專利名稱：鄰苯二甲酸二丙酯人工抗原及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種小分子環(huán)境污染物的免疫檢測及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種新的人工抗原及其制備方法。
背景技術(shù)：
自從1996年3月，美國副總艾爾·戈爾作序，美國學者西奧·科爾伯恩(TheoColborn)博士等著的《Our Stolen Future》一書中首先提出環(huán)境激素(Environmental endocrine disruptors)及其對環(huán)境的影響以來，有關(guān)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物質(zhì)種類及其對人類健康的危害及作用機制等問題已引起學術(shù)界和公眾的極大關(guān)注，也引起了發(fā)達國家政府、WHO等機構(gòu)的高度重視。環(huán)境激素，即指會使人類及生物的內(nèi)分泌系統(tǒng)發(fā)生紊亂的外來物質(zhì)，其具有類似雌激素的作用，主要隨人類生產(chǎn)和生活排放到環(huán)境中。野外調(diào)查和實驗研究表明，環(huán)境激素類物質(zhì)能導致生物與人體的性激素分泌量及活性下降、精子數(shù)量減少、生殖器官異常、癌癥等發(fā)病率增加，并使生殖能力降低，后代的健康與成活率下降等。環(huán)境激素污染使生物與人類的持續(xù)生存和繁衍受到威脅并嚴重地威脅著全球環(huán)境。在世界野生動物基金會(World Wild Animal Foundation，WWF)1997年列出的68種環(huán)境激素中，鄰苯二甲酸酯類(Phthalic Acid Esters，PAEs，也叫酞酸酯)環(huán)境激素占有8種，是其中主要的一大類。鄰苯二甲酸二丙酯也被列入其中。
鄰苯二甲酸二丙酯主要作為增塑劑大量用于塑料、橡膠以及化妝品、香料、印染、涂料等行業(yè)。我國是塑料制品的生產(chǎn)、消費大國，“白色污染”也很普遍。但是，塑料污染的危害在過去長期未被人們重視。近來研究發(fā)現(xiàn)，該類環(huán)境激素物質(zhì)可以通過飲食、呼吸和皮膚透過等途徑被人體吸收，主要危害人體的靶器官是雄性生殖系統(tǒng)。隨著塑料制品的使用規(guī)模不斷擴大，鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素造成環(huán)境影響和對人類健康的慢性和長期效應，日益受到人們的關(guān)注和擔憂。
環(huán)境荷爾蒙物質(zhì)常以ppt濃度甚至ppq濃度存在，這對環(huán)境監(jiān)測分析提出了更高的要求，日本、美國已經(jīng)實施，我國正在起步階段。超微量環(huán)境監(jiān)測技術(shù)的開發(fā)和研究是擺在我國環(huán)境科學工作者面前的重要任務(wù)之一。目前對鄰苯二甲酸類環(huán)境激素的監(jiān)測主要氣相色譜、液相色譜和氣液聯(lián)用等色譜技術(shù)，但由于色譜技術(shù)本身的限制，測定前必須進行衍生化，使得試樣的前處理十分復雜，操作繁瑣，所用的儀器昂貴，要求有熟練的操作人員和較長的分析周期，方法的靈敏度也受到限制，難以適應對環(huán)境激素的檢測和監(jiān)測要求。因此人們迫切希望有一種簡單、快速、靈敏及價廉的檢測技術(shù)能測定鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素污染物，以實現(xiàn)在野外和實驗室內(nèi)進行大批量的篩選實驗，為污染的現(xiàn)狀調(diào)查與分析、毒理性研究、預測發(fā)展趨勢、檢驗污染治理效果等提供有力保障。
免疫分析方法以其特異性和高靈敏的化學發(fā)光、熒光等技術(shù)結(jié)合建立相應的熒光免疫和化學發(fā)光免疫等方法可以滿足此項要求。
1958年Berson S.A和Yellow創(chuàng)立了放射免疫分析(RIA)，其標記技術(shù)是將同位素分析的高靈敏度與抗原抗體反應的特異性相結(jié)合，以放射性同位素作為示蹤物的標記免疫測定方法。后來逐漸發(fā)展的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、熒光免疫分析、化學發(fā)光免疫分析等已在醫(yī)學及其他生物學科的研究領(lǐng)域和臨床實驗診斷中廣泛應用于各種微量蛋白質(zhì)、激素、小分子藥物及腫瘤標志物等的分析與定量測定。但由于人們對鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素的危害認識較晚，免疫分析方法應用于鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素的監(jiān)測研究也起步較晚。
