專(zhuān)利名稱(chēng)：由單克隆抗體產(chǎn)生的凋亡增強(qiáng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海藻糖含量低于65%的抗體組合物用于體外凋亡誘導(dǎo) 的用途。
背景技術(shù)：
抗體不僅越來(lái)越多地應(yīng)用于研究中，它們也形成了用于診斷和治療方 法的理想工具，其中它們?yōu)槌Ｒ?guī)的治療提供了另 一種選擇。
許多具有治療用途的血漿或單克隆來(lái)源抗體目前已經(jīng)上市或者正處 于臨床開(kāi)發(fā)。它們的特性;故用來(lái)獲得能夠特異性結(jié)合其靶物和能夠有效招 募免疫效應(yīng)細(xì)胞并由此通過(guò)這些細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能導(dǎo)致靶細(xì)胞被破壞 的治療工具。
然而，在一些比如慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)這樣的病理學(xué)中，觀 察到患者具有有缺陷的免疫效應(yīng)細(xì)胞(尤其是NK細(xì)胞)活性，這可能是 導(dǎo)致這些患者中次級(jí)病理學(xué)發(fā)生率提高的原因(Ziegler等人，1981)。而 且，當(dāng)用抗-CD20單克隆抗體Rituxan治療這些患者的CLL時(shí)，該治療似乎 功效很小，這可能部分歸因于其N(xiāo)K細(xì)胞的低ADCC活性(Farag2003)。
在紅斑狼疳患者患者(Green 2005 )、擴(kuò)張性心肌病患者(Anderson 1982)、嗜血細(xì)胞性組織細(xì)胞增生癥(穿孔素缺陷——ClementiR, 2005 ) 和HIV-感染患者(穿孔素和酶缺陷——Portales， 2003 )中也發(fā)現(xiàn)了NK細(xì) 胞缺陷。因此由于與前述的相似性，對(duì)于CLL患者來(lái)說(shuō)令人害怕的是，采 用常規(guī)的單克隆抗體治療將具有極少或沒(méi)有效果。
因此本申請(qǐng)人嘗試提供其活性不依賴(lài)于免疫效應(yīng)細(xì)胞細(xì)胞毒性功能 且由此能夠施用于具有減弱的免疫效應(yīng)細(xì)胞活性的患者的工具。
在文獻(xiàn)WO 01/77181中，申請(qǐng)人證明了選擇可用于產(chǎn)生具有經(jīng)由 FcgammaRIII受體(CD16)的強(qiáng)ADCC活性的抗體的細(xì)胞系的重要性。其 中顯示，對(duì)比如YB2/0這樣的大鼠淋巴瘤細(xì)胞系中產(chǎn)生的抗體Fc區(qū)的改良 糖基化會(huì)導(dǎo)致ADCC活性提高。所述抗體組合物的聚糖結(jié)構(gòu)賦予抗體組合 物低巖藻糖基化。
申請(qǐng)人驚奇的發(fā)現(xiàn)所述抗體組合物，除了其強(qiáng)細(xì)胞毒性活性外，其表 面表達(dá)CD16的細(xì)胞的存在下誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而CHO中產(chǎn)生的相同抗體則 具有低得多的引發(fā)凋亡的傾向。

發(fā)明內(nèi)容
因此本發(fā)明涉及其海藻糖含量低于65 %的抗體組合物用于體外、離體 或體內(nèi)誘導(dǎo)凋亡的用途。
本發(fā)明的第一目的尤其涉及用抗體組合物體外、離體或體內(nèi)誘導(dǎo)靶 細(xì)胞凋亡的方法，它包括在表面表達(dá)CD16的細(xì)胞存在下，將抗體組合物 與靶細(xì)胞接觸，抗體針對(duì)靶細(xì)胞，并且抗體組合物的海藻糖含量低于65 %。
抗體由通過(guò)二硫鍵結(jié)合在一起的重鏈和輕鏈組成。各鏈由位于N-末端 位置特異于抗體所針對(duì)的抗原的可變區(qū)(或結(jié)構(gòu)域)以及位于C-末端位置 的恒定區(qū)組成，所述恒定區(qū)由輕鏈的一個(gè)CL結(jié)構(gòu)域和重鏈的數(shù)個(gè)結(jié)構(gòu)域 (CHp CH2和CH3)組成?？勺儏^(qū)與重鏈和輕鏈的CHi和CL結(jié)構(gòu)域的結(jié)合 構(gòu)成抗體的Fab片段，其通過(guò)一個(gè)能夠使各Fab與靶抗原結(jié)合的非常靈活的 鉸鏈區(qū)與Fc區(qū)連接。介導(dǎo)抗體的效應(yīng)器特性的Fc區(qū)保持能夠與比如FcyR 受體(FcgammaR)這樣的效應(yīng)器分子接近。由兩個(gè)球形結(jié)構(gòu)域012和013
