專利名稱：抗h5n1來源的禽流感病毒核蛋白np的單克隆抗體及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于免疫學領域，更具體的，本發(fā)明涉及抗H5N1來源的禽流感病 毒核蛋白NP的單克隆抗體及其應用。
背景技術：
流感一般具有高致病性，高傳染性，傳播迅速，死亡率高的特點，對它的 診斷主要針對禽類和人類。 一般都有臨床、流行病學診斷、病理學與病原學診 斷、血清學診斷與其他檢測技術。禽流感的床癥狀因感染禽的種類、年齡、并 發(fā)感染情況及新感染毒株的毒力等不同而表現(xiàn)不一致。其病理變化因感染病毒 株毒力的高低、病程的長短及種類也不盡相同，而且無特征性性狀和剖檢變化。 所以，流感的診斷一直依賴于病原的分離鑒定和血清學診斷。這些診斷方法局 限于實驗室診斷，有如下缺點(l)操作危險，容易發(fā)生污染和感染，只能在專 業(yè)實驗室由專業(yè)人員來操作；(2)耗時長，工序多， 一般都需要10小時以上； (3)儀器繁雜，成本高，而且需要專業(yè)人員才能分析結果和數(shù)據(jù)并作出診斷報告；
這對疾病的診斷和病例的篩出極為不便。尤其當大規(guī)模的A型流感爆發(fā)之際，
需要對易感人群和禽類進行大規(guī)模篩査，需要快速有效的得到結果，以上方法 耗時長，方法復雜又存在地域局限，很不利于疾病的大規(guī)模篩査和診斷。 根據(jù)病毒抗原特性及其基因特性的不同，流感病毒分為甲、乙、丙三型(即
A, B， C型)。甲型抗原變異性最強，感染人類和其他動物，引起中、重度疾 病，侵襲所有年齡組人群，常引起世界性大流行。乙型變異性較弱，僅感染人 類， 一般引起輕微的疾病，主要侵襲兒童，可引起局部爆發(fā)。丙型抗原性比較 穩(wěn)定，僅引起嬰幼兒感染和成人散發(fā)病例。
甲型流感病毒根據(jù)H和N抗原不同，又分為許多亞型，H可分為15個亞 型(H1 H15)， N有9個亞型(N1 N9)。其中僅H1N1、 H2N2、 H3N2主要感染 人類，其它許多亞型的自然宿主是多種禽類和動物。所以本領域通常所稱禽流 感屬于甲型流感。其中對禽類危害最大的為H5、 H7和H9亞型毒株。 一般情況下，禽流感病毒不會感染鳥類和豬以外的動物。但1997年香港首次報道發(fā) 生18例H5N1人禽流感感染病例，其中6例死亡，引起全球廣泛關注。1997 年以后，世界上又先后幾次發(fā)生了禽流感病毒感染人的事件。具有高致病性的 H5N1、 H7N7、 H9N2、等禽流感病毒， 一旦發(fā)生變異而具有人與人的傳播能力， 會導致人間禽流感流行，預示著禽流感病毒對人類已具有很大的潛在威脅。
禽流感病毒為球形約為100nm， RNA型，由三部分組成，其核心部分由單 鏈負RNA和包于其外的核蛋白(NP)組成。其病毒RNA片段5長約115 Kb，編 碼病毒核衣殼蛋白(NP)，它是一種單體磷酸化的多肽，是構成病毒核衣殼的主 要蛋白成分，與基因組RNA—起構成核酸核蛋白體(RNP)，然后與RNA聚合 酶共同構成病毒的核心成分。NP蛋白具有型特異性，是流感病毒劃分A、 B、 C型的主要依據(jù)，同時，在病毒基因組的轉錄和復制以及決定宿主特異性方面 都有重要作用。由于NP是細胞毒性T淋巴細胞識別的主要抗原，所以人們一 直期望它所誘導的免疫保護性能給動物提供保護，然而NP的單克隆抗體卻不 能給動物提供被動保護，并且用體外合成的NP來免疫動物時，也只能產生較 微弱的保護能力。AIV核蛋白(NP)為構成病毒核衣殼的主要蛋白成分，其結 構高度保守、變異率很低、具有群和型的特異性，是流感病毒型分類和診斷的 基礎，也是禽流感病毒(A型流感)診斷的重要依據(jù)。
由于禽流感(A型)的爆發(fā)會構成對人類健康的巨大威脅，也會引起養(yǎng)殖業(yè) 和農業(yè)的巨大損失，因此一旦出現(xiàn)流感感染事件就會在社會上引起人們的巨大 恐慌。但流感當中相當一部分屬于B型和C型，真正的A型流感只占少數(shù)。 因此為了更加準確及時的對流感進行診斷，對維護人類健康和社會穩(wěn)定意義重 大。目前市場上僅有少數(shù)產品能特異性的診斷區(qū)分A， B， C型，其質量和穩(wěn) 定性均不太可靠。對于流感這種爆發(fā)率高，死亡率高的疾病，準確有效的診斷 產品有巨大的市場需求。
因此，本領域有必要通過篩選獲得識別效果良好的禽流感病毒NP蛋白特 異性單克隆抗體，以更準確地鑒定禽流感病毒，為臨床診斷、治療爭取時間。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一類特異性抗禽流感病毒核蛋白(NP)的單克隆 抗體°
本發(fā)明的另一目的在于提供特異性抗禽流感病毒的檢測試劑盒。在本發(fā)明的第一方面，提供一種特異性抗禽流感病毒核蛋白(NP)的單克隆 抗體，所述的單克隆抗體由選自下組的雜交瘤細胞株產生 保藏號為CCTCC-C200812的雜交瘤細胞株(S-200-23); 保藏號為CCTCC-C200811的雜交瘤細胞株(S-171-9);或 保藏號為CCTCC-C200810的雜交瘤細胞株(S-290-3)。
在另一優(yōu)選例中，保藏號為CCTCC-C200812的雜交瘤細胞株產生的單克隆 抗體具有SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列的重鏈可變區(qū)基因。