第一個鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素免疫分析的報道是1993年Ius A.等人制備的抗鄰苯二甲酸二甲酯抗體，通過抗原抗體反應證明了鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸丁芐酯及鄰苯二甲酸二辛酯總量測定的可能性。2000年Goda Y等人提出了用ELISA測定鄰苯二甲酸酯總量的方法。2002年美國專利US 6,399,318公開了制備鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸丁芐酯及鄰苯二甲酸環(huán)己二酯等抗原、抗體的方法和ELISA測定鄰苯二甲酸二乙酯的方法。但文獻沒有涉及鄰苯二甲酸二丙酯的半抗原衍生物、全抗原及免疫分析的報道。
由于鄰苯二甲酸二丙酯是小分子物質(zhì)，其具有反應特異性，但不具有免疫原性。要制備相應的抗體必須先得到保留其抗原決定簇的人工抗原。本發(fā)明即是基于以上考慮而設(shè)計的一種新的鄰苯二甲酸二丙酯人工抗原，并提供容易而方便的制備方法。
參考文獻(1)Ius A，Bacigalupo MA，Meroni G，Pistillo A，Roda A.Development ofa time-resolved fluoroimmunoassay for phthalate esters in water.Fresenius’J Anal Chem.1993，345，589-591.
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為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案之一為一種鄰苯二甲酸二丙酯的人工抗原，它是由式(II)表示的半抗原衍生物在低溫下與NaNO2和濃HCl發(fā)生重氮化反應，生成相應的重氮鹽；重氮鹽與載體蛋白發(fā)生偶聯(lián)反應得到的，其結(jié)構(gòu)用下式(I)表示 其中，式(II)表示的半抗原衍生物是這樣制得的 4-硝基鄰苯二甲酸二丙酯(IV)的合成(步驟A)將式(III)表示的4-硝基鄰苯二甲酸中加入正丙醇，二者的物質(zhì)的量比為1∶6，攪拌條件下加入濃H2SO4催化，4-硝基鄰苯二甲酸與濃H2SO4的物質(zhì)的量的比為1∶0.6，110℃攪拌回流7小時后，蒸餾除去未反應的丙醇和生成的水。趁熱倒入冰水中，油狀粗品用10％Na2CO3洗滌至水層呈無色(pH＝7～8)后，用無水乙醇重結(jié)晶得黃色油狀液體，產(chǎn)率Y＝88％。
UVλ1＝214nm，λ2＝258nm。
IR(KBr，υ)1529，1357(-NO2)，1735(C＝O)，1281，1128(C-O-C)，2968(-CH3)，2875(-CH3)，1430(δ-OCH2-)，1611(C＝C)cm-1。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.56(d，1H，ArH)，8.35(dd，1H，ArH)7.82(d，1H，ArH)，4.30(t，2H，OCH2CH2CH3)，4.26(t，2H，OCH2CH2CH3)，1.82-1.77(m，2H，2H，OCH2CH2CH3)，1.75-1.69(m，2H，2H，OCH2CH2CH3)，100-0.98(t，3H，OCH2CH2CH3)，0.97-0.94(t，3H，OCH2CH2CH3)ppm。
4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯(II)的合成(步驟B)將4-硝基鄰苯二甲酸二丙酯溶入苯中，加入純鋅粉，4-硝基鄰苯二甲酸二丙酯(IV)與純鋅粉的物質(zhì)的量比為1∶6。分次加入濃HCl，4-硝基鄰苯二甲酸二丙酯(IV)與所加濃HCl的物質(zhì)的量比為1∶20，室溫攪拌15分鐘后，再次加入純鋅粉，4-硝基鄰苯二甲酸二丙酯(IV)與純鋅粉的物質(zhì)的量比為1∶6，室溫攪拌12小時。向反應體系中加入冷水，并用1mol·L-1NaOH溶液中和至堿性，分離出苯層，水層用苯再萃取。合并萃取液，水洗后用無水Na2SO4干燥。蒸餾除去苯，得淺黃色固體，無水乙醇重結(jié)晶，得淡黃色晶體，即是式(II)表示的半抗原衍生物。產(chǎn)率80％。熔點87-88℃。
UVλ1＝226nm，λ2＝288nm；IR(KBr，υ)3462，3371(-NH2)，1698(C＝O)，1275，1139(C-O-C)，2973，2884(-CH3)，1446(δ-OCH2-)，1626(C＝C，Ar)cm-1；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.60(d，1H，ArH)，6.59(dd，1H，ArH)，6.54(d，1H，ArH)，4.13(q，2H，OCH2CH2CH3)，4.07(q，2H，OCH2CH2CH3)，3.99(b，2H，NH2)，1.69-1.62(m，2H，2H，OCH2CH2CH3)，1.60-1.55(m，2H，2H，OCH2CH2CH3)，0.87(t，6H，OCH2CH2CH3)ppm。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案之二為一種如權(quán)利要求1所述的人工抗原的合成方法，包括如下步驟(A)式(II)表示的半抗原衍生物在低溫下與NaNO2和濃HCl發(fā)生重氮化反應，生成相應的重氮鹽；(B)重氮鹽與載體蛋白發(fā)生偶聯(lián)反應，得到所述的人工抗原。