組成的Fc區(qū)在CH2結(jié)構(gòu)域處被糖基化，兩條鏈上都存在有結(jié)合于精氨酸297 (Asn 297 )的雙觸角(bi國(guó)antenna) N國(guó)聚糖。
所述N-聚糖為以下通式，其上可添加其它糖類(lèi)(顯示形式"GO"):
因此，在本發(fā)明的抗體組合物中，"海藻糖"意指由這些N-寡糖攜帶 的海藻糖。海藻糖分子，當(dāng)其存在時(shí)，結(jié)合于N-寡糖的N-?；咸前?(GlcNAc),該GlcNAc本身結(jié)合于Asn297。
由各抗體的兩條重鏈任一攜帶的各N-聚糖可能或者可能不攜帶海藻 糖分子。因此根據(jù)其N(xiāo)-聚糖是否不攜帶海藻糖、僅其N(xiāo)-聚糖中的 一個(gè)攜帶 一個(gè)海藻糖分子、或其兩個(gè)2N-聚糖各攜帶一個(gè)海藻糖分子，各抗體可能 含有0、 l或2個(gè)海藻糖分子。
因此，"其海藻糖含量低于65 %的抗體組合物"意指這樣的抗體組合 物，其中在由組合物中的抗體的各糖基化位點(diǎn)所攜帶的所有聚糖結(jié)構(gòu)中， 低于65%含有海藻糖分子。
有利的是，所述聚糖結(jié)構(gòu)更特別地選自下述形式
<image>image see original document page 6</image> 因此，有利地，在由本發(fā)明組合物中的抗體的各糖基化位點(diǎn)(Asn297) 所攜帶的形式G0、 G0F、 G1和G1F的聚糖結(jié)構(gòu)中，海藻糖含量低于65%。
所述抗體組合物及其在ADCC(抗體依賴(lài)的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)誘 導(dǎo)方面的有利特性描述于文獻(xiàn)WO 01/77181中。
本發(fā)明的抗體組合物具有引起強(qiáng)凋亡反應(yīng)的獨(dú)特性和優(yōu)勢(shì)。凋亡在引 起細(xì)胞死亡中起重要作用。凋亡誘導(dǎo)涉及許多因素，但是它們都達(dá)到一條 經(jīng)由線(xiàn)粒體、蛋白質(zhì)Bcl-2及其級(jí)聯(lián)反應(yīng)的共同途徑。
引發(fā)細(xì)胞程序性死亡的主要機(jī)制是脅迫(例如低氧合)、用細(xì)胞毒性 物質(zhì)或皮質(zhì)激素處理、生長(zhǎng)因子的去除、DNA損傷和死亡信號(hào)(細(xì)胞毒性 淋巴細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞、TNF-a壞死因子的Fas受體)的傳遞。
細(xì)胞死亡信號(hào)后，導(dǎo)致凋亡相關(guān)蛋白被激活的級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活。磷脂 酰絲氨酸被從細(xì)胞膜內(nèi)表面轉(zhuǎn)定位到外表面。通過(guò)Annexin V在細(xì)胞表面 的固定，可在體外將它們可視化。然后可以看見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)、核和染色質(zhì)濃縮、 DNA片段化、質(zhì)膜起泡以及膜對(duì)稱(chēng)性的喪失。在該階段，細(xì)胞體外固定碘 化丙啶(DNA嵌入劑)。之后形成被其四周所包圍的巨噬細(xì)胞消化的凋亡 體。
由本發(fā)明的抗體組合物所誘導(dǎo)的凋亡的增強(qiáng)，不是緣于免疫效應(yīng)器細(xì) 胞的毒性功能，而是由抗體Fc區(qū)與表達(dá)于免疫效應(yīng)器細(xì)胞表面的CD16受 體的強(qiáng)聚集所誘導(dǎo)的。
有利地，基于G0F+G1F形式的含量低于50W，優(yōu)選低于30%的理解， 本發(fā)明的抗體組合物具有濃度高于60 % ,優(yōu)選高于80 %的 G0+G1+G0F+G1F形式。