在另一優(yōu)選例中，保藏號為CCTCC-C200812的雜交瘤細胞株產生的單克隆 抗體具有SEQIDNO: l所示核苷酸序列的重鏈前導序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供所述的單克隆抗體的用途，用于制備檢測禽流 感病毒的試劑或試劑盒。
在本發(fā)明的第三方面，提供一種雜交瘤細胞株，所述的雜交瘤細胞株選自 保藏號為CCTCC-C200812的雜交瘤細胞株； 保藏號為CCTCC-C200811的雜交瘤細胞株；或 保藏號為CCTCC-C200810的雜交瘤細胞株。
在本發(fā)明的第四方面，提供一種檢測禽流感病毒的試劑盒，所述的試劑盒 含有所述的一個或多個單克隆抗體。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒含有
固相載體，所述的固相載體上包被有至少一種第一抗體，該第一抗體是本 發(fā)明所述的單克隆抗體。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還含有
第二抗體，該第二抗體是抗禽流感病毒核蛋白的多克隆抗體。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還含有
酶聯(lián)免疫檢測試劑，包括但不限于標記物(如酶)，標記物對應的底物， 顯色劑，洗滌液或終止液。
在本發(fā)明的第五方面，提供體外(非診斷或治療性地)檢測禽流感病毒的方法，包括以下步驟
(a) 將待測樣品加樣于包被有第一抗體的固相載體，從而使待測樣品中的 禽流感病毒核蛋白與固相載體上的第一抗體結合，形成帶有"核蛋白-第一抗體" 二元復合物的固相載體；所述的第一抗體選自本發(fā)明所述的單克隆抗體(或抗禽 流感病毒核蛋白的多克隆抗體)；
(b) 將第二抗體加樣于(a)獲得的固相載體，從而形成帶有"第二抗體-核蛋 白-第一抗體"三元復合物的固相載體；所述的第二抗體是抗禽流感病毒核蛋白 的多克隆抗體(或本發(fā)明所述的單克隆抗體)；且所述的第二抗體攜帶一標記物；
(c) 檢測三元復合物中的標記物，確定待檢測樣品中禽流感病毒核蛋白的 存在與否以或存在的量，從而確定禽流感病毒的存在與否；
或者，包括以下步驟
(al)將待測樣品包被于固相載體；
(a2)將檢測抗體加樣于(al)的固相載體，從而使待測樣品中的禽流感病毒 核蛋白與固相載體上的檢測抗體結合，形成帶有"核蛋白-檢測抗體"二元復合 物的固相載體"；所述的檢測抗體選自本發(fā)明所述的單克隆抗體，且所述的檢 測抗體攜帶一標記物-,
(a3)檢測二元復合物中的標記物，確定待檢測樣品中禽流感病毒核蛋白的 存在與否以或存在的量，從而確定禽流感病毒的存在與否。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而 易見的。


圖1顯示了 NP蛋白原核表達的SDS-PAGE電泳分析。各泳道樣品依次為 1:低分子量蛋白marker;
2: PGEX-4t-l-NP轉入到大腸桿菌后，IPTG誘導前表達情況(菌體上樣)； 3和4: PGEX-4t-l-NP轉入到大腸桿菌后，IPTG (0,5mM)誘導后表達情 況(菌體上樣)；
5和6: Thrombin酶切后純化得到的原核表達NP蛋白。
圖2顯示了 NP蛋白原核表達誘導前，超聲破細胞前后的SDS-PAGE電泳分析。各泳道樣品依次為-
1:低分子量蛋白marker;
2: PGEX-4t-l-NP轉入到大腸桿菌后，IPTG誘導前表達情況(菌體上樣) 3: IPTG誘導后表達情況(菌體上樣)；
4: IPTG誘導后菌體超聲破碎細胞上清中表達情況(菌體超聲破碎后t清 上樣)；
5: IPTG誘導后菌體超聲破碎細胞沉淀中表達情況(菌體超聲破碎后沉淀 上樣)。
圖3顯示了免疫印跡法檢測NP鼠多抗識別滅活AIV中的NP蛋白的能力。 A為NP鼠多抗對原核表達的NP-GST重組蛋白的識別情況，其中"AIV
火活"是NP鼠多抗對滅活AIV的識別情況。
B為NP鼠多抗對原核表達的NP重組蛋白的識別情況，其中"AIV滅活"
是NP鼠多抗對滅活AIV的識別情況。
圖4A-B顯示了間接ELISA法檢測S-171-9、 S-200-23、 S-220-10、 S-290-3
的抗體株分泌的抗體對抗原的識別情況。
圖4C顯示了夾心ELISA法檢測S-96-10、 S-171-9、 S-176-8、 S-200-23、 S-220-10、 S-290-3的抗體株分泌的抗體對抗原的識別情況。
圖5A顯示了夾心ELISA法檢測S-290-3抗體株分泌的單抗與酶標多抗夾 心檢測抗原的結果。
圖5B顯示了夾心ELISA法檢測S-171-9抗體株分泌的單抗與酶標多抗夾 心檢測抗原的結果。
圖5C顯示了夾心ELISA法檢測S-200-23抗體株分泌的單抗與酶標多抗夾 心檢測抗原的結果。
圖6顯示了利用多抗包被，加抗原后再用本發(fā)明的單抗作為檢測抗體的夾 心法ELISA法檢測結果。
具體實施例方式
本發(fā)明人經過廣泛的研究，找到一類效果優(yōu)異的特異性抗禽流感核蛋白 (NP)的單克隆抗體。所述的單克隆抗體對于抗禽流感病毒核蛋白的檢測范圍 寬。并且，其可良好地識別復雜體系中的NP抗原，不與其它蛋白發(fā)生交叉反應， 特異性和靈敏度均非常高。