作為優(yōu)選的技術(shù)方案步驟(A)中將4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯與濃HCl和H2O混合，4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯與濃HCl的物質(zhì)的量的比為1∶2～6，濃HCl與H2O的體積比為1∶25～80；在60～95℃加熱溶解后，置冰浴中冷至5℃；再滴入NaNO2的水溶液，4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯與NaNO2的物質(zhì)的量的比為1∶1.0～1.8，NaNO2與H2O的質(zhì)量比為1∶50～300；反應0.5～3小時后，加少量尿素除去未反應的NaNO2，得到重氮鹽。
步驟(A)中4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯與濃HCl的物質(zhì)的量的比優(yōu)選為1∶2.5～4，濃HCl與H2O的體積比為1∶30～45；加熱的溫度為80～90℃；4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯與NaNO2的物質(zhì)的量的比為1∶1.0～1.4，NaNO2與H2O的質(zhì)量比為1∶70～200，反應時間為0.5～1小時。
步驟(B)中將載體蛋白的緩沖溶液逐滴加入所述的重氮鹽中，載體蛋白與4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯的物質(zhì)的量的比為1∶30～80，載體蛋白的質(zhì)量與緩沖溶液的體積比為3.0×10-3～8.0×10-3(g/mL)，同時用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值，NaOH溶液的濃度為0.1～2.0mol·L-1，直至有橙紅色溶液出現(xiàn)，控制pH值為8.5～9.5，繼續(xù)反應1.5～4小時，得到人工抗原粗品；將反應液裝入透析袋，置蒸餾水中透析后，將獲得的產(chǎn)品冷凍干燥，分裝凍存。
所述的載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA)、雞卵清蛋白(OVA)或匙孔血藍蛋白(KLH)。載體蛋白與4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯的物質(zhì)的量的比為1∶30～80，優(yōu)選1∶40～65。
溶解載體蛋白的緩沖溶液為硼酸鹽、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、碳酸鹽或巴比妥，優(yōu)選硼酸鹽或三羥甲基氨基甲烷(Tris)。
緩沖溶液的pH值為8.5～10.5，優(yōu)選9.1～9.5。載體蛋白的質(zhì)量與緩沖溶液的體積比為3.0×10-3～8.0×10-3(g/mL)，優(yōu)選3.0×10-3～8.0×10-3(g/mL)。
透析蒸餾水優(yōu)選中性蒸餾水。
本發(fā)明利用合成的4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯作半抗原，經(jīng)過步驟(A)生成相應的重氮鹽，再經(jīng)過步驟(B)與載體蛋白發(fā)生重氮化反應，進而與載體蛋白偶聯(lián)。反應過程如下 本發(fā)明的有益效果是提供新的鄰苯二甲酸二丙酯人工抗原，其用于制備鄰苯二甲酸二丙酯抗體；本發(fā)明還提供一種鄰苯二甲酸二丙酯人工抗原的簡易而方便的制備方法。
上述抗原用常規(guī)免疫方案即可制備得到特異性識別鄰苯二甲酸二丙酯的抗體。本發(fā)明具有以下優(yōu)點和積極效果(1)抗原實用性強鄰苯二甲酸二丙酯的抗原制備和抗體制備技術(shù)具有重要的使用價值和實際意義。利用保留其抗原決定簇的鄰苯二甲酸二丙酯類似結(jié)構(gòu)，用上述方法有效地制備鄰苯二甲酸二丙酯人工抗原，并用此抗原生產(chǎn)出特異性好、效價高的抗體，為免疫測定鄰苯二甲酸二丙酯提供保障，也為環(huán)境激素鄰苯二甲酸二丙酯快速檢測試劑盒的研制解決了一個技術(shù)難點。
(2)抗原穩(wěn)定性好此法合成的鄰苯二甲酸二丙酯人工抗原具有較好的穩(wěn)定性，在4℃環(huán)境下可保存7個月不變性，-20℃冰箱中至少可保存2年。
(3)抗原制備技術(shù)簡便可行抗原的整個制備過程無需特別的儀器設(shè)備，成本低廉，容易工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細闡述。
