專利名稱：橫向電場提高離子交換吸附劑動態(tài)吸附容量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用交變電場作用提高蛋白質(zhì)等生物大分子在離子交換吸附劑上的動態(tài)吸附容量的方法，屬于生物產(chǎn)品加工與分離技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前，在生物下游產(chǎn)品加工過程中，層析分離具有其它分離手段無法替代的地位。但大多數(shù)層析介質(zhì)的孔徑均在納米數(shù)量級，蛋白質(zhì)在上述介質(zhì)中的傳質(zhì)系數(shù)比小分子物質(zhì)低2-3個數(shù)量級，嚴重影響了生物大分子在層析介質(zhì)內(nèi)的傳質(zhì)。因此，強化介質(zhì)的內(nèi)部傳質(zhì)、提高其處理生物大分子的分離效率是層析分離技術(shù)急待解決的問題之一。
目前，解決上述問題的思路主要有兩種第一，減小介質(zhì)的粒徑。它主要著眼于減小層析介質(zhì)粒徑、縮短傳質(zhì)路徑來提高傳質(zhì)效率。由于采用了小粒徑的介質(zhì)，因此操作過程中層析柱的背壓增大，對介質(zhì)的機械強度提出了更高的要求。該方法目前主要用于分析規(guī)模的色譜實驗。
第二，開發(fā)大孔介質(zhì)。在層析介質(zhì)制備過程中加入某種致孔劑，在生成納米級擴散孔的同時，形成一定量微米級的流通孔。溶液在流通孔中以對流形式流動而在擴散孔中則以擴散方式傳遞?？變?nèi)對流流動仍需要很大的外壓，且大孔介質(zhì)對于傳質(zhì)過程的強化必將犧牲一定的吸附容量。
最近，隨著毛細管電色譜理論和應用的深入發(fā)展，人們的注意力也開始轉(zhuǎn)入利用電滲等電動現(xiàn)象來加快傳質(zhì)過程及提高分離效率上。因此，在常規(guī)色譜中引入外電場，利用電動現(xiàn)象(電滲、電泳)強化介質(zhì)顆粒間/顆?？變?nèi)傳質(zhì)逐漸成為第三種思路。電滲現(xiàn)象源于固體和液體接界電位差，是電場中液體相對于帶電表面移動的現(xiàn)象。在外電場作用下，含有電解質(zhì)的溶液相對于帶電靜止相的運動稱為電滲流(EOF)，采用電滲流推動溶液移動的毛細管電色譜是目前分析色譜研究中的一大熱點。電滲流的產(chǎn)生和雙電層有關(guān)，對于1∶1型電解質(zhì)水溶液，當其濃度分別為1、100mmol/L時，雙電層的厚度分別為10、1nm。因此在普通液相色譜研究條件下，除介質(zhì)顆粒間產(chǎn)生電滲流外，介質(zhì)的孔內(nèi)也可能產(chǎn)生電滲流。利用電滲流作為推動力，當孔道半徑遠大于雙電層厚度時(一般情況下大于20即可)，EOF速率和孔道尺寸無關(guān)，也不存在反壓力。已有的理論研究也表明，在壓力驅(qū)動色譜中，隨色譜介質(zhì)孔徑的減小，孔內(nèi)對流傳質(zhì)的貢獻迅速下降，而對于電滲流，只要孔徑遠大于雙電層厚度，則電滲流與孔徑無關(guān)。因此，采用電動傳遞強化傳質(zhì)將是發(fā)展大規(guī)模高效液相色譜的一條很有希望的途徑。
已有制備型電色譜技術(shù)中有一種多通道流動電泳設備，該設備由清華大學的劉錚等提出(交變電場下離子交換色譜分離過程，化工學報，2001，52311-315)。其核心設備是一種五腔室的電泳槽，中間腔室裝陰離子交換劑DEAE-Sepharose FF，其兩側(cè)分別是進樣腔室與出樣腔室，中間腔室與進樣和出樣腔室之間由尼龍濾網(wǎng)隔開。最兩端的是正、負電極腔室，它們與進樣、出樣腔室之間用凝膠膜隔開，交變電場施加在電極腔室中的鉑金電極上。實驗時，將牛血清白蛋白(BSA)樣品液泵入進樣室，將不含BSA的緩沖溶液泵入電極室，從電極室流出的電極液回電極液儲瓶，經(jīng)脫氣后供循環(huán)使用。BSA樣品液全部穿過介質(zhì)層進入出樣室，由出樣室的出口流出并進入部分自動收集器。吸附結(jié)束后，依次通入清洗液和洗脫液進行淋洗和洗脫，洗脫過程結(jié)束后，通入再生液對床層進行再生。由此可見，這也是一種軸向電場電色譜，流動相和電場均同向穿過中間的填料室。作者利用該設備考察了交變電場對牛血清白蛋白在DEAE-Sepharose FF上的動態(tài)吸附行為。