專利名稱：：6-O-β-D-葡萄糖基-3,6,16,25-四羥基環(huán)菠蘿蜜烷的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及6-0-p-D-葡萄糖基-3，6,16,25-四羥基環(huán)菠蘿蜜烷的制備方法，屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：化合物6-0-p-D-葡萄糖基-3,6,16,25-四羥基環(huán)菠蘿蜜烷(以下簡(jiǎn)稱化合物l)，見化學(xué)式(I):化合物1能夠提高機(jī)體免疫力，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在PHA刺激下，其能顯著誘導(dǎo)IL-2活性，且提高率高達(dá)80.9%,而對(duì)照組僅有51.1%，并在LPS刺激下，可誘導(dǎo)IL-1p和IL一8活性[Yesilada，E，Bedir,E,Calis，I,7^h/"/'，f,。力邁ofo，f.EffectsoftriterpenesaponinsfromAstragalusspeciesoninvitrocytokinerelease.J.Ethnopharmacology2005;96:71-77]。IL-2是一種由T細(xì)胞激活的細(xì)胞因子，具有顯著的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用；IL-lP可激活T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，并有抗菌活性；IL-8也是一種常見的中性粒細(xì)胞趨化性細(xì)胞因子，可提髙炎癥應(yīng)答。此外，在ConA誘導(dǎo)下，ljig/ml化合物1可明顯刺激脾細(xì)胞增殖<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>7fe^'aJ.，Asa《Ma/.CycloartaneandoleananesaponinsfromEgyptianAstragalusspp.asmodulatorsoflymphocyteproliferation.PlantaMed.2002;68:986-994]。但化合物1的多為化學(xué)合成，鮮有從植物中提取或者其他途徑獲得的報(bào)道。CH2OH藥用真菌新型(雙向性)固體發(fā)酵工程(簡(jiǎn)稱雙向發(fā)酵)的是將發(fā)酵菌種和發(fā)酵基質(zhì)所構(gòu)成發(fā)酵組合內(nèi)的發(fā)酵基質(zhì)，由以往僅由富含碳、氮等營(yíng)養(yǎng)的農(nóng)副產(chǎn)品(甘蔗渣、麥麩等)構(gòu)成的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)(其產(chǎn)品稱藥用菌質(zhì))，改變?yōu)椴捎镁哂幸欢ɑ钚猿煞值闹兴幉淖鳛樗幮曰|(zhì)，以確保既能提供真菌生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)又能因真菌產(chǎn)生的酶而改變中藥材組織、成分，從而產(chǎn)生新的性味功能，故具有雙向性,其產(chǎn)品稱藥性菌質(zhì)，如兼用營(yíng)養(yǎng)、藥性兩種基質(zhì)則稱為全性基質(zhì)，產(chǎn)品也稱藥性菌質(zhì)。藥性菌質(zhì)，常可比該真菌或藥性基質(zhì)本身或兩者簡(jiǎn)單相加有更良好的藥效，主要表現(xiàn)在增效、擴(kuò)用、解毒等方面。申請(qǐng)?zhí)枮?00610038850.6,名稱為中藥多菌種混合固體發(fā)酵技術(shù)及其應(yīng)用的發(fā)明專利申請(qǐng)公開說明書公開了采用混合中藥材和混合菌種雙向發(fā)酵制備用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)藥物和飼料添加劑；專利號(hào)為ZL200510038072.6,名稱為一種飼料添加劑及其制備工藝和在制造預(yù)防禽流感的飼料中的應(yīng)用的發(fā)明專利說明書公開了應(yīng)用全性基質(zhì)和藥用真菌混合發(fā)酵制備飼料添加劑的制備方法。