實施例1將4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯與濃HCl和H2O混合，4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯與濃HCl的物質(zhì)的量的比為1∶2.5，濃HCl與H2O的體積比為1∶30，加熱80℃溶解后，置冰浴中冷至5℃，低溫攪拌下，滴入NaNO2的水溶液，4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯與NaNO2的物質(zhì)的量的比為1∶1.0，NaNO2與H2O的質(zhì)量比為1∶80。繼續(xù)反應0.5小時，加少量尿素除去未反應的NaNO2。將牛血清白蛋白(BSA)的硼酸鈉緩沖溶液(pH＝9.20)逐滴加入上述重氮鹽中，BSA與4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯的物質(zhì)的量的比為1∶50，硼酸鈉載體蛋白的質(zhì)量與緩沖溶液的體積比為4.0×10-3，同時用0.5mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值，直至有橙紅色溶液出現(xiàn)，繼續(xù)反應2小時，得抗原粗品。將反應液裝入透析袋，置中性蒸餾水透析5天，每天換水2次，將獲得的橙紅色產(chǎn)品冷凍干燥，分裝凍存。
實施例2將4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯與濃HCl和H2O混合，4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯與濃HCl的物質(zhì)的量的比為1∶2，濃HCl與H2O的體積比為1∶25，加熱60℃溶解后，置冰浴中冷至5℃，低溫攪拌下，滴入NaNO2的水溶液，4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯與NaNO2的物質(zhì)的量的比為1∶1.4，NaNO2與H2O的質(zhì)量比為1∶50。繼續(xù)反應0.5小時，加少量尿素除去未反應的NaNO2。將牛血清白蛋白(BSA)的三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖溶液(pH＝9.0)逐滴加入上述重氮鹽中，BSA與4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯的物質(zhì)的量的比為1∶30，Tris載體蛋白的質(zhì)量與緩沖溶液的體積比為3.0×10-3，同時用1.0mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值，直至有橙紅色溶液出現(xiàn)，繼續(xù)反應2小時，得抗原粗品。將反應液裝入透析袋，置中性蒸餾水透析5天，每天換水2次，將獲得的橙紅色產(chǎn)品冷凍干燥，分裝凍存。
實施例3將4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯與濃HCl和H2O混合，4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯與濃HCl的物質(zhì)的量的比為1∶6，濃HCl與H2O的體積比為1∶60，加熱95℃溶解后，置冰浴中冷至5℃，低溫攪拌下，滴入NaNO2的水溶液，4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯與NaNO2的物質(zhì)的量的比為1∶1.8，NaNO2與H2O的質(zhì)量比為1∶200。繼續(xù)反應0.5小時，加少量尿素除去未反應的NaNO2。將雞卵清蛋白(OVA)的硼酸鈉緩沖溶液(pH＝9.20)逐滴加入上述重氮鹽中，OVA與4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯的物質(zhì)的量的比為1∶80，硼酸鈉載體蛋白的質(zhì)量與緩沖溶液的體積比為5.0×10-3，同時用2.0mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值，直至有橙紅色溶液出現(xiàn)，繼續(xù)反應2小時，得抗原粗品。將反應液裝入透析袋，置中性蒸餾水透析5天，每天換水2次，將獲得的橙紅色產(chǎn)品冷凍干燥，分裝凍存。
實施例4將4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯與濃HCl和H2O混合，4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯與濃HCl的物質(zhì)的量的比為1∶3，濃HCl與H2O的體積比為1∶30，加熱90℃溶解后，置冰浴中冷至5℃，低溫攪拌下，滴入NaNO2的水溶液，4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯與NaNO2的物質(zhì)的量的比為1∶1.0，NaNO2與H2O的質(zhì)量比為1∶80。繼續(xù)反應1.0小時，加少量尿素除去未反應的NaNO2。將匙孔血藍蛋白(KLH)的硼酸鈉緩沖溶液(pH＝9.20)逐滴加入上述重氮鹽中，KLH與4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯的物質(zhì)的量的比為1∶50，硼酸鈉載體蛋白的質(zhì)量與緩沖溶液的體積比為4.0×10-3，同時用0.5mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值，直至有橙紅色溶液出現(xiàn)，繼續(xù)反應2小時，得抗原粗品。將反應液裝入透析袋，置中性蒸餾水透析5天，每天換水2次，將獲得的橙紅色產(chǎn)品冷凍干燥，分裝凍存。