研究結(jié)果表明，外加電場在顆粒間和介質(zhì)孔內(nèi)所產(chǎn)生的電滲流可加速蛋白質(zhì)和色譜填料間的傳遞過程，顯著提高色譜填充床的動態(tài)吸附容量。但該設備結(jié)構(gòu)較復雜，腔室較多。中間裝填料的腔室很薄，如果增大該腔室將導致兩電極間距離的增大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用交變電場作用提高蛋白質(zhì)等生物大分子在離子交換吸附劑上的動態(tài)吸附容量的方法，它是將橫向電場與色譜分離相結(jié)合，利用電動現(xiàn)象(電滲、電泳)來強化介質(zhì)顆粒間/孔內(nèi)傳質(zhì)而達到上述目的。
本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案加以實現(xiàn)的。一種利用交變電場作用提高蛋白質(zhì)等生物大分子在離子交換吸附中吸附容量的方法，所述的制備型橫向電場電色譜分離設備，其中橫向電場是指電場方向與液體流動方向垂直，電色譜包括凝膠室和兩側(cè)的電極室構(gòu)成，凝膠室是兩側(cè)有對稱的槽溝、槽溝內(nèi)平臺上有密封凹槽和中間為長方形中空的有機玻璃體；槽溝內(nèi)設置具有截留分子量大于1000道爾頓的、可自由通過導電離子的膜板；在凝膠室外兩側(cè)各有一個電極室；電極室內(nèi)壁固定惰性鉑電極；電極室與凝膠室中充有包括乙酸鹽、磷酸鹽、碳酸氫鹽或三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液；采用該設備分離生物大分子的方法，其特征在于，包括以下過程配制含有0-100mmol/L氯化鈉的1.0-20mmol/L乙酸鹽、磷酸鹽、碳酸氫鹽或三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液為流動相和電極液，流動相使用前經(jīng)0.45μm超濾膜和超聲處理；生物大分子溶于流動相中制備成濃度為0.1-100mg/ml的溶液；凝膠室和兩側(cè)的電極室用流動相平衡后，將帶有季胺鹽、磺酸基、二乙基乙二胺基修飾基團的離子交換吸附劑按重力填充的方法填充到電色譜柱的凝膠室；流動相流速為10-200cm/h，溫度為2-25℃；在凝膠室兩側(cè)施加電極電壓為1-600伏、電流交變周期為2-200秒的等周期交變電場，電極液流速為20-400cm/h，溫度為4-25℃；待系統(tǒng)穩(wěn)定后，待分離樣品以迎頭方式進樣，色譜柱流出液經(jīng)檢測器檢測；當出口處樣品穿透達到進樣濃度2-80％后；改用流動相緩沖液沖洗色譜柱以除去未吸附的蛋白質(zhì)；切斷電源，改用線性梯度洗脫法洗脫色譜柱，洗脫體積為2-20個柱體積；上述吸附和洗脫可交替連續(xù)進行。
上述的優(yōu)化條件配制含有5-50mmol/L氯化鈉的2.0-15mmol/L乙酸鹽、磷酸鹽、碳酸氫鹽或三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液為流動相和電極液；生物大分子溶于流動相中制備成濃度為0-5-50mg/ml的溶液；凝膠室和兩側(cè)的電極室用流動相平衡后，將離子交換吸附劑按重力填充的方法填充到電色譜柱的凝膠室；流動相流速為20-70cm/h，溫度為4-15℃；在凝膠室兩側(cè)施加電極電壓為5-300伏、電流交變周期為4-120秒的等周期交變電場，電極液流速為40-300cm/h，溫度為5-15℃；當出口處樣品穿透達到進樣濃度5-40％后停止進樣；洗脫色譜柱所用洗脫體積為5-15個柱體積。
下面對本發(fā)明進行詳細說明本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)有八點一是色譜中橫向交變電場的引入，采用了一種三腔室的矩形色譜柱，中間裝填料的填料室和兩側(cè)的電極室，填料室和電極室之間由平面膜板來隔離，電極室內(nèi)設置電極，電極和外電源相連，填料室內(nèi)便產(chǎn)生了橫向電場。關(guān)鍵技術(shù)之二是膜板為具有一定分子截留能力的親水性膜板，其主要作用是阻止生物大分子進入兩側(cè)的電極室而導電離子可自由通過，膜板的厚度和其內(nèi)部的焦耳熱有關(guān)，膜板越薄焦耳熱越小，但膜板也需要有一定厚度(或需一定厚度的支撐板)來滿足流動相的液壓和本身機械強度的要求。