專利名稱：一種可溶性的多糖－蛋白交聯(lián)抗原的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多糖-蛋白交聯(lián)物的化學(xué)合成方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)和多糖可以通過(guò)酶催化或化學(xué)合成的方法進(jìn)行交聯(lián)。目前在固定化酶和親和層析固定相的制備中，多數(shù)制備過(guò)程涉及蛋白質(zhì)與多糖的化學(xué)交聯(lián)方法。固定化所用的載體有相當(dāng)數(shù)量和種類(lèi)是多糖物質(zhì)，這些多糖載體是大分子量的凝膠多糖。
在抗體藥物生物技術(shù)領(lǐng)域，制備可溶性的、具有特定化學(xué)組成結(jié)構(gòu)的多糖-蛋白交聯(lián)抗原已成為巨大需求。為了高效率地獲取某種特異性抗體，往往需要對(duì)可溶性的特異性抗原進(jìn)行化學(xué)修飾。通過(guò)合適的化學(xué)合成方法，原有的多糖抗原分子可以通過(guò)共價(jià)鍵連接上特定的蛋白質(zhì)或其他化合物，或原有的蛋白抗原分子可以通過(guò)共價(jià)鍵連接上特定的多糖或其他化合物。
在抗原改性設(shè)計(jì)中，要求原抗原分子在連接其他化合物分子后能保持或增強(qiáng)原有的免疫原性，同時(shí)盡可能地避免引入與交聯(lián)劑分子有關(guān)的、可能形成抗原表位的組成結(jié)構(gòu)?；瘜W(xué)交聯(lián)反應(yīng)的條件必須是溫和的，能最大程度地保留原抗原分子的免疫原性；同時(shí)，要求反應(yīng)過(guò)程中所用的試劑低毒、低污染。在現(xiàn)有的合成方法中，很少方法能滿足以上要求。
多糖-蛋白交聯(lián)的方法很多，如溴化氰法、重氮鹽偶聯(lián)法、異硫氰酸酯法、還原胺化法、活化酰基化法、雙功能試劑交聯(lián)法等。人或動(dòng)物用交聯(lián)疫苗的制備方法需滿足以下條件1)選用合適的交聯(lián)劑，避免引入可能誘導(dǎo)出不期望抗體的基團(tuán)；2)反應(yīng)條件應(yīng)溫和，避免抗原結(jié)構(gòu)被破壞；3)所用試劑盡可能無(wú)毒或低毒。理想的制備方法還應(yīng)當(dāng)操作方便，所用試劑環(huán)境友好且來(lái)源方便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可溶性的多糖-蛋白交聯(lián)抗原的新制備方法。
本發(fā)明包括將可溶性抗原多糖與蛋白通過(guò)雙功能團(tuán)交聯(lián)試劑(C2H3O)-(CH2)n-(C2H3O)共價(jià)連接的化學(xué)合成步驟；雙功能團(tuán)交聯(lián)試劑(C2H3O)-(CH2)n-(C2H3O)，式中的n＝2-10，(C2H3O)為環(huán)氧基團(tuán)。所用的交聯(lián)試劑是含6-14個(gè)碳原子的直鏈化合物，可使交聯(lián)物結(jié)構(gòu)緊湊，同時(shí)保持一定的伸展和旋轉(zhuǎn)空間。雙功能團(tuán)交聯(lián)試劑優(yōu)選1，4-丁二醇縮水二甘油醚。
前述抗原多糖包括來(lái)源于細(xì)菌的莢膜多糖以及來(lái)源于微生物和海藻的多糖，分子量20-500KDa在可溶性抗原多糖與雙功能團(tuán)交聯(lián)試劑反應(yīng)過(guò)程中，可溶性抗原多糖與雙功能團(tuán)交聯(lián)試劑的重量配比為1∶1-20，pH9.0-11.0，反應(yīng)溫度20-80℃?？乖嗵桥c載體蛋白的摩爾比為1/10-10/1。
適量的表面活性劑的存在有利于形成均相反應(yīng)系統(tǒng)，可加快反應(yīng)速度，同時(shí)保證了多糖抗原與蛋白交聯(lián)的完全性。
常用的表面活性劑如吐溫、SDS或TritionX-100等均可選用。
本發(fā)明還包括離子交換分離和凝膠柱層析分離結(jié)合的純化步驟。
純化步驟由離子交換分離和凝膠柱層析分離組合而成。當(dāng)抗原多糖為酸性多糖時(shí)，采用732陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離游離的酸性多糖；當(dāng)抗原多糖為中性多糖時(shí)，采用DEAE纖維素分離游離的中性多糖。然后采用凝膠層析柱分離游離蛋白和多糖-蛋白交聯(lián)物，最終獲得多糖-蛋白交聯(lián)物。
本發(fā)明提供的交聯(lián)方法操作簡(jiǎn)單，試劑來(lái)源方便，無(wú)毒性。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1海藻多糖與血清白蛋白(BSA)交聯(lián)物的制備