本發(fā)明抗體組合物凋亡誘導(dǎo)的體外證明，是用與NK細(xì)胞相反的經(jīng) CD16轉(zhuǎn)染的缺乏細(xì)胞溶解活性Jurkat細(xì)胞完成的。這形成了一個(gè)其中細(xì)胞 死亡只能由凋亡誘導(dǎo)的模型。
因此，本發(fā)明的意欲體外誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡的方法，借助在其表面表達(dá)
CD16但并非效應(yīng)器細(xì)胞的細(xì)胞來(lái)實(shí)施。這些細(xì)胞因此不具有或不再具有 針對(duì)把細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。例如，可以提到CD16 Jurkat細(xì)胞。
用本發(fā)明的組合物的凋亡的體外增強(qiáng)用任何表達(dá)CD 16的效應(yīng)器細(xì)胞 實(shí)現(xiàn)，尤其是表達(dá)CD16的外周血細(xì)胞，比如單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞、嗜中性 粒細(xì)胞、NK細(xì)胞和特定的T-細(xì)胞亞群。因此本發(fā)明的組合物可以在定量 或定性免疫效應(yīng)器細(xì)胞(細(xì)胞毒性細(xì)胞)群缺陷(無(wú)ADCC )下存在使用。 在這種情況下，通過(guò)其它在其表面表達(dá)CD16的細(xì)胞(CD16+細(xì)胞)，尤 其是在其表面表達(dá)CD16但不具有或不再具有細(xì)胞毒性活性的細(xì)胞，該增 強(qiáng)是可能的。
在B-細(xì)胞CLL (慢性淋巴細(xì)胞白血病)患者以及紅斑狼癡患者中發(fā)現(xiàn) 了所述缺陷，在B-細(xì)胞CLL患者中觀察到了NK細(xì)胞活性的下降(Foa 1986, Ziegler 1981)或更確切地說(shuō)是細(xì)胞溶解分子缺陷(Katrinakis 1996)，在紅斑狼瘙患者中描述了NK細(xì)胞缺陷(Green2005)。在所述病 理學(xué)中可根據(jù)本發(fā)明使用該抗體組合物。
有利地，本發(fā)明的抗體組合物具有低于55%,或甚至低于40%、 30% 或20%的海藻糖含量。
在一種尤其有利的方式中，抗體組合物的海藻糖含量介于20 %和45 % 之間，或介于25%和40%之間。
在尤其有利的方式中，本發(fā)明的抗體組合物還具有低于0.6的海藻糖/ 半乳糖含量比率。有利地，該比率低于0.5;低于0.4;低于0.2或更有利地 低于O.l。為本發(fā)明的目的，"海藻糖含量/半乳糖含量比率，，意指抗體組 合物中的海藻糖含量與抗體組合物中半乳糖含量之間的比率，這兩種糖類(lèi) 能夠被結(jié)合于組合物中抗體上各糖基化位點(diǎn)(Asn 297)的各聚糖結(jié)構(gòu)攜 帶。
有利地，本發(fā)明中所使用的抗體組合物產(chǎn)生于YB2/0細(xì)胞系，或源自 YB2/0并帶來(lái)相同的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，尤其是糖基化，的特性的任何細(xì) 胞。
根據(jù)其產(chǎn)生抗體組合物的能力來(lái)選擇該系，經(jīng)過(guò)選擇后，其中一些抗 體組合物顯示低糖基化，該特性的實(shí)用性由本申請(qǐng)人在本發(fā)明中通過(guò)能夠 誘導(dǎo)強(qiáng)凋亡的抗體組合物的生產(chǎn)得到證實(shí)。
因此本發(fā)明的又一個(gè)目的是YB2/0細(xì)胞系用于生產(chǎn)具有強(qiáng)凋亡能力的 抗體的用途。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是，選擇具有強(qiáng)凋亡能力的抗體組合物的方法， 包括以下步驟
1) 在在其表面表達(dá)CD16受體的細(xì)胞存在下，將待評(píng)估抗體與所述抗 體的抗原(和表達(dá)該抗原的細(xì)胞)接觸；
2) 測(cè)定誘導(dǎo)的凋亡；
