi)素的成熟防衛(wèi)素結(jié)構(gòu)域。
文檔編號(hào)C07K14/415GK101848938SQ200880019541
公開(kāi)日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2008年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月20日
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