應(yīng)用雙向發(fā)酵法制備純品化合物的報(bào)道尚未見報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種應(yīng)用生物轉(zhuǎn)化方式制備6-0-p-D-葡萄糖基-3，6,16，25-四羥基環(huán)菠蘿蜜烷的方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種制備6-0-3-D-葡萄糖基-3，6,16,25-四羥基環(huán)菠蘿蜜烷的方法，包括以下步驟1、生物轉(zhuǎn)化方式制備固體發(fā)酵物(1)將中藥粉碎，過篩，調(diào)節(jié)至適宜的含水量，滅菌，得含中藥的固體培養(yǎng)基；(2)將固體培養(yǎng)基干重量5-15%的藥用真菌接種在上述固體培養(yǎng)基中，發(fā)酵，發(fā)酵溫度為24-30°C，發(fā)酵濕度為45-60%,發(fā)酵時(shí)間為30-45天，得固體發(fā)酵物；(3)收集固體發(fā)酵物，經(jīng)50-70。C干燥，粉碎處理；其中，步驟(1)中藥為黃芪或黃芪渣；步驟(2)藥用真菌為靈芝菌、猴頭菌、灰樹花菌、云芝菌、槐耳菌、香菇菌中的任一種，優(yōu)選靈芝菌；2、將烘干粉碎處理的固體發(fā)酵物提取分離化合物(1)取步驟l獲得的干燥固體發(fā)酵物粉粒適量，乙醇回流提取，回收溶劑，得浸膏；(2)將浸膏用水溶解，用水飽和的正丁醇萃取，蒸干溶劑，得萃取物；(3)萃取物用硅膠柱層析，用氯仿-甲醇混合物(v/v:10:0-10:5)洗脫，合并相同餾分，揮去溶劑；(4)加入中性氧化鋁，氧化鋁柱干法層析，氯仿-甲醇混合液(v/v:10:0-10:5)洗脫，揮去溶劑，得式(I)的化合物；其中，步驟(l)中的乙醇濃度為70%,回流提取2次，每次2h;步驟(2)中，水飽和的正丁醇萃取之后用1%的NaOH溶液和水飽和的正丁醇洗滌；步驟(3)、(4)中，層析方法為干法層析。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明使用廢棄的中藥材黃芪藥渣與靈芝菌絲體進(jìn)行固體發(fā)酵制備目的化合物，簡(jiǎn)單易行，既環(huán)保，又可以變廢為寶。提取分離過程中未采用大孔樹脂法富集化合物，省去反復(fù)活化處理大孔樹脂的步驟；合并的正定醇液釆用1%氫氧化鈉溶液洗滌，可除去大量酴酸性雜質(zhì)和有色色素；最后使用中性氧化鋁層析柱進(jìn)行純化，有效地除去色素雜質(zhì)，可直接得到純品，無需重結(jié)晶，提高了純品的得率，值得推廣應(yīng)用。圖l為本發(fā)明化合物l的質(zhì)譜圖2為本發(fā)明化合物1的紫外吸收光譜圖3為本發(fā)明化合物1的IR(KBr)圖譜；圖4為本發(fā)明化合物1的H'-NMR圖譜。具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合附圖，詳細(xì)說明本發(fā)明的具體實(shí)施例方式以下各實(shí)施例組分的重量均按干重計(jì)算。實(shí)施例1固體發(fā)酵物的制備取黃芪藥渣，粉碎，過10目篩，加水，使黃芪藥渣含水量為52%,裝入IO個(gè)培養(yǎng)瓶，12(TC滅菌2小時(shí)；冷卻后，接種10%的靈芝菌，溫度調(diào)節(jié)為27。C，發(fā)酵32天，即得固體發(fā)酵物；收集面體發(fā)酵物，經(jīng)6(TC烘干，測(cè)含水量8%，粉碎處理。實(shí)施例2固體發(fā)酵物的制備取黃芪藥渣，粉碎，過10目篩，加水，使黃貧藥渣含水量為45%,裝入IO個(gè)培養(yǎng)瓶，12rC滅菌l.5小時(shí)；冷卻后，接種5%的靈芝菌，溫度調(diào)節(jié)為25。C,發(fā)酵45天，即得固體發(fā)酵物；收集固體發(fā)酵物，經(jīng)5(TC烘干，含水量10%粉碎處理即得。實(shí)施例3固體發(fā)酵物的制備取黃芪藥渣，粉碎，過10目篩，加水，使黃芪藥渣含水量為60%,裝入IO個(gè)培養(yǎng)瓶，121'C滅菌2小時(shí)；冷卻后，接種15%的槐耳菌，溫度調(diào)節(jié)為3(TC，發(fā)酵40天，即得固體發(fā)酵物；收集固體發(fā)酵物，經(jīng)7(TC烘干，含水量6%粉碎處理即得。