3) 選擇與陰性對(duì)照相比，在表達(dá)CD16的細(xì)胞存在下，顯示所誘導(dǎo)的 凋亡高出至少20 % ,甚至高出50 %或更多的抗體組合物。
在實(shí)施該方法的步驟l)時(shí)，該陰性對(duì)照可通過(guò)例如在不表達(dá)CD16的 細(xì)胞存在下獲得。
對(duì)于步驟2),凋亡誘導(dǎo)的測(cè)定可通過(guò)幾種不同的方式進(jìn)行，利用特 定的常規(guī)技術(shù)來(lái)測(cè)定凋亡，比如Annexin V的測(cè)定(凋亡早期階段測(cè)定暴 露于細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨酸)與碘化丙咬相關(guān)的測(cè)定(凋亡發(fā)展期測(cè)定 DNA降解)或比如YO Pro-l這樣的其它標(biāo)記物(DNA嵌入劑測(cè)定該DNA 的片|爻<匕)。
為本發(fā)明的目的，"強(qiáng)凋亡能力"意指在CD16-表達(dá)細(xì)胞的存在下， 誘導(dǎo)與陰性對(duì)照相比至少高出20 % ,甚至高出50 %或更多的凋亡的能力。
為實(shí)施該方法，在其表面表達(dá)CD16的細(xì)胞可以是CD16-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞， 尤其是Jurkat細(xì)胞，表達(dá)CD16的外周血細(xì)胞，例如單核細(xì)胞-巨謹(jǐn)細(xì)胞、嗜 中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞和T-細(xì)胞的一些亞群，這個(gè)列表不是限制性的。優(yōu) 選地，在其表面表達(dá)CD16的細(xì)胞是不具有或不再具有任何細(xì)胞毒性活性 的細(xì)月包。
有利地，本發(fā)明的方法還包括確定所選擇的抗體組合物中海藻糖含 量的步驟。該確定可在將待評(píng)估抗體與抗原接觸之前完成，或者對(duì)顯示所 誘導(dǎo)的凋亡大于陰性對(duì)照的抗體組合物的選擇之后進(jìn)行。
如果抗體組合物海藻糖含量的確定是在將待評(píng)估抗體與抗原接觸前 完成，則有利的是選擇具有低于65%海藻糖含量的抗體組合物。優(yōu)選地， 所選擇的抗體組合物具有低于30 %或介于20 %和45 %之間，或介于25 % 和40 %之間的海藻糖含量。
有利地，所選擇的抗體是抗-因子VIII抑制劑的抗-獨(dú)特型抗體、直接 針對(duì)靶向記憶B淋巴細(xì)胞的自體抗體的抗體、和直接針對(duì)被感染細(xì)胞表面 所表達(dá)的病毒和/或細(xì)菌蛋白的抗體，以誘導(dǎo)去除它們。還有可能選擇任 何識(shí)別優(yōu)選在腫瘤細(xì)胞，包括造血增殖，表面表達(dá)的抗原的抗體。
本發(fā)明的又一個(gè)目的涉及海藻糖含量低于65%,優(yōu)選低于30%,更優(yōu) 選在20 %與45 %之間和25 %與40 %之間的單克隆抗體組合物，或利用上述 選擇方法所選擇出的抗體組合物用于制備藥物產(chǎn)品的用途，所述藥物產(chǎn)品 不涉及免疫效應(yīng)器細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能，意欲治療選自尤其是B-CLL (B-細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病)、紅斑狼瘙、擴(kuò)張性心肌病、嗜血細(xì)胞性組織 細(xì)胞增生癥以及HIV和血友病A或B的定量或定性NK-細(xì)胞缺陷(無(wú) ADCC)。
所述抗體組合物比治療性抗體Rituxan顯示高出至少2倍、甚至有利地 1 O倍的與CD 16的交互作用。
抗體Fc區(qū)與CD16受體間的交互作用可通過(guò)與針對(duì)抗體Fc部分的結(jié)合 位點(diǎn)的3G8型抗-CD16單克隆抗體竟?fàn)幵贑D16陽(yáng)性細(xì)胞上的直接或間接 結(jié)合來(lái)測(cè)量。
有利地，根據(jù)本發(fā)明使用的抗體組合物具有大于60% ,優(yōu)選大于80 %的G0+G1+G0F+G1F形式，其被理解為形式G0F+G1F的含量低于50 %,優(yōu)選低于30%。