禽流感核蛋白NP氨基酸序列長，抗原決定簇很多被包在蛋白結構的內部， 因此難以找到一種特異性高的單克隆抗體。NP的很多抗體識別表位為空間表 位，很多表位是在序列中間，沒有在蛋白序列N端或者C端。本發(fā)明的抗原在 制備過程中因為是變性純化的，所以識別該變性蛋白的抗體是識別NP空間結 構上的線性表位區(qū)而非空間表位區(qū)。目前，盡管本領域已經開發(fā)出一些抗NP 單克隆抗體，然而當將這些抗體用于實際檢測時，仍然遭遇到與天然NP蛋白 結合特性差的問題，這是由于待測樣品中NP蛋白的抗原決定簇被包在蛋白結 構內部，無法接觸到抗體造成的。當用這種單克隆抗體檢測樣品時，需要將樣 品進行處理(如加熱變性)，使被包埋的抗原決定簇暴露出來，這一方面造成臨 床檢測程序的復雜化，使得檢測時間過長；另一方面，由于加熱變性會導致待 測樣品中其它各種蛋白的變性，從而大大提高非特異性結合的發(fā)生率，造成干 擾，降低檢測的準確性。
針對上述技術難題，本發(fā)明人制備了許多種針對NP蛋白的單克隆抗體， 經過大量的、反復的研究試驗，最終找到了本發(fā)明的抗NP單克隆抗體(分別由 雜交瘤細胞株S-200-23， S-290-3， S-171-9產生)，所述單克隆抗體對于NP蛋 白具有很高的特異性，不結合于NP以外的其它蛋白。并且，當用于檢測時， 無需對待測樣品進行過多的處理即可方便地獲得精確的檢測結果。
為了獲得較好的效果，本發(fā)明人采用NP-GST融合蛋白來免疫動物，并用 純化的NP蛋白(不含GST蛋白)來篩選單克隆抗體。
并且，以所述的單克隆抗體為基礎，可制備方便、快速且準確地檢測禽流 感病毒的試劑盒。
禽流感病毒核蛋白的原核表達
表達禽流感病毒核蛋白NP的方法是本領域己知的，通常包括 (a) PCR擴增獲得NP蛋白的編碼序列；(b) 將(a)所述的核蛋白的編碼序列插入表達載體的多克隆位點中，獲得插 入了核蛋白編碼序列的表達載體；
(c) 使(b)獲得的插入了核蛋白編碼序列的表達載體轉入宿主細胞，獲得轉 化的宿主細胞；
(d) 培養(yǎng)轉化的宿主細胞，從而表達出核蛋白；
(e) 分離獲得禽流感病毒核蛋白NP。
作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的表達載體為PGEX-4t-l載體，其中自 帶有GST標簽。
將表達載體引入到基因工程化的宿主細胞中，即可表達所述的蛋白。在本 發(fā)明的優(yōu)選方式中，采用的宿主細胞為大腸桿菌Rossetta。
本發(fā)明人采用原核表達禽流感病毒核蛋白NP的方法，高效的在大腸桿菌 中表達并純化了NP，表達量高，特異性強，易于純化并具有完整的空間構象。 基于所述的NP蛋白研制了抗NP蛋白的單克隆抗體以及多克隆抗體。
單克隆抗體
本領域技術人員均了解， 一種抗原可能含有多個抗原表位(抗原決定簇)， 因此，針對同一個抗原可以獲得不止一個抗體，這些抗體對抗原的結合特性(如 特異性等)均可能是不同的。因此，針對同一個抗原，本領域人員需要進行大量 的反復比較、篩選和鑒定，才能找到適合于特異性結合的單抗。本發(fā)明人做了 大量的工作，找到了本發(fā)明的抗NP單克隆抗體(分別由雜交瘤細胞株S-200-23， S-290-3， S-171-9產生)，其具有高特異性結合NP蛋白的能力，可見其結合的 是NP蛋白(或含該蛋白的復合物)空間結構上被暴露于表面的抗原決定簇(表 位)。且與NP蛋白以外的其它蛋白沒有交叉反應。
本發(fā)明的抗體是對禽流感病毒NP具有特異性的單克隆抗體。這里，"特 異性"是指所述抗體能結合于NP蛋白或其片段；更特別地，指那些能與NP 蛋白或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。
本發(fā)明的單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等，Nature 256; 495， 1975; Kohler等人，EurJ.Immunol. 6:511， 1976; Kohler等， Eur.J.Immunol. 6:292， 1976; Hammerling等，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas， Elsevier, N.Y.， 1981)。本發(fā)明的單克隆抗體的一種雜交瘤的制備方法是(1)利用抗核蛋白NP免疫小鼠；(2)分離經免疫的小鼠的脾細胞， 與SP2/0骨髓瘤細胞株融合；(3)加入小鼠腹腔飼養(yǎng)細胞與融合細胞共培養(yǎng)， 并篩選陽性株；(4)有限稀釋法克隆化篩選，從而獲得單克隆抗體細胞株，從 所述細胞株中篩選可生產所需單克隆抗體的細胞株。
本發(fā)明的單克隆抗體還可以利用NP基因產物或片段或功能區(qū)，通過免疫 技術獲得。此外，還可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。本領域人 員均了解，在得到了所述的單克隆抗體的雜交瘤細胞系或通過測序等手段得知 所述的單克隆抗體后，本領域人員可以方便地獲得所述的抗體。
作為本發(fā)明的一種實施方式，所述的單克隆抗體可以由下列制備方法所制 備，所述方法包括步驟(1)提供佐劑預處理的小鼠；(2)在小鼠腹腔內接種所 述的雜交瘤細胞并分泌單克隆抗體；(3)抽取腹水，分離獲得所述的單克隆抗 體。作為一種方式，從腹水中分離單克隆抗體的方法是收集腹水，用經硫酸
銨、辛酸沉淀，接著用Protein G預裝層析柱純化，獲得高純度的抗NP單克隆 抗體。
此外，也可按照常規(guī)的動物細胞培養(yǎng)方法，體外培養(yǎng)擴增所述的雜交瘤細 胞，從而使之分泌所述的單克隆抗體。
在獲得了本發(fā)明的抗NP單克隆抗體后，本領域人員可通過多種途徑來靈敏 地檢測樣品中NP蛋白及其濃度，采用的技術可以是免疫學領域中常用的技術。