(1)稱取500mg海藻多糖(20KDa)，加入50ml 0.3％醋酸鈉溶液中，充分?jǐn)嚢?，使之溶解。再加?50mg NaBH4，溶解后，用飽和NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至11.0，然后用0.2μ膜過(guò)濾；(2)稱取10g的1，4-丁二醇縮水二甘油醚，加入溶液(1)中，再加入3.0g表面活性劑SDS，強(qiáng)力攪拌，使混合均勻；(4)在50℃條件下，反應(yīng)20h，使多糖的羥基活化，交聯(lián)試劑的一個(gè)環(huán)氧鍵打開(kāi)與之連接，形成多糖-交聯(lián)劑中間產(chǎn)物；(5)將上述的反應(yīng)混合物取出，采用截留分子量3000的超濾膜，進(jìn)行循環(huán)過(guò)濾。超濾過(guò)程可基本去除游離的交聯(lián)試劑。
(6)活化多糖與BSA的交聯(lián)稱取3000mg BSA(60KDa)，加入100ml蒸餾水，加熱(50℃)，強(qiáng)力攪拌，使之溶解，用0.2μ膜過(guò)濾。將活化多糖溶液(150ml)和BSA溶液混合，用5mol/LNa2CO3調(diào)節(jié)pH至10.5，置于55℃恒溫振蕩箱內(nèi)，反應(yīng)24小時(shí)。多糖-交聯(lián)劑中間產(chǎn)物的另一個(gè)環(huán)氧鍵打開(kāi)，與蛋白質(zhì)中的氨基或羥基反應(yīng)，生成多糖-蛋白交聯(lián)物。反應(yīng)完畢后，再往反應(yīng)液中加入10g甘氨酸，65℃，繼續(xù)反應(yīng)24小時(shí)，封閉活化多糖分子中殘留的環(huán)氧鍵活性基團(tuán)。
(7)上述的反應(yīng)液取出后，采用截留分子量3000的超濾膜，進(jìn)行超濾分離操作，去除游離的甘氨酸。采用離子交換和凝膠柱層析方法，分離游離的多糖和BSA，最終獲得海藻多糖-BSA交聯(lián)物純品。
(8)多糖蛋白交聯(lián)物的特征分析對(duì)所制備的海藻多糖-BSA交聯(lián)物純品，采用苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量，多糖含量246mg；采用福林酚法測(cè)蛋白含量，蛋白含量為2590mg。所制備的多糖-蛋白交聯(lián)物中，多糖與蛋白的摩爾比約為1/3.5。
實(shí)施例2黃桿菌莢膜多糖與BSA交聯(lián)物的制備(1)黃桿菌莢膜多糖的活化將40.0mg黃桿菌莢膜多糖(200KDa)溶于8ml 0.3％醋酸鈉溶液中，加入5mgNaBH4，混合均勻后，用飽和NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至11.0，然后用0.2μ膜過(guò)濾。在上述過(guò)濾液中，加入0.5g交聯(lián)劑(1，4-丁二醇縮水二甘油醚)和100mg表面活性劑TritionX-100，先用超聲波振蕩器劇烈振蕩20分鐘，再放入65℃恒溫振蕩箱內(nèi)，進(jìn)行多糖活化，反應(yīng)18小時(shí)?；罨?8小時(shí)后的多糖溶液取出后放入截留分子量為10000的透析袋中，對(duì)蒸餾水透析48小時(shí)，去除游離的交聯(lián)試劑。
(2)活化莢膜多糖與BSA的交聯(lián)取出透析后的反應(yīng)液，50℃濃縮至5ml，加入1ml BSA水溶液(50.0mg/ml)，振蕩使之混合均勻后，用飽和Na2CO3溶液調(diào)節(jié)pH至10.5，置于65℃恒溫振蕩箱中，交聯(lián)反應(yīng)20小時(shí)。反應(yīng)后，在反應(yīng)液中加入1.0g甘氨酸，繼續(xù)反應(yīng)24小時(shí)以封閉莢膜多糖分子中殘留的活性基團(tuán)。上述反應(yīng)液取出后，放入截留分子量為10000的透析袋中，4℃下用蒸餾水透析48小時(shí)以上以去除游離甘氨酸。
(3)多糖-蛋白交聯(lián)物的分離純化黃桿菌莢膜多糖是中性多糖。采用DEAE纖維素層析柱進(jìn)行分離，可去除殘留的中性多糖。將上述透析后的反應(yīng)液用Na2CO3溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，然后以1倍過(guò)柱液體積/層析柱體積/時(shí)的流速流經(jīng)DEAE纖維素層析柱，游離的BSA以及多糖-蛋白偶聯(lián)物被吸附在層析柱上，而殘留的中性多糖直接流過(guò)層析柱，達(dá)到分離的目的。用3％NaCl溶液將吸附在層析柱上的BSA以及多糖-蛋白交聯(lián)物洗脫。