在尤其有利的方式中，根據(jù)本發(fā)明所使用的抗體組合物還具有低于0.6 的海藻糖含量/半乳糖含量比率。有利地，該比率低于0.5;低于0.4;低于 0.2或更有利地低于0.1。
有利地，該用途意欲用于制備治療其中一或多種效應(yīng)器細(xì)胞群體被 減少或甚至為零的病理學(xué)的藥物，所述細(xì)胞由此誘導(dǎo)經(jīng)由ADCC的低細(xì)胞 毒性活性。
本發(fā)明的又 一 個(gè)目的涉及根據(jù)本發(fā)明的方法所選擇出的與CD 16有強(qiáng) 烈相互作用或滿(mǎn)足上述巖藻糖基化特征的抗-CD20單克隆用于生產(chǎn)藥物的 用途，所述藥物不具有免疫效應(yīng)器細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能，意欲用于治療 B-CLL患者以及可以觀察到NK細(xì)胞的細(xì)胞溶解功能降低的患者。
通常本發(fā)明的抗體可用于治療任何造血細(xì)胞增殖。
本發(fā)明的有一個(gè)目的是所述單克隆抗體組合物用于生產(chǎn)藥物的用途， 所述藥物不具有免疫效應(yīng)器細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能，意欲用于治療NK細(xì)胞 缺陷患者以及不能用僅通過(guò)NK表達(dá)細(xì)胞毒性的抗體治療的患者。
借助例子，可提及的是紅斑狼瘡患者(Green 2005)、擴(kuò)張性心肌病 患者(Anderson 1982)、嗜血細(xì)胞性組織細(xì)胞增生癥患者(穿孔素缺陷) (Clementi R, 2005 )和fflV-感染患者(穿孔素和粒酶缺陷)(Portales， 2003 )。
患有trisomy-21 ( Nurmi 1982 )的那些人以及接受移植的患者 (Alamartine 1997 )也可包括在內(nèi)，后者的相關(guān)治療導(dǎo)致NK細(xì)胞缺陷和發(fā) 展中的腫瘤風(fēng)險(xiǎn)4是高。在造血病理學(xué)中，除B-CLL患者，已經(jīng)在急性髓細(xì) 胞性白血病患者(Nasrallah, 1983 )和毛細(xì)胞白血病患者(Trentin 1990 ) 中描述了與NK細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞毒性缺陷。更常見(jiàn)地，吸煙人群(Takeuchi 2001 )與非吸煙者相比顯示降低的NK活性。此外，根據(jù)本發(fā)明的抗體可 尤其有利地用于治療血友病A和B患者，可選地靶向記憶B淋巴細(xì)胞。
本發(fā)明的其它方面和優(yōu)勢(shì)描述于以下實(shí)施例中，這些實(shí)施例被解釋為 示例性的且不限制本發(fā)明的范圍。


圖l:表l
圖2:表2
圖3:經(jīng)由CD16的凋亡增強(qiáng)圖。 圖4:
A:抗-人IgG抗體對(duì)Daudi細(xì)胞的增強(qiáng)的凋亡。 B:抗-人IgG抗體對(duì)B細(xì)胞的增強(qiáng)的凋亡。在存在或不存在交聯(lián)劑 (人Ig的F(ab，)2抗-Fc片段)的情況下，存在或由抗 畫(huà)HLA-DR-EMABling⑧抗體(DR YB2/0 )和抗畫(huà)HLA DR CHO ( DR CHO )抗體在24小時(shí)時(shí)誘導(dǎo)的對(duì)純化自外周血的B細(xì)胞的凋亡。 圖5:
A: CD16Jurkat誘導(dǎo)的對(duì)Daudi細(xì)胞的增強(qiáng)的凋亡。 B: Jurkat CD16誘導(dǎo)的對(duì)B細(xì)胞的增強(qiáng)凋亡。在轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞 (CD16 Jurkat)或無(wú)CD16 ( WT Jurkat)存在下，由抗-HLA-DR
EMABling⑧抗體(DR YB2/0 )和抗國(guó)HLA DR CHO抗體(DR CHO )在 24小時(shí)時(shí)誘導(dǎo)的對(duì)純化自外周血的B細(xì)胞的凋亡。