檢測試劑盒
本發(fā)明提供了一種用于檢測樣品中是否存在禽流感病毒的檢測試劑盒，該 試劑盒中含有一種或多種本發(fā)明的抗NP單克隆抗體(分別由雜交瘤細胞株 S-200-23， S-290-3， S-171-9產生)。
在獲得了本發(fā)明提供的抗NP單克隆抗體后，可以方便地制備出用于特異性 檢測禽流感病毒的檢測試劑盒。所述試劑盒中除了含有本發(fā)明的抗NP單克隆抗 體以外，還可以包含其它檢測試劑或輔劑，如顯色劑、標記物、二抗、抗抗體、 增敏劑等。本領域人員應理解，各種變化形式的檢測試劑盒均是包含在本發(fā)明 中的，只要其中利用了本發(fā)明的抗NP單克隆抗體作為與NP特異性結合的試劑。
作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，本發(fā)明人根據(jù)雙抗夾心法的原理，制備了一種用于檢測NP蛋白水平的試劑盒。雙抗夾心法常規(guī)的做法是將包被抗體固定于 載體，然后包被抗體與抗原反應，洗滌后再與檢測抗體反應(所述的檢測抗體攜 帶可檢測信號，或可與攜帶可檢測信號的物質結合)，最后進行化學發(fā)光或酶聯(lián) 顯色反應檢測信號。雙抗夾心法特別適用于具有兩個或兩個以上表位的抗原的 檢測。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明的抗NP單克隆抗體與另一種抗體(優(yōu)選的為一 種抗NP多克隆抗體)來將目標抗原NP吸附及定位，其定位和放大效果良好， 具有良好的特異性和精密度。
作為另一種可選擇的檢測方式，采用間接ELISA法，將待測的抗原包被于 固相載體上，利用本發(fā)明的單克隆抗體檢測NP。
所述的包被抗體被包被在固相載體上。本發(fā)明對所采用的固相載體沒有特 別的限制，只要其能夠與本發(fā)明的單克隆抗體或多克隆抗體相偶聯(lián)(連接)即可。 例如，所述的固相載體選自微量滴定板(如96孔板)、或微球等。所述的檢測 抗體可以是本發(fā)明的單克隆抗體或多克隆抗體?？蓪⒈景l(fā)明的單克隆抗體固定 在固相載體上作為包被抗體，用抗NP蛋白的多克隆抗體來作為檢測抗體；此外， 也可采用抗NP蛋白的多克隆抗體作為包被抗體，釆用本發(fā)明的單克隆抗體作為 檢測抗體。
所述的多克隆抗體可通過常規(guī)的方法來制備，例如，可通過將所述的NP 蛋白導入動物中來獲得，例如將NP蛋白或滅活的病毒免疫動物。免疫方法可 使用動物皮下注射。所述動物可選自兔、羊、牛等。例如將NP蛋白0.Img/次 免疫兔，免疫周期1.5-4個月(更優(yōu)選的，為2個月左右)，優(yōu)選間隔2-4周重復 免疫；然后可從兔靜脈血中收獲抗血清并純化，獲得抗NP多克隆抗體。
如本文所用，所述的"標記物"是指用于確定待檢測樣品中NP的存在與否 以及存在的量的標志物。在確定了本發(fā)明的試劑盒所采用的包被抗體和/或檢測 抗體后，可以采用本領域常規(guī)用于與檢測抗體結合來進行檢測的各種標記物。 本發(fā)明對所采用的標記物沒有特別的限制，只要是能夠與所述的檢測抗體結 合，且在適當處理后能夠準確地指示待檢測樣品中NP蛋白的存在與否以及存在
量的標記物均是可用的。所述的標記物可直接被設置于檢測抗體上；或者，所 述的標記物也可被設置于特異性抗檢測抗體的抗抗體上，本領域人員可根據(jù)所 采用的抗體的種類和特性，選擇適宜的標記物。例如，所述的標記物可以選自辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、P-D-半乳糖苷 酶、脲酶、過氧化氫酶、或葡萄糖淀粉酶。
當采用如上所示的一些酶標記物時，還需要采用一些與相應的酶結合的底 物，從而可通過顯色等方式來報導標記物的存在情況或者存在量。如本文所用， 所述的"與標記物相對應的底物"是指可被標記物所催化顯色，用于顯示檢測 抗體與NP發(fā)生結合的識別信號。所述的底物例如用于辣根過氧化物酶的鄰 苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、 ABTS;用于堿性磷酸酯酶的對硝基苯 磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate, p-NPP);等等。本領域人員可根據(jù)所采用的 標記物的種類和特性，選擇適宜的底物。
為了獲得定量結果，可以在檢測過程中設置含已知濃度的多個NP蛋白的 標準品。對于標準品的設置方法可釆用常規(guī)的方法。
利用所述的標準品，標準曲線如下設置以標準品的OD值檢測結果為縱 坐標(Y軸)，標準品濃度為橫坐標(X軸)繪制成用于定量標準曲線。從而，根 據(jù)待測樣品檢測獲得的OD值，利用標準曲線可計算出待測樣品中NP蛋白的濃 度。
為了消除假陽性和假陰性，也可在檢測過程中設置質控(對照)。 此外，為了使本發(fā)明的試劑盒在檢測時更方便，所述的試劑盒中優(yōu)選的還 包含其它一些輔助試劑，所述的輔助試劑是ELISA試劑盒中常規(guī)使用的一些試 劑，這些試劑的特性以及它們的配制方法均是本領域技術人員所熟知的。所述 的試劑例如(但不限于)顯色劑、洗滌液、終止液、增敏稀釋液。
此外，在所述試劑盒中還可包含使用說明書，用于說明其中裝載的試劑的 使用方法。
通過酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實驗證實，本發(fā)明的單克隆抗體和多克隆抗體 能有效的識別滅活的禽流感病毒(A型流感病毒)。由此制備得到了能用于A型 流感病毒診斷的ELISA試劑盒。其特異性和靈敏度均達到良好要求。