將實(shí)施例1得到的干燥粉碎的固體發(fā)酵物提取分離取固體發(fā)酵物粉粒lkg,加70%乙醇提取液回流提取2次，每次2小時(shí)，合并2次的提取液，減壓回收乙醇至稠膏狀，得浸膏。將浸膏加適量水溶解，水溶液用水飽和的正丁醇振搖萃取3次，合并正丁醇液，用l。/。NaOH溶液充分洗滌2次，再用正丁醇飽和的水洗滌1次，正丁醇液蒸千，得萃取物。殘?jiān)枞牍枘z，干法上硅膠柱，氯仿與甲醇混合液(V/V=10:2)洗脫，每份取8亳升，合并相同餾分，放置，揮去溶劑，拌入中性氧化鋁，干法上氧化鋁柱，氯仿與甲醇混合液(V/V=10:3)洗脫，合并相同餾分，放置，揮去溶劑，得化合物1純品100mg,得率為40.1%。黃芪藥渣為黃芪藥材提取后的剩余物，通常被作為廢棄物處理，但藥渣常含有未被提取完全的有效成分，本發(fā)明所用原料黃芪藥渣中就含有黃芪甲苷成分，根據(jù)表l結(jié)果，可得知化合物1來源于黃貧甲苷的生物轉(zhuǎn)化。黃貧甲苷是黃芪藥材及其藥渣的原生苷，化合物1則是黃芪甲苷水解失去一分子糖后生成的次生苷。即黃芪藥渣在與靈芝菌種發(fā)酵過程中產(chǎn)生了可以水解黃疾甲苷并得到化合物1的酶，所以可推斷，只要在發(fā)酵過程中與黃芪藥材或藥渣生成該水解酶的菌種均可產(chǎn)生化合物1。表l各樣品中黃芪甲苷和化合物1的含量樣品黃芪甲苷(°/)化合物1(%)藥渣和靈芝發(fā)酵前0.0350藥渣和靈芝發(fā)酵后o0.030發(fā)酵前空白樣品o0發(fā)酵后空白樣品o0黃芪藥渣0.0370表2不同種類樣品提取獲得化合物1的含量樣品取樣量(g)化合物1含量(％)化合物1得率(°"化合物l標(biāo)準(zhǔn)品(685ug/ml)培養(yǎng)基為10%藥渣+90%農(nóng)副產(chǎn)品的樣品30.92250.00329510.4培養(yǎng)基為20%藥渣+80/。農(nóng)副產(chǎn)品的樣品29.92460.00710515.3培養(yǎng)基為30%藥渣+70%農(nóng)副產(chǎn)品的樣品30.54330.00912121.6培養(yǎng)基為40%藥渣+60°/。農(nóng)副產(chǎn)品的樣品30.36480.0120029.7培養(yǎng)基為100%藥渣16.905940.0300240.1黃芪甲苷是黃芪或其藥渣中的有效單體成分，而化合物1來源于黃疾甲苷的轉(zhuǎn)化，因此，理論上，固體培養(yǎng)基中黃芪的比重越大，黃芪甲苷的含量亦越高，化合物l的含量也就越大，表4提供的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也說明了這一點(diǎn)。化合物理化特征及光譜數(shù)據(jù)-.白色粉末，m.p.181.5~182.5。C,FABMS(圖1):切/z675[M+Na]+，/々653[M+H]+，歷々691[M+K]+，確定其分子式為C36H6。010。紫外吸收光譜顯示(圖2):最大吸收波人max-206nm。IR(KBr)(圖3):V,(cnf1):3388.7(OH)，2968.6(環(huán)丙烷基)，2933.5(CH2),2872.4(CH3)，1454.1(CH2),1378.1(CH3)?！?NMR(500MHz,CD30D):見表3。表3:化合物1的'Hand13CNMR數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>232.07，m27.0，t243.79,m82.6，d2572.5，s26L16，s26.8q27L29，s27.6，q281.32，s28.5，q290.98，s15.9，q301.05，s20.2，q1'4.36，d(7.7)104.9，d2'3.20,t(8.3)75.7，d3'3.34，t(1.3)78.7，d4'3.30,m71.8，d5'77.8，d6'3.87，dd(1.6，11.5),6'a;3.68,dd(5.2,11.5),6'b63.0，t綜合以上光譜分析，確定化合物的結(jié)構(gòu)為6-O-P-D-葡萄糖基-3，6，16，25-四羥基環(huán)菠蘿蜜烷。