具體實(shí)施例方式
抗體
用一種抗-HLA-DR抗體設(shè)計(jì)研究模型。它是一種重組抗體，其中可變 結(jié)構(gòu)域是大鼠來(lái)源的，而恒定部分是人源的。
在CHO系和YB2/0系(這些在YB2/0中表達(dá)的抗體被稱(chēng)作"EMABling 抗體")中表達(dá)相同的序列。 細(xì)胞
E6.1 Jurkat細(xì)胞克隆來(lái)自歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心——ECACC。這 些相同的細(xì)胞用編碼gamma (y)鏈和編碼FcyRIIIa (L48F158單元型)的 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染。這些為表達(dá)CD16而用DNA分子轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不能誘導(dǎo)經(jīng) ADCC機(jī)制的細(xì)胞毒性。
Daudi細(xì)胞來(lái)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心-ATCC。
NK細(xì)胞(自然殺傷細(xì)胞)通過(guò)在Myltenyi磁珠上的陰性選擇純化自外 周血樣品。
凋亡的"i秀導(dǎo)
條件l: Daudi細(xì)胞(2.5乂105細(xì)胞)與抗-HLA-DR ( l|tig/ml)在24孔板 (P24)中37。C孵育24小時(shí)。
條件2: Daudi細(xì)胞(2.5乂105細(xì)胞)與抗-HLA-DR( lpg/ml)在抗-人IgG (20嗎/ml)存在下在24孔板(P24)中37。C孵育24小時(shí)。
條件3: Daudi細(xì)胞(2.5乂105細(xì)胞)與抗誦HLA畫(huà)DR ( lfig/ml)在Jurkat 細(xì)胞(2.5xl()5細(xì)胞)存在下在24孔板(P24)中37。C下孵育24小時(shí)。
條件4: Daudi細(xì)胞(2.5乂105細(xì)胞)與抗-HLA-DR (lpg/ml)在用CD16 轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞(2.5x105)存在下在24孔板(P24)中37。C下酵育24小時(shí) (圖3)。
條件5: Daudi細(xì)胞(2.5乂105細(xì)胞)與抗-HLA-DR (lpg/ml)在NK細(xì) 胞(2.5xl()5細(xì)胞)以及4mMEGTA/2mMMgCl2的混合物存在下，在24孔 板(P24)中37。C下孵育24小時(shí)。 用ANNEXIN V/PI技術(shù)測(cè)定凋亡
然后收集細(xì)^m洗滌兩次后《^要照生產(chǎn)商(BD Biosciences)的i^明與 Annexin V-FITC和碘化丙梵(PI)孵育。借助Beckman Coulter的Expo 32 軟件，用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞(EPICS XL纟田胞計(jì)，Beckman Coulter)。 Annexin V的結(jié)合對(duì)應(yīng)于凋亡的早期信號(hào)，而PI的結(jié)合出現(xiàn)得較晚(DNA 片段化)，所謂的凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)任意定義為Annexin V陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)和 二倍Annexin V/PI陽(yáng)性細(xì)胞。
實(shí)施例l:抗-人IgG抗體誘導(dǎo)的凋亡增強(qiáng)(交聯(lián)劑)
在無(wú)抗體存在下觀察到的Daudi細(xì)胞凋亡(自然死亡)約為10%。該 基本數(shù)值是從不同試驗(yàn)所得結(jié)果推斷而來(lái)的，且因此任意設(shè)置為0% 。