本發(fā)明人采用這種方法研制的NP單克隆抗體和ELISA試劑盒能有效的用
于A型流感病毒的檢測，特異性高，靈敏度高，耗時短，成本低，工序簡單， 能快速靈敏有效的對A型流感病毒進行診斷，將其與B， C型流感病毒進行區(qū)分。檢測禽流感病毒的方法
在獲得了本發(fā)明提供的抗NP單克隆抗體和/或試劑盒后，可以利用多種免 疫學相關方法來檢測樣品中NP蛋白或其含量，從而得知待測樣品的供體是否感 染禽流感，這些方法均被包含在本發(fā)明中。
作為一種優(yōu)選方式，本發(fā)明提供一種體外(非診斷或治療性地)檢測禽流感
病毒的方法，包括以下步驟
(a) 將待測樣品加樣于包被有第一抗體的固相載體，從而使待測樣品中的 禽流感病毒NP與固相載體上的第一抗體結合，形成帶有"NP-第一抗體"二元 復合物的固相載體；所述的第一抗體是本發(fā)明所述的單克隆抗體(或抗禽流感病 毒核蛋白的多克隆抗體)；
(b) 將第二抗體加樣于(a)獲得的固相載體，從而形成帶有"第二抗體-NP-第一抗體"三元復合物的固相載體；所述的第二抗體是抗NP的多克隆抗體(或 本發(fā)明所述的單克隆抗體)且攜帶一標記物；
(c) 檢測三元復合物中的標記物，從而確定待檢測樣品中禽流感病毒NP的 存在與否以或存在的量，從而確定禽流感病毒的存在與否。
作為另一種可選擇的檢測方式，釆用間接ELISA法，包括以下步驟 (al)將待測樣品包被于固相載體；
(a2)將檢測抗體加樣于(al)的固相載體，從而使待測樣品中的禽流感病毒 NP與固相載體上的檢測抗體結合，形成帶有"NP-檢測抗體"二元復合物的固 相載體"；所述的檢測抗體是本發(fā)明所述的單克隆抗體，且所述的檢測抗體攜 帶一標記物；
(a3)檢測二元復合物中的標記物，確定待檢測樣品中禽流感病毒NP的存 在與否以或存在的量，從而確定禽流感病毒的存在與否。
此外，也可將抗NP的多克隆抗體包被于固相載體，將本發(fā)明所述的單克隆 抗體作為檢測抗體來檢測樣品中NP蛋白或其含量。
按照上述方法，只要設置已知濃度的抗原對照，制作濃度標準曲線，通過 比照濃度標準曲線就可以得出待測樣品中的NP含量。
作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，定量檢測NP蛋白的方法具體如下(i) 抗原抗體反應將本發(fā)明的抗NP單克隆抗體包被在多孔板上，之后在 多孔板的不同微孔內分別加入不同濃度的標準品、質控品(可選)，或待測血清 樣品；
(ii) 酶聯(lián)反應將第二抗體(其上設置有標記物或可與攜帶標記物的抗體結 合)溶液加入各孔，振蕩、孵育、洗滌；
(iii) 顯色反應每孔加入對應于標記物的底物、顯色劑，孵育，每孔加入 反應終止液，結束反應；
(iv) 酶標儀測定OD值； (V)結果計算:
A) 制作標準曲線以標準品濃度為橫坐標，標準品測定OD值為縱坐標， 作出標準曲線；
B) 評判質控品濃度(可選)根據(jù)質控品的OD值，從標準曲線上讀出相應 的濃度值；質控品測定濃度值處于給定范圍時，該次測定有效；
C) 計算待測樣品濃度當標準曲線和質控品(可選)被判定有效時，根據(jù)待 測樣本的OD值從標準曲線計算出待測血清樣品的NP蛋白濃度。
作為本發(fā)明的另一種方式，定量檢測NP蛋白的方法具體如下
(1) 分別以不同濃度NP標準品和待測樣品包被固相載體；
(2) 在經包被的固相載體上加入本發(fā)明的單克隆抗體，該單克隆抗體上連
接有標記物或可與標記物相連接(還包括加入標記物使之連接于該單克隆抗
體)；
(3) 加入對應于標記物的底物、顯色；
(4) 結果計算(同前述)。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于
(1) 提供一類新的針對禽流感病毒NP的特異性單克隆抗體，是結合天然 NP蛋白空間結構上外露表位的單克隆抗體。
(2) 所述的單克隆抗體具有敏感、特異、制備成本低的特點，當用于檢測 時，無需對待測樣品進行過多的處理即可方便地檢測出樣品中NP的含量，且 與樣品中的其它蛋白無交叉反應。
(3) 提供一種基于所述單克隆抗體的試劑盒，所述的試劑盒靈敏度和準確 性非常高。且所述的試劑盒在操作時不需要加熱等處理步驟，可以準確快速地下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說 明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方 法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建 議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
實施例l: NP蛋白的原核表達
本發(fā)明人獲得了含有目的基因片段的重組pGEM-T-vector載體(獲自上海英 沐生物科技有限公司)，以該載體為模板，以
CGCGGATCCATGGCGTCTCAAGGC (SEQ ID NO: 3);禾口 CCGCTCGAGTTTAATTGTCATACTC (SEQ ID NO: 4)
為引物，通過PCR擴增得到編碼NP蛋白的目的基因。獲得的基因經測序驗 證不含突變。
通過兩端添加BamH I和Xho I酶切位點的引物，將上述克隆的基因連接 到PGEX-4t-l載體(購自Novagen公司)，獲得PGEX-4t-l-NP重組質粒。再將 該重組質粒轉化到Rossetta表達型大腸桿菌中，在0.5mM IPTG條件下誘導， 表達的蛋白主要存在于上清中。