權(quán)利要求
1.一種鄰苯二甲酸二丙酯的人工抗原，其特征在于它是由式(II)表示的半抗原衍生物在低溫下與NaNO2和濃HCl發(fā)生重氮化反應，生成相應的重氮鹽；重氮鹽與載體蛋白發(fā)生偶聯(lián)反應得到的，其結(jié)構(gòu)用下式(I)表示
2.一種如權(quán)利要求1所述的人工抗原的合成方法，其特征在于包括如下步驟(A)式(II)表示的半抗原衍生物在低溫下與NaNO2和濃HCl發(fā)生重氮化反應，生成相應的重氮鹽；(B)重氮鹽與載體蛋白發(fā)生偶聯(lián)反應，得到所述的人工抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成方法，其特征在于步驟(A)中將4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯與濃HCl和H2O混合，4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯與濃HCl的物質(zhì)的量的比為1∶2～6，濃HCl與H2O的體積比為1∶25～80；在60～95℃加熱溶解后，置冰浴中冷至5℃；再滴入NaNO2的水溶液，4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯與NaNO2的物質(zhì)的量的比為1∶1.0～1.8，NaNO2與H2O的質(zhì)量比為1∶50～300；反應0.5～3小時后，加少量尿素除去未反應的NaNO2，得到重氮鹽。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的合成方法，其特征在于步驟(A)中4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯與濃HCl的物質(zhì)的量的比優(yōu)選為1∶2.5～4；加熱的溫度為80～90℃；4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯與NaNO2水溶液的物質(zhì)的量的比為l∶1.0～1.4，NaNO2與H2O的質(zhì)量比為1∶70～200，反應時間為0.5～1小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成方法，其特征在于步驟(B)中將載體蛋白的緩沖溶液逐滴加入所述的重氮鹽中，載體蛋白與4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯的物質(zhì)的量的比為1∶30～80，緩沖溶液的體積與載體蛋白的質(zhì)量比為1∶3～8，同時用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值，NaOH溶液的濃度為0.1～2.0mol·L-1，直至有橙紅色溶液出現(xiàn)，控制pH值為8.5～9.5，繼續(xù)反應1.5～4h，得到人工抗原粗品；將反應液裝入透析袋，置蒸餾水中透析后，將獲得的產(chǎn)品冷凍干燥，分裝凍存。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的合成方法，其特征在于所述的載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清蛋白或匙孔血藍蛋白；載體蛋白與4-氨基鄰苯二甲酸二丙酯的物質(zhì)的量的比為1∶30～80，優(yōu)選1∶40～65。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的合成方法，其特征在于溶解載體蛋白的緩沖溶液為硼酸鹽、三羥甲基氨基甲烷、碳酸鹽或巴比妥，優(yōu)選硼酸鹽或三羥甲基氨基甲烷；緩沖溶液的pH值為8.5～10.5，優(yōu)選9.1～9.5；載體蛋白的質(zhì)量與緩沖溶液的體積比為3.0×10-3～8.0×10-3(g/mL)，優(yōu)選4.0×10-3～6.0×10-3(g/mL)。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的合成方法，其特征在于透析蒸餾水優(yōu)選中性蒸餾水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鄰苯二甲酸二丙酯的人工抗原，它是由式(II)表示的半抗原衍生物在低溫下與NaNO
文檔編號C07K16/44GK1763103SQ20051003001
公開日2006年4月26日 申請日期2005年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月27日
發(fā)明者莊惠生, 張明翠 申請人:東華大學