表l(參見(jiàn)圖1 )中，結(jié)果表示為凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(Annexin V和PI陽(yáng)性)。 以l叫/ml濃度單獨(dú)使用的抗-HLA-DREMABling⑧和CHO抗體(條件l )對(duì) Daudi誘導(dǎo)極少凋亡(<3%)。另一方面，在直接針對(duì)人免疫球蛋白Fc區(qū) 的抗體的存在下(條件2),其在Daudi細(xì)胞表面聚集抗-HLA-DR抗體，對(duì) 于兩種抗體都以相同的方式使凋亡增強(qiáng)從低于3 %至19% 。
在圖4A中，結(jié)果表示為所觀察到的凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，研究了對(duì)各條 件任意代表100。/。的EMABling⑧抗體。在這些條件下，統(tǒng)計(jì)研究顯示，由 CHO表達(dá)的抗體和由抗-HLA-DR EMABling⑧抗體誘導(dǎo)的凋亡的增強(qiáng)之間 無(wú)顯著差異(p=0.85)。
顯示凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的圖4B顯示，來(lái)自外周血的B細(xì)胞的凋亡^f又在抗-人IgG抗體存在下獲得。在這些條件下，該研究顯示，由CHO(DRCHO) 表達(dá)的抗體和抗-HLA-DREMABling⑧抗體(DRYB2/0)誘導(dǎo)的凋亡增強(qiáng) 間無(wú)顯著差異。
實(shí)施例2:通過(guò)CD16 Jurkat對(duì)凋亡的增強(qiáng)
對(duì)Daudi細(xì)胞(表2，參見(jiàn)圖2 )的結(jié)果表示為凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(Annexin V和PIP日性)。在對(duì)照J(rèn)urkat細(xì)胞(未轉(zhuǎn)染的)存在下，以lpg/ml濃度使用 的抗-HLA-DR EMABling⑧和CHO抗體分別對(duì)Daudi誘導(dǎo)3 %和2 %的凋亡
(條件3)。在CD16 Jurkat細(xì)胞存在下(條件4) , CD16 Jurkat細(xì)胞可經(jīng) CD16與固定于Daudi細(xì)胞表面的抗-HLA-DR抗體的Fc部分相互作用，凋亡 被增強(qiáng)。在由CHO和EMABling⑧細(xì)胞產(chǎn)生的抗體存在下，最終的凋亡百 分?jǐn)?shù)分別為8 %和19 % 。因此，在EMABling⑧抗體存在下凋亡的增強(qiáng)約 100乂高于由CHO產(chǎn)生的抗體誘導(dǎo)的。在圖5A中，結(jié)果表示為所觀察到的 凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，各研究條件中EMABling⑧抗體任意表示100。/。。在這 些條件下，統(tǒng)計(jì)研究顯示，兩種抗體的凋亡增強(qiáng)之間存在顯著差異
(pO,OOOl) ， EMABling⑧抗體更高。
還研究了用經(jīng)CD16轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞替換抗-人IgG抗體(交聯(lián)劑)后， 源自外周血的B細(xì)胞的凋亡。野生型非轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞(WT)用作陰性 對(duì)照。表達(dá)為凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的結(jié)果(圖5B )指明，由抗-HLA-DR EMABling (DR YB2/0)誘導(dǎo)的凋亡與由在CHO (DR CHO )中產(chǎn)生的 抗體誘導(dǎo)的相比被顯著增強(qiáng)。這 一 特性可能是由于抗-HLA-DR EMABling (DR-YB2/0)與抗HL-DRCHO (DRCHO)相比更好地固定 于CD16。
EMABling 抗體與CD16的強(qiáng)相互作用不僅轉(zhuǎn)變?yōu)锳DCC和細(xì)胞因 子分泌提高(參見(jiàn)文獻(xiàn)EP 1537419)，而且還轉(zhuǎn)變?yōu)榈蛲龅脑鰪?qiáng)。這為
