專利名稱：：苦竹有效成分提取物的制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及天然藥物化學和生物化學等學科，具體涉及從中草藥苦竹中提取具有酪氨酸酶活性抑制作用的有效成分的方法。
背景技術：
：酪氨酸酶是黑素生物合成途徑中的主要限速酶。大多數(shù)能使皮膚脫色的物質都通過抑制該酶活性來阻滯皮膚黑素生成，屬酪氨酸酶抑制型皮膚脫色劑(Depigmentingagent)。近年來，從微生物和植物藥中分離天然的酪氨酸酶抑制劑已得到人們的普遍關注。它不但用于色素增加性皮膚病(黃褐斑、雀斑等)的臨床治療，而且可用于化妝品使膚色增白。一般來說，與酪氨酸酶的底物類似的單酚類化合物氫醌能抑制該酶活性，許多具有相似官能團結構的單酚或多酚化合物也能抑制酪氨酸酶活性。但氫醌及其它酚類化合物的外用制劑化學性質不穩(wěn)定，容易氧化變色，另外還有這類物質引起皮膚永久性白斑的報告，限制了此類化合物的開發(fā)和應用。維生素C和熊果苷是當前美白化妝品中比較常用的添加物。但是，維生素C同樣也是非常不穩(wěn)定，無法直接添加到產(chǎn)品中，通常采用維生素C的衍生物(如維生素C的磷酸鹽等)。而熊果苷在近年來的研究中也發(fā)現(xiàn)其抑制酪氨酸酶活性不是非常穩(wěn)定。因此，尋找活性高、安全的酪氨酸酶抑制劑仍是目前研究的一個熱點。竹子這一具有豐富資源的植物在國內外已有多方面的開發(fā)利用。在化妝品生產(chǎn)方面，除了作為一些化妝品輔助產(chǎn)品的原料以外，如睫毛刷、眼影刷和腮紅刷等的手柄和一些化妝品的包裝盒之類產(chǎn)品，竹子還以竹類提取物的形式被用作天然化妝品和功能性化妝品的有效添加物，具有保濕、美白、抗衰老、抗炎癥、清潔以及護發(fā)等多種功能。例如，意大利的Erbasol公司從竹筍中提取得到a-羥基酸具有更新細胞、保持pH平衡的作用，被應用于保濕沐浴露的生產(chǎn)；日本NOEVIA公司從一種開花竹中獲得的提取物可以有效抑制B16黑素細胞中酪氨酸酶的T3異構酶的生成，將其應用于新型美白化妝品的開發(fā)。國內則由浙江安吉的圣氏生物制品有限公司開發(fā)出的竹葉黃酮產(chǎn)品，可作為天然生物抗氧化劑應用于醫(yī)藥、保健和化妝品等多種行業(yè)中。目前對苦竹(尸/ez'o脇虛51謂amsKeng(Keng)f.(Gramineae))的研究相對較少?？嘀窆S在中藥記載中具有清熱，除濕，明日，治療目痛，口瘡，湯火傷等功能。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于，提供上述中草藥提取物的制備方法。本發(fā)明提供的從苦竹(P/e/oWaWiwaman/:yKeng(Keng)f.(Gmmineae))，特別是苦竹筍中制備的提取物中，主要有效成分是Taxiphyllin，2R-P-D-吡喃葡萄糖基-2-對羥基苯乙腈，分子式為C14H17N07(分子量為311)，可占提取物的98%以上，結構為將本發(fā)明所述提取物分離提純可得到白色針晶(氯仿-甲醇)，溶于水、甲醇。在預制硅膠板上點樣展開，用碘顯色，斑點顏色由黃色逐漸變成綠色，再變成藍色，且于空氣中放置，顏色并不消失；當展開劑為氯仿-甲醇(2:1);乙酸乙酯-甲醇(1:3)苯-甲醇(2:1)時，Rf值分別為0.56、0.17、0.42。經(jīng)過電噴霧電離質譜(ESI-MS)，高分辨電子轟擊質譜(HREI-MS)，13CNMR和&NMR等數(shù)據(jù)表明該化合物的分子式為C14H17N07。元素分析顯示，該化合物含有一個腈基。^-NMR(400MHZ，二甲亞砜-d6)顯示，該化合物存在一對位取代的苯環(huán)結構(S7.32和S6.82，J=8.6Hz，4H)和一個羥基(S9.84，S5.23，S5.05，S4.98和54.55，5H)。