洗脫下來(lái)的BSA與多糖-蛋白交聯(lián)物的混合物再用凝膠層析柱(saphadexG-100)進(jìn)行分離，利用BSA與多糖-蛋白交聯(lián)物分子量的差異，可獲得黃桿菌莢膜多糖-BSA交聯(lián)物純品。凍干后得干粉純品(61.7mg)。
(4)黃桿菌莢膜多糖-BSA交聯(lián)物的特征分析對(duì)于最終所獲得的黃桿菌莢膜多糖-BSA交聯(lián)物樣品，采用苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量，采用福林酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。所制備的多糖-蛋白交聯(lián)物中，多糖/蛋白比例約為1/3.2(摩爾比)。
采用聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對(duì)BSA、多糖、以及反應(yīng)后的料液進(jìn)行檢測(cè)，并分別進(jìn)行糖染色(schiff法)和蛋白染色(銀染)。銀染檢測(cè)結(jié)果顯示多糖-蛋白交聯(lián)反應(yīng)液在BSA位置未觀察到電泳帶，在BSA位置以上(大于BSA分子量64000Da)的區(qū)域存在片裝(多條)的電泳帶，表明反應(yīng)后BSA已基本以交聯(lián)物形式存在。糖染檢測(cè)結(jié)果顯示純多糖在電泳膠上無(wú)法染出顏色；而多糖-蛋白交聯(lián)反應(yīng)液在BSA位置以上(大于BSA分子量64000Da)的區(qū)域存在片裝的電泳帶，其顯色位置與銀染顯色位置對(duì)應(yīng)，表明反應(yīng)液中有大量與蛋白交聯(lián)的糖類(lèi)物質(zhì)存在，即黃桿菌莢膜多糖-BSA交聯(lián)物。
實(shí)施例3肺炎球菌莢膜多糖與BSA交聯(lián)物的制備(1)肺炎球菌莢膜多糖的活化將100mg肺炎球菌莢膜多糖Pn1-Ps(280KDa)溶于15ml 0.6mol/L的NaOH溶液中，加入2ml 2mg/ml NaBH4溶液，調(diào)節(jié)pH至11.0，混合均勻后加入1.0g交聯(lián)劑(1，4-丁二醇縮水二甘油醚)和300mg表面活性劑TritionX-100，先用超聲波振蕩器劇烈振蕩20分鐘，劇烈振蕩，放入55℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱，活化20小時(shí)。
活化20小時(shí)后的多糖溶液取出放入截留分子量為10000的透析袋中，4℃下對(duì)蒸餾水透析48小時(shí)，去除游離的交聯(lián)試劑。
(2)活化多糖與BSA的交聯(lián)取出透析后的反應(yīng)液，50℃濃縮至18ml。加入50mgBSA，振蕩使之溶解后，采用飽和的Na2CO3溶液調(diào)節(jié)pH至10.5。反應(yīng)液置于50℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中，交聯(lián)反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，再在反應(yīng)液中加入1.3g甘氨酸，55℃繼續(xù)反應(yīng)24小時(shí)以封閉殘留的環(huán)氧活性基團(tuán)。
封閉后的反應(yīng)液取出后，放入截留分子量為10000的透析袋中，4℃下用蒸餾水透析48小時(shí)以上以去除游離的甘氨酸。
(3)多糖-BSA交聯(lián)物的分離純化莢膜多糖Pn1-Ps是酸性多糖。將上述透析后的反應(yīng)液用HCl溶液調(diào)節(jié)pH至2.0，然后以1倍過(guò)柱液體積/層析柱體積/時(shí)的流速流經(jīng)732陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，游離的BSA以及多糖-BSA交聯(lián)物帶正電荷，被吸附在陽(yáng)離子交換樹(shù)脂上，而殘留的酸性多糖直接流過(guò)層析柱，達(dá)到分離的目的。最終用3％NH4OH溶液將吸附在陽(yáng)離子交換樹(shù)脂上的BSA以及多糖-BSA交聯(lián)物洗脫。
洗脫下來(lái)的BSA與多糖-BSA交聯(lián)物的混合物再用凝膠層析柱(saphadexG-100)進(jìn)行分離，獲得莢膜多糖-BSA交聯(lián)物。凍干后得干粉純品(101.5mg)。
(4)莢膜多糖-BSA交聯(lián)物的特征分析對(duì)所制備的莢膜多糖-BSA交聯(lián)物純品，采用苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量，采用福林酚法測(cè)蛋白含量。所制備的多糖-BSA交聯(lián)物中，多糖/蛋白的摩爾比約為1/2.4。