表達在上清中的NP蛋白通過載體自帶的GST標簽純化，純化介質釆用法 瑪西亞公司產品Glutathione Sepharose 4B 。純化的蛋白濃度2mg/ml，共6ml， 12mg。
將得到的NP-GST重組蛋白，通過重組蛋白上特殊的thrombin酶切位點， 用thrombin酶(sigma公司產品)將NP與GST蛋白切開，通過Glutathione Sepharose 4B珠子將GST與NP蛋白分離，得到原核表達的NP蛋白，濃度 1.5mg/ml，共7ml， 10mg左右。蛋白大小如下
NP蛋白大小55KD;
NP-GST重組蛋白81-83KD。
NP蛋白誘導表達前后以及酶切后的表達情況見圖1。 NP蛋白原核表達誘導前、超聲破細胞前后的表達情況見圖2。實施例2:動物免疫
用實施例1中純化的NP-GST融合蛋白免疫小鼠。Balb/c小鼠免疫劑量 O.lmg每只每次。肌肉多點注射。免疫程序0， 3， 6周進行三次免疫。融合 前3天取O.lmg蛋白腹腔注射，做回憶剌激。取小鼠抗血清，可獲得鼠抗NP 多抗。
用實施例1中純化的NP蛋白免疫雄性新西蘭白兔。劑量lmg每只每次。 皮下體內多點注射。免疫程序0， 3， 6周3次免疫。取抗血清，獲得兔抗NP多抗。
實施例3:滅活禽流感病毒(H5N1毒株)免疫印跡檢測 滅活禽流感(AIV) H5N1毒株純化后病毒蛋白由武漢病毒所提供。用鼠抗 NP多抗對其進行免疫印跡檢測。實驗流程如下
1. SDS-PAGE
樣品原核表達的NP及NP-GST重組蛋白；滅活禽流感病毒(H5N1毒株)、 原核重組表達的禽流感HA蛋白。 上樣量5^1;
上層膠3.5%，下層膠12%，上層膠100V30分鐘，下層膠150V1小時。
2. 轉膜
電流200mA， 90分鐘。
3. 封閉
3y。BSA封閉2小時。
4. 雜交
一抗均1:5000稀釋在相應的封閉液中，4'C雜交過夜。
抗抗體羊抗鼠HRP(購自Sigma公司)，1:1000稀釋。均雜交1小時。
5. 顯色
鼠多抗Western印跡驗證實驗。 陰性對照(NC): HA蛋白。結果分析如圖3所示，NP鼠多抗能特異性識別滅活AIV中的NP蛋白， 對HA不發(fā)生交叉反應。即可開始融合制備單抗。
實施例4:雜交瘤細胞株的構建及單克隆抗體的制備
小鼠回憶刺激后3天做融合。取免疫后小鼠的脾臟細胞和鼠骨髓瘤細胞 SP2/0采用聚乙二醇(PEG)常規(guī)融合法做融合。
融合后加HAT選擇性培養(yǎng)基，篩選采用ELISA法，用于篩選的抗原為實 施例1中純化的NP蛋白。經過3次有限稀釋法克隆化篩選，從諸多單克隆抗 體株中選擇得到6株單抗，包括S-96-10、 S-220-10、 S-171-9、 S-200-23、 S-290-3、 S-176-8。然后通過以下ELISA進行進一步篩選。
1. 間接ELISA法
通過間接ELISA法，對克隆號為S-171-9、 S-200-23、 S-220-10、 S-290-3的 抗體株分泌的抗體進行識別效果驗證。
包被用滅活禽流感病毒(H5N1毒株)包被96孔板，濃度10ug/ml。陽性 對照(PC):用原核表達的重組NP蛋白包被96孔板，濃度5ug/ml。常規(guī)方法洗 板后，用5。/。BSA封閉，洗板。
在包被了抗原的96孔板各孔內加一抗，分別是S-171-9、S-200-23、S-220-10、 S-290-3，按照倍比稀釋濃度梯度為1: 200， 1: 400， 1: 800， ， 1: 102400。 常規(guī)方法洗板。
經過前述處理的96孔板各孔中再加羊抗鼠抗抗體1: 5000，常規(guī)方法洗滌， 顯色。
結果發(fā)現(xiàn)，S-220-10分泌的抗體對滅活的禽流感病毒中的NP蛋白不能識 別，其它3株抗體的識別情況良好，見圖4A-B。
2. 夾心法
包被抗體分別是前述獲得的6株單抗，克隆號分別為S-96-10、 S-171-9、 S-176-8、 S-200-23、 S-220-10、 S-290-3;及多抗。
抗原滅活禽流感病毒蛋白；陰性對照(NC):檢測原核HA蛋白。
檢測抗體酶標兔抗NP多抗；對照酶標抗H5N2鼠多抗。
其它方面操作方法同間接ELISA法。結果見圖4C，可見S-96-10、 S-220-10、 S-176-8作為包被抗體，識別效果不 理想；而采用S-171-9、 S-200-23、 S-171-9的識別效果較為理想。
綜上可見，除S-220-10分泌的抗體不能識別天然滅活病毒中的蛋白外，其 它5株分泌的抗體均可以識別。在進行單抗包被+多抗酶標檢測的實驗中發(fā)現(xiàn) S-171-9、 S-200-23、 S-2卯-3三株抗體株分泌的抗體可以成功地夾心檢測，該三 株抗體株分泌的單克隆抗體可良好地識別NP蛋白，特異性高。
實施例5:特異性識別效果驗證 采用夾心法ELISA,步驟如下
(1) 包被
將單克隆抗體S-171-9、 S-200-23和S-2卯-3分別用包被液按l: 5000稀釋 (5Pg/ml)，加樣于96孔板的孔中，每孔加50pl， 4。C包被過夜。
(2) 封閉
封閉液3%BSA。
每孔IO(HU， 37'C封閉2小時。
(3) 洗滌
用水沖洗每孔10次，加洗液浸泡3分鐘，再棄去洗液，重復1次后拍干 96孔板。
(4) 加樣本
在各孔中加入滅活禽流感病毒(H5N1毒株)，用封閉液(5% BSA)稀釋，濃 度分別為10u g/ml，5 p g/ml，2.5u g/ml， 1 u g/ml， 500ng/ml， 100ng/ml， 50ng/ml， 10ng/ml， 0。