以上已以較佳實(shí)施例公開了本發(fā)明，然其并非用以限制本發(fā)明，凡采用等同替換或者等效變換方式所獲得的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1、一種結(jié)構(gòu)如式(I)的四羥基環(huán)菠蘿蜜烷型三萜皂苷化合物。2、一種權(quán)利要求l的化合物的制備方法，包括以下步驟(1)生物轉(zhuǎn)化方式制備固體發(fā)酵物(a)將中藥粉碎，過篩，調(diào)節(jié)至適宜的含水量，滅菌，得含中藥的固體培養(yǎng)基；(b)將固體培養(yǎng)基干重量5-15%的藥用真菌接種在上述固體培養(yǎng)基中，發(fā)酵，發(fā)酵溫度為24-30匸，發(fā)酵濕度為45-60%，發(fā)酵時(shí)間為30-45天，得固體發(fā)酵物；(c)收集固體發(fā)酵物，經(jīng)50-70'C干燥，粉碎處理，備用；(2)將烘干的固體發(fā)酵物提取分離化合物(a)取步驟(1)獲得的干燥固體發(fā)酵物粉粒適量，乙醇回流提取，回收溶劑，得浸膏；(b)將浸膏用水溶解，用水飽和的正丁醇萃取，蒸干溶劑，得萃取物；(c)萃取物用硅膠柱層析，用氯仿-甲醇混合物洗脫，合并相同餾分，揮去溶劑；(d)加入中性氧化鋁，氧化鋁柱層析，氯仿-甲醇混合液洗脫，揮去溶劑，得式(I)的化合物。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種權(quán)利要求1的化合物的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，步驟(a)所述中藥為黃芪或黃芪渣；步驟(b)所述藥用真菌為在發(fā)酵過程中能與黃貧藥材或其藥渣生成可水解黃芪甲苷得到化合物1的酶的菌種。4、根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種權(quán)利要求1的化合物的制備方法，其特征在于，步驟(l)、(b)中，所述藥用真菌選自靈芝菌、猴頭菌、灰樹花菌、云芝菌、槐耳菌、香菇菌中的任一種。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種權(quán)利要求1的化合物的制備方法，其特征在于，步驟(1)、(b)中，所述藥用真菌優(yōu)選靈芝菌。6、根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種權(quán)利要求1的化合物的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，步驟(a)中的乙醇濃度為70%，回流提取2次，每次2h;步驟(b)中，水飽和的正丁醇萃取之后用NaOH溶液和水飽和的正丁醇洗滌；步驟(c)、(d)中，層析方法為干法層析，氯仿-甲醇混合物中兩者的體積比10:0-10:5。7、根據(jù)權(quán)利要求2或6所述的一種權(quán)利要求1的化合物的制備方法，其特征在于，步驟(2)(b)中，NaOH溶液的濃度為1%。全文摘要本發(fā)明公開了一種6-O-β-D-葡萄糖基-3，6，16，25-四羥基環(huán)菠蘿蜜烷的制備方法，首先將藥用真菌接種于中藥材或其藥渣組成的固體培養(yǎng)基中，在一定的發(fā)酵條件下，發(fā)酵，收集固體發(fā)酵物，干燥、粉碎提取分離后，即可獲得本品。本發(fā)明簡(jiǎn)單易行，實(shí)現(xiàn)變廢為寶，提取分離過程中未采用大孔樹脂法富集化合物，省去反復(fù)活化處理大孔樹脂的步驟；將合并的正定醇萃取液采用氫氧化鈉溶液洗滌，可除去大量酚酸性雜質(zhì)和有色色素，最后使用中性氧化鋁層析柱進(jìn)行純化，有效地除去極性與目標(biāo)成分相似的色素雜質(zhì)，可直接得到純品，無需重結(jié)晶，提高了純品的得率，值得推廣應(yīng)用。文檔編號(hào)C07J53/00GK101376669SQ20081015622公開日2009年3月4日申請(qǐng)日期2008年10月7日優(yōu)先權(quán)日2008年10月7日發(fā)明者劉維周,張李陽,鳴阮,陳玉勝,霍光明,饒玉鵬申請(qǐng)人:南京曉莊學(xué)院