采用聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對(duì)BSA、莢膜多糖、莢膜多糖-BSA交聯(lián)物的樣品進(jìn)行檢測(cè)，分別進(jìn)行糖染色(schiff法)和蛋白染色(銀染)。銀染檢測(cè)結(jié)果顯示多糖-BSA交聯(lián)物樣品在BSA位置未觀察到電泳帶，在BSA位置以上(大于BSA分子量64000Da)的區(qū)域存在片裝的電泳帶，表明所制備的多糖-BSA交聯(lián)物純度較高，殘留的BSA沒(méi)有或很少。糖染檢測(cè)結(jié)果顯示純多糖樣品在電泳膠上無(wú)法染出顏色，多糖-BSA交聯(lián)物樣品在BSA位置以上(大于BSA分子量64000DA)的區(qū)域有片裝的電泳帶，其顯色位置與銀染顯色位置對(duì)應(yīng)，表明存在與蛋白交聯(lián)的糖類(lèi)物質(zhì)，即所制備的莢膜多糖-BSA交聯(lián)物。
采用高效液相色譜(G-5000凝膠柱)，并分別采用紫外或示差檢測(cè)器對(duì)所制備的純品進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BSA約在24.5分鐘出峰(紫外檢測(cè)器)，Pn1-Ps莢膜多糖約在18.5分鐘出峰(示差檢測(cè)器)，而莢膜多糖-BSA交聯(lián)物的出峰時(shí)間在16.2-17.0分種(紫外和示差檢測(cè)器)。莢膜多糖-BSA交聯(lián)物提前出峰，這是由于交聯(lián)物分子量更大的緣故；交聯(lián)物的峰形較為尖銳，表明交聯(lián)物的分子量分布較為集中。
權(quán)利要求
1.一種可溶性的多糖-蛋白交聯(lián)抗原的制備方法，含有將可溶性抗原多糖與蛋白通過(guò)雙功能團(tuán)交聯(lián)試劑共價(jià)連接的化學(xué)合成步驟，其特征在于該步驟采用的雙功能團(tuán)交聯(lián)試劑為(C2H3O)-(CH2)n-(C2H3O)，n＝2-10，(C2H3O)為環(huán)氧基團(tuán)。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的抗原多糖包括來(lái)源于細(xì)菌的莢膜多糖以及來(lái)源于微生物和海藻的多糖，分子量2-50萬(wàn)Da。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的雙功能團(tuán)交聯(lián)試劑為1，4-丁二醇縮水二甘油醚。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的可溶性抗原多糖與雙功能團(tuán)交聯(lián)試劑反應(yīng)過(guò)程中，可溶性抗原多糖與雙功能團(tuán)交聯(lián)試劑的重量配比為1∶1-20，pH9.0-11.0，反應(yīng)溫度20-80℃；抗原多糖與載體蛋白的摩爾比為1/10-10/1；抗原多糖與載體蛋白交聯(lián)反應(yīng)后，需添加過(guò)量的甘氨酸封閉抗原多糖分子中殘留的活性基團(tuán)。
5.如權(quán)利要求1-4所述的制備方法，其特征在于將可溶性抗原多糖與蛋白通過(guò)雙功能團(tuán)交聯(lián)試劑共價(jià)連接過(guò)程中，添加表面活性劑吐溫或SDS或TritionX-100。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，該方法還含有離子交換分離和凝膠柱層析分離結(jié)合的純化步驟，其特征在于當(dāng)抗原多糖為酸性多糖時(shí)，采用732陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離游離的酸性多糖；當(dāng)抗原多糖為中性多糖時(shí)，采用DEAE纖維素分離游離的中性多糖。
全文摘要
一種可溶性的多糖－蛋白交聯(lián)抗原的制備方法，涉及多糖－蛋白交聯(lián)物的化學(xué)合成方法。本方法含有將可溶性抗原多糖與蛋白通過(guò)雙功能團(tuán)交聯(lián)試劑共價(jià)連接的化學(xué)合成步驟，以及離子交換分離和凝膠柱層析分離結(jié)合的純化步驟。采用的雙功能團(tuán)交聯(lián)試劑為(C
文檔編號(hào)C07K1/10GK101024669SQ20061005483
公開(kāi)日2007年8月29日 申請(qǐng)日期2006年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月17日
發(fā)明者郭養(yǎng)浩, 孟春, 石賢愛(ài), 林海英, 王航, 葉林 申請(qǐng)人:福州昌暉生物工程有限公司