EMABling 抗體帶來(lái)了 一個(gè)與由CHO產(chǎn)生的相同抗體相比主要的額外
的功能優(yōu)勢(shì)。參考文獻(xiàn)
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權(quán)利要求
1.由單克隆抗體組合物誘導(dǎo)靶細(xì)胞體外凋亡的方法，包括在在其表面表達(dá)CD16的細(xì)胞存在下，將所述抗體與所述靶細(xì)胞接觸，所述抗體直接針對(duì)所述靶細(xì)胞，且所述抗體組合物具有低于65％的海藻糖含量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其特征在于所述海藻糖含量低于30%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2任意一項(xiàng)的方法，其特征在于所述海藻糖含 量介于20 %和45 %之間，或介于25 %和40 %之間。
4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其特征在于所述抗體組 合物由YB2/0細(xì)胞系產(chǎn)生。
5. YB2/0細(xì)胞系用于生產(chǎn)具有強(qiáng)凋亡能力的抗體的用途。
6. 選擇具有強(qiáng)凋亡能力的抗體組合物的方法，其包括以下步驟i) 在在其表面表達(dá)CD16的細(xì)胞存在下，將待評(píng)估抗體與所述抗體 的抗原(或者表達(dá)該抗原的細(xì)胞)接觸；ii) 測(cè)定誘導(dǎo)的凋亡；iii) 選擇與陰性對(duì)照相比(缺乏CD16 ),在表達(dá)CD16的細(xì)胞存在下， 顯示所誘導(dǎo)的凋亡高出至少20 % ，甚至高出50 %或更多的抗體 組合物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于所選擇的抗體是抗-因子VIII 抑制劑的抗-獨(dú)特型抗體、直接針對(duì)自體抗體的抗體和直接針對(duì)表達(dá)于被 感染細(xì)胞表面的病毒和/或細(xì)菌蛋白質(zhì)。
8. 單克隆抗體用于制備藥物的用途，該組合物具有低于65%的海藻 糖含量，或者根據(jù)權(quán)利要求6或7任一的方法獲得，所述藥物不具有免疫效 應(yīng)器細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能，意欲治療定量或定性NK-細(xì)胞缺陷(無(wú) ADCC)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其中所述單克隆抗體組合物的海藻糖含 量低于30%。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其中所述單克隆抗體組合物的海藻糖含 量介于20 %和45 %之間，或介于25 %和40 %之間。
11. 根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其中所述單克隆抗體組合物由YB2/0細(xì)胞 系產(chǎn)生。
12. 根據(jù)權(quán)利要求8至11任一項(xiàng)的用途，其用于制備意欲治療B-CLL的藥物。
13. 根據(jù)權(quán)利要求8至11任一項(xiàng)所述用途，該用途用于制備意欲治療 紅斑狼癡、擴(kuò)張性心肌病、嗜血細(xì)胞性組織細(xì)胞增生癥以及HIV和血友病 A或B的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種表達(dá)在細(xì)胞系YB2/0的海藻糖含量低于65％的抗-MLA-DR抗體組合物在體外誘導(dǎo)凋亡中的用途。
文檔編號(hào)C07K16/28GK101375160SQ200680052923
公開(kāi)日2009年2月25日 申請(qǐng)日期2006年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月16日
發(fā)明者克里斯托夫·德羅默夫, 納塔莉·富涅爾 申請(qǐng)人:Lfb生物科技公司