^-NMR氫譜數(shù)據(jù)和己發(fā)表的Cyanogenicglucosidetaxiphyllin數(shù)據(jù)一致。nC-NMR碳譜數(shù)據(jù)如表1所示。表1苦竹提取物的^C-NMR碳譜數(shù)據(jù)c苦竹提取物CN118.51123.02128.93115.24157.85115.26128.9765.9r99.72，72.93，76.34,69.85，77.16，61.1本發(fā)明的中草藥提取物具體制備方法為方法一1.苦竹筍用乙醇回流提取2次，得到浸膏；2.苦竹筍浸膏加水溶解(約510倍體積)離心、過濾；3.濾液用正丁醇或者氯仿、乙酸乙酯等溶劑萃?。?.浸膏用硅膠柱，用氯仿-甲醇洗脫；5.重結晶。方法二1.苦竹筍用IO倍體積的5090%乙醇回流提取2次，得到浸膏;2.苦竹筍浸膏加水溶解(約510倍體積)；3.水溶液加入95%乙醇沉淀，放置過夜；4.濾液濃縮過濾，并用氯仿、石油醚或等正丁醇溶劑萃??；5.用大孔吸附樹脂吸附，用3060%乙醇洗脫；6.硅膠柱層析，用氯仿-甲醇梯度洗脫；7.以甲醇或丙酮、無水乙醇等重結晶。方法三1.苦竹筍用10倍體積的50~90%乙醇回流提取2次，得到浸膏；2.苦竹筍浸膏加水溶解(約812倍體積)離心、過濾；3.濾液稍加濃縮后用大孔樹脂洗脫，乙醇-水梯度洗脫；4.洗脫液用硅膠柱層析進行分離，所用溶劑為氯仿-甲醇(2:l5:l);5.重結晶。本發(fā)明所述的苦竹有效成分提取物，具有良好的抗氧化活性，同時具有明顯的酪氨酸酶抑制活性。將本發(fā)明的提取物和維生素C以及熊果苷在不同濃度下作酪氨酸酶活性抑制對比，結果見圖1，可以看出在反應物濃度較高時，苦竹有效成分提取物(YF4332)和維生素C(Vc)活性水平基本接近，高于熊果苷；在低濃度范圍內，維生素C和熊果苷活性迅速下降，而苦竹有效成分提取物(YF4332)下降緩慢。因此，苦竹有效成分提取物(YF4332)的作用范圍比維生素C和熊果苷更加寬泛，有利于配方成本的降低。從上述內容可知，本發(fā)明的苦竹有效成分提取物十分適合用于膚色增白的化妝品，或者是色素增加性皮膚病藥物。本申請中包括的附圖是說明書的一個構成部分，附圖與說明書和權利要求書一起用于說明本發(fā)明的實質內容，用于更好地理解本發(fā)明。附圖中圖1是本發(fā)明的苦竹有效成分提取物(YF4332)和維生素C以及熊果苷在不同濃度下的酪氨酸酶活性抑制對比示意圖。圖2是在黑素細胞中熊果苷和本發(fā)明的苦竹有效成分提取物(YF4332)酪氨酸酶抑制活性與濃度的關系示意圖。圖3是在黑素細胞中熊果苷和本發(fā)明的苦竹有效成分提取物(YF4332)黑素生成抑制與濃度的關系示意圖。實施方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但這些實施例不對本發(fā)明構成任何限制。實施例1按照分離方法一進行制備苦竹筍的乙醇浸膏S82g，用510倍量水溶解沉淀，過濾后的濾液用25倍量的溶劑如氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等萃取，萃取液經(jīng)過硅膠柱層析，用氯仿-甲醇(10:11:1)洗脫，重結晶后得1812.7mg苦竹提取物。實施例2按照分離方法二進行制備苦竹筍的乙醇浸膏700g，用510倍水溶解，加入24倍的95%乙醇放置過夜。過濾，濾液濃縮過濾后用正丁醇、或氯仿、石油醚等溶劑萃取。萃取液經(jīng)甲醇溶解后過濾，濾液上大孔吸附樹脂用30~60%的乙醇洗脫至無色，得餾份26g。經(jīng)甲醇溶解后上硅膠柱層析，用氯仿-甲醇梯度洗脫，經(jīng)甲醇或丙酮、無水乙醇等重結晶后得白色固體，即苦竹有效成分提取物0.68g。在本方法中，活性成分苦竹有效成分提取物(YF4332)得率為1%。；其純度可以達到99.8%。