陰性對照原核表達的禽流感HA蛋白，用封閉液(5y。BSA)稀釋，濃度分 另廿為10ug/ml， 5ng/ml， 2.5ng/ml， lng/ml， 500ng/ml， 100ng/ml， 50ng/ml， 10ng/ml， 0。
陽性對照原核表達的NP蛋白。
每孔50pl， 37'C孵育2小時。(5) 洗滌
用水沖洗每孔10次，加洗液浸泡3分鐘，再棄去洗液，重復1次后拍干 96孔板。
(6) 加抗抗體雜交
常規(guī)方法用HRP標記前述制備的兔多抗，獲得標記的兔多抗。 HRP酶標前述抗禽流感病毒NP兔抗血清，將標記的兔多抗h 1000稀釋 于封閉液中，每孔加50pl， 37。C孵育2小時。
(7) 洗滌
用水沖洗每孔10次，加洗液浸泡3分鐘，再棄去洗液，重復1次后拍干 96孔板。
(8) 顯色
加底物顯色5-8分鐘，OD450讀數(shù)。
結果見圖5。實驗結果表明，本發(fā)明人制備的單克隆抗體和多克隆抗體能 有效識別禽流感病毒中的NP蛋白，能通過夾心ELISA法識別禽流感病毒中的 NP蛋白，而對禽流感病毒中的其他蛋白不識別，特異性高，快速靈敏，工序 簡單。S-171-9、 S-200-23檢測下限約為5ug/ml， S-290-3的檢測下限約為2.5 U g/ml 。
實施例6:本發(fā)明的單克隆抗體作為檢測抗體的識別驗證
采用夾心法ELISA法。用兔抗NP多抗進行包被，與抗原反應后，再加本發(fā) 明的單抗，作為檢測抗體進行檢測。
1. 包被
將純化好的兔多抗用包被液按l: 2000稀釋(5ug/ml)，加入到96孔板中， 每孔加50iiil， 4'C包被過夜。
2. 封閉封閉液3%BSA;
每孔100W， 37'C2小時。
3. 洗滌
用水沖洗每孔10次，加洗液浸泡3分鐘，再棄去洗液，重復一次后拍干96 孔板。
4. 加抗原
加滅活禽流感病毒(H5N1毒株)，用封閉液稀釋，濃度為5ug/ml; 陰性對照(NC):原核表達的禽流感HA蛋白，用封閉液稀釋，濃度為
g/ml;
陽性對照(PC):原核表達的NP蛋白； 每孔各加入50nl， 37°C 2小時。
5. 洗滌
用水沖洗每孔10次，加洗液浸泡3分鐘，再棄去洗液，重復一次后拍干96 孔板。
6. 加檢測抗體雜交
加入單抗S-171-9、 S-200-23和S-290-3，用封閉液按l: 1000稀釋，每孔力口 50pl， 37匸2小時。
7. 洗滌
用水沖洗每孔10次，加洗液浸泡3分鐘，再棄去洗液，重復一次后拍干96 孔板。
8. 加酶標記抗抗體雜交
加入羊抗鼠HRP, 1:1000稀釋。均37'C雜交1小時。洗板。
9. 顯色
加底物顯色5-8分鐘，OD450讀數(shù)。結果見圖6，可見本發(fā)明的單克隆抗體作為檢測抗體也可良好地識別滅活 禽流感病毒中的NP蛋白。
實施例7:本發(fā)明的單克隆抗體的測序
對本發(fā)明的單克隆抗體進行測序鑒定，其中S-200-23抗體株分泌的單克隆 抗體的重鏈基因如下
重鏈前導序列(信號肽核苷酸序列)(SEQ ID NO: 1):
重鏈可變區(qū)核苷酸序列(SEQ ID NO: 2;下劃線依次是CDR1， CDR2和 CDR3):
GGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
實施例8:試劑盒
將S-200-23抗體以lOjug/ml的濃度(溶于碳酸鹽包被液中)包被酶標板，4 'C過夜。用ELISA洗滌液洗板；用1% BSA于37'C封閉2h。用ELISA洗滌
液洗板。
將上述處理的酶標板晾干，裝于合適的包裝中，同時還在其中裝入前述制 備的兔抗NP多抗，以及抗兔酶標抗抗體，從而獲得所述的試劑盒。
生物材料保藏
本發(fā)明制備的雜交瘤細胞保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國 武漢)，分別為
雜交瘤細胞株S-290-3:保藏號CCTCCNO: C200810;保藏日2008年3月27
曰；
雜交瘤細胞株S-171-9:保藏號CCTCCNO: C200811;保藏日2008年3月27曰；
雜交瘤細胞株S-200-23:保藏號CCTCCNO: C200812;保藏日2008年3月27曰。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻 被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，
本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申 請所附權利要求書所限定的范圍。序列表
<110〉中國科學院上海生命科學研究院
<120> 抗H5N1來源的禽流感病毒核蛋白NP的單克隆抗體及其應用
<130〉 082684
<160〉 4
<170〉 Patentln version 3. 3
<210〉 1
<211> 57
〈212〉 隨
<213〉 小鼠(Mus墜culus)
<■> 1
3tgggatgga gctat8tcat cctctttttg gtagcaacag caacaggtgt ccactcc 57
<210〉 2
<211〉 366
<212〉 DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400〉 2
caggtccaactgcagcagtctgggactgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagttg60