實施例3按照分離方法三進行制各苦竹筍的乙醇浸膏500g，加入812倍體積的水溶解、沉淀，離心過濾后的濾液稍稍濃縮，上大孔吸附樹脂用乙醇-水梯度洗脫，得餾份14.8g(此時用高效液相色譜HPLC分析即可在231.8nm檢測到苦竹有效成分提取物(YF4332)含量為73.4%)。然后上硅膠柱層析，用氯仿-甲醇(2:15:1)洗脫，重結晶后析出針狀晶體，即苦竹有效成分提取物(YF4332)157.6mg。實施例4抗氧化活性分析采用DPPH自由基清除法測定抗氧化活性。測定方法o.lml含有不同濃度添麗磊溺樣品與3.9ml的DPPH.乙醇溶液充分混勻，室溫放置30分鐘后測定517納米吸光度值(OD517nm)。表1:抗氧化活性<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例5體外酪氨酸酶活性抑制測定原理在酪氨酸酶的作用下，左旋多巴(L-DOPA)氧化為棕褐色的多巴色素(DOPAchrome)。測定方法0.5ml含有不同濃度添加劑的樣品與0.5ml的10u/ml酪氨酸酶溶液和1.5ml緩沖液充分混勻，置3(TC水浴孵育20分鐘。然后在每一試管中，加入1.0ml的0.2%L-DOPA，30。C水浴準確反應5分鐘，即刻用分光光度計于475nm處測定多巴色素的吸收峰值，表2:酪氨酸酉每抑制活性<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例6黑素細胞內酪氨酸酶活性抑制測定方法B16黑素細胞培養(yǎng)24小時后添加苦竹有效成分提取物(YF4332)，經(jīng)過48小時培養(yǎng)后用生理鹽水將培養(yǎng)基沖洗干凈。加入聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)在37。C孵育30min，移取0.2ml用茚三酮定量細胞蛋白質，向余下細胞中加入Dopa，在37'C孵育30min時測定OD475。測試了苦竹提取物在黑素細胞中對酪氨酸酶活性的抑制。結果如圖2所示。數(shù)據(jù)表明苦竹有效成分提取物(YF4332)在黑素細胞中的確具有抑制酪氨酸酶活性和黑素的作用。實施例7黑素細胞黑素生成抑制測定方法向培養(yǎng)24小時后的黑素細胞中添加苦竹有效成分提取物(YF4332)，經(jīng)過48小時培養(yǎng)后用磷酸鹽緩沖液(PBS)將培養(yǎng)基沖洗干凈。加入胰酶消化細胞。離心后去上清，同樣移取0.2ml用茚三酮定量細胞蛋白質，向余下細胞中加入NaOH煮沸20min，冷卻后測定400納米吸光度值(OD400)。測試了苦竹提取物在黑素細胞中對黑素生成的抑制。結果如圖3所示。數(shù)據(jù)表明苦竹有效成分提取物(YF4332)在黑素細胞中的確具有抑制黑素生成的作用。權利要求1、一種苦竹有效成分提取物的制備方法，其特征在于包括下列步驟將苦竹原料用乙醇回流提取2次或2次以上，得到浸膏，將浸膏加水沉淀，離心、過濾，濾液經(jīng)過萃取或濃縮后洗脫，再經(jīng)過硅膠柱層析分離，重結晶得到苦竹有效成分提取物。2、如權利要求l所述的制備方法，其中用于回流提取的乙醇濃度為5090%。3、如權利要求l所述的制備方法，其中浸膏加水沉淀時水的用量為浸膏的510倍體積。4、如權利要求l所述的制備方法，其中將濾液洗脫的時候采用的吸附劑是大孔樹脂。5、如權利要求l所述的制備方法，其中硅膠柱層析分離所用溶劑為氯仿、甲醇混合液。全文摘要本發(fā)明提供一種苦竹有效成分提取物，其制備方法以及其在化妝品和制藥中的應用。所述提取物的主要有效成分是Taxiphyllin(2R-β-D-吡喃葡萄糖基-2-對羥基苯乙腈)，其具有良好的抗氧化活性，同時具有明顯的酪氨酸酶抑制活性，可應用于膚色增白的化妝品，或者是色素增加性皮膚病藥物。文檔編號C07H1/08GK101112355SQ20071011273公開日2008年1月30日申請日期2004年12月24日優(yōu)先權日2004年12月24日發(fā)明者慧姚,林惠芬,魏少敏申請人:上海家化聯(lián)合股份有限公司