tcctgcaaggcttctggctacaccttcaccagctactatatgtactgggtgaaacagagg120
cctggacaaggccttgagttg3ttggag￡Lggittgatcctagcaatggtggtactaacttc180
aatga^gaagtggccacactgeictgtagacaaatcctccagcacatcatac240
atgcagctcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattactgttc犯gatcccgc300
ttctatgatggttaccgggggtacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtc360
tcctca
<210> 3
<211〉 24
<212> DNA
<213〉 人工序列
<220>
<221〉 misc—feature <223〉 引物
<400> 3
cgcggatcca tggcgtctca aggc 24 <210〉 4<211〉 25 <212〉 隨 <213> 人工序列
<220>
<221〉 misc—feature <223> 引物
<400〉 4
ccgctcgagt ttaattgtca tactc
權利要求
1.一種特異性抗禽流感病毒核蛋白的單克隆抗體，其特征在于，所述的單克隆抗體由選自下組的雜交瘤細胞株產生保藏號為CCTCC-C200812的雜交瘤細胞株；保藏號為CCTCC-C200811的雜交瘤細胞株；或保藏號為CCTCC-C200810的雜交瘤細胞株。
2. 如權利要求l所述的單克隆抗體，其特征在于，保藏號為 CCTCC-C200812的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體具有SEQ ID NO: 2所示核 苷酸序列的重鏈可變區(qū)基因。
3. 如權利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于，保藏號為 CCTCC-C200812的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體具有SEQ ID NO: l所示核 苷酸序列的重鏈前導序列。
4. 權利要求l-3任一所述的單克隆抗體的用途，其特征在于，用于制備檢 測禽流感病毒的試劑或試劑盒。
5. —種雜交瘤細胞株，其特征在于，所述的雜交瘤細胞株選自 保藏號為CCTCC-C200812的雜交瘤細胞株； 保藏號為CCTCC-C200811的雜交瘤細胞株；或 保藏號為CCTCC-C200810的雜交瘤細胞株。
6. —種檢測禽流感病毒的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒含有權利要 求l所述的一個或多個單克隆抗體。
7. 如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒含有 固相載體，所述的固相載體上包被有第一抗體，該第一抗體是權利要求l所述的單克隆抗體。
8. 如權利要求6或7所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還含有 第二抗體，該第二抗體是抗禽流感病毒核蛋白的多克隆抗體。
9. 如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還含有 酶聯(lián)免疫檢測試劑。
10. 體外檢測禽流感病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟(a)將待測樣品加樣于包被有第一抗體的固相載體，從而使待測樣品中的 禽流感病毒核蛋白與固相載體上的第一抗體結合，形成帶有"核蛋白-第一抗體"二元復合物的固相載體；所述的第一抗體選自權利要求l所述的單克隆抗體；(b) 將第二抗體加樣于(a)獲得的固相載體，從而形成帶有"第二抗體-核蛋 白-第一抗體"三元復合物的固相載體；所述的第二抗體是抗禽流感病毒核蛋白 的多克隆抗體；且所述的第二抗體攜帶一標記物；(c) 檢測三元復合物中的標記物，確定待檢測樣品中禽流感病毒核蛋白的 存在與否以或存在的量，從而確定禽流感病毒的存在與否；或者，包括以下步驟(al)將待測樣品包被于固相載體；(a2)將檢測抗體加樣于(al)的固相載體，從而使待測樣品中的禽流感病毒 核蛋白與固相載體上的檢測抗體結合，形成帶有"核蛋白-檢測抗體"二元復合 物的固相載體"；所述的檢測抗體選自權利要求l所述的單克隆抗體，且所述 的檢測抗體攜帶一標記物；(a3)檢測二元復合物中的標記物，確定待檢測樣品中禽流感病毒核蛋白的 存在與否以或存在的量，從而確定禽流感病毒的存在與否。
全文摘要
本發(fā)明公開了特異性抗禽流感病毒核蛋白(NP)的單克隆抗體，所述抗體來源于保藏號為CCTCC NOC200810、CCTCC NOC200811或CCTCC NOC200812的雜交瘤細胞株。所述單克隆抗體特異性和靈敏度高。本發(fā)明還公開了檢測禽流感病毒的試劑盒。
文檔編號C07K16/08GK101591390SQ20081003836
公開日2009年12月2日 申請日期2008年5月30日 優(yōu)先權日2008年5月30日
發(fā)明者唐琳娜, 兵 孫, 季永鏞, 董慶犀 申請人:中國科學院上海生命科學研究院