關(guān)鍵技術(shù)之三是等周期交變電場的應用，用等周期來解決生物大分子在隔離膜板處的堆積，同時也解決了軸向電場電色譜中由于電場的持續(xù)應用而引起的諸多問題；周期的大小又是影響蛋白質(zhì)的橫向電動遷移和傳質(zhì)速率的重要因素。關(guān)鍵技術(shù)之四是緩沖液為常規(guī)的色譜緩沖液，緩沖液的離子強度為0.5-100mmol/L，過大的離子強度將壓縮雙電層厚度而導致電動傳遞的銳減。關(guān)鍵技術(shù)之五是為了保證操作過程中色譜柱內(nèi)緩沖液的電導率和pH的穩(wěn)定，電極液與緩沖液組成相同。關(guān)鍵技術(shù)之六是緩沖液和電極液的溫度必須具有一定減緩填料室及電極室內(nèi)焦耳熱效應的能力。關(guān)鍵技術(shù)之七是緩沖液和電極液流速的選擇除應滿足分離效率和填料承載能力的要求外，還要滿足消除填料室及電極室內(nèi)焦耳熱的要求。關(guān)鍵技術(shù)之八是電壓的選擇，電壓的大小直接影響蛋白質(zhì)的橫向電動傳遞、傳質(zhì)速率和填料室及電極室內(nèi)焦耳熱效應。
由于在電極上施加一與填料室中液流方向相垂直的電場，所以在這種形式電色譜中，在色譜柱的軸向，液相由壓力驅(qū)動；在橫向上，溶質(zhì)受橫向電動傳遞的影響。圖1給出了交變電場的應用方位及荷電溶質(zhì)遷移示意圖。在電色譜柱的橫向，在外電場作用下有三個主要的傳質(zhì)過程電滲流、蛋白質(zhì)電泳和蛋白質(zhì)的分子擴散。由于電滲流和電泳速度都隨電場強度的增大而增大，因此吸附介質(zhì)的局部質(zhì)量通量也將隨電場強度的增大而增大，所以通過調(diào)節(jié)電場強度的大小可以有效提高傳質(zhì)過程。另外，在介質(zhì)孔內(nèi)和介質(zhì)表面產(chǎn)生的電滲流也可以通過減少滯流區(qū)和增大有效接觸表面積而增大蛋白質(zhì)的吸附容量。
本發(fā)明所采用的橫向電場來增大吸附容量的方法具有的優(yōu)點是填料為常規(guī)的色譜填料，價格便宜；由于主要采用電動傳遞來提高吸附容量，色譜的操作壓力沒有要求，對設備的承壓能力要求較低；該方法由于采用了這種三腔室的矩形色譜柱結(jié)構(gòu)，并且填料室和兩側(cè)的電極室由親水性薄膜來隔離，故電極室內(nèi)產(chǎn)生的電解氣可穩(wěn)定地被循環(huán)的電極液帶走，填料室內(nèi)產(chǎn)生的焦耳熱又可被軸向壓力驅(qū)動的、冷卻的流動相帶走，從而很好地解決了電色譜中的焦耳熱和電解氣問題；電動傳遞過程依賴于電場強度，可以通過調(diào)節(jié)電場強度來達到提高傳質(zhì)過程。在色譜操作條件下，表面帶電荷的吸附劑都可以采用這種方法，如離子交換介質(zhì)、親和吸附介質(zhì)等。相對不加電場情況，在較低的電場強度下(＜20V/cm)吸附容量即可提高2～5倍，能滿足多種吸附分離要求，在蛋白質(zhì)等生物大分子的分離、純化等方面具有廣泛的應用前景。


圖1給出了本發(fā)明工作流程示意圖。。
圖2給出了牛血清白蛋白在DEAE-Sepharose FF上有、無電場時的歸一化動態(tài)吸附曲線。其中電色譜柱尺寸為1.5×0.5×1.2cm，上樣緩沖液為3.9mmol/L三羥甲基氨基甲烷-47mmol/L甘氨酸(pH8.2)含5.0mmol/L氯化鈉，流速80cm/h，填料層電場強度如圖上所示，電流循環(huán)周期為20秒，牛血清白蛋白料液濃度為2mg/mL。
具體實施例方式
下面的實例將對本發(fā)明予以進一步的說明。
實施例1不同電場強度下牛血清白蛋白在DEAE-Sepharose FF上的動態(tài)吸附曲線電色譜填料室的尺寸為(長×寬×深)1.5×0.5×1.2cm，平衡緩沖液是含5.0mmol/L氯化鈉的3.9mmol/L三羥甲基氨基甲烷-47mmol/L甘氨酸緩沖液(pH8.2)。洗脫液和再生液分別為含0.5和1.0mol/L氯化鈉的3.9mmol/L三羥甲基氨基甲烷-47mmol/L甘氨酸緩沖液(pH8.2)。BSA樣品溶液的濃度為2.0mg/mL。實驗過程中，電極液由冷卻器冷卻在6℃，流動相則由冰水混合物冷卻。
采用重力沉降法將預平衡的DEAE-Sepharose FF裝入填料室。在上樣之前，填料室先用平衡緩沖液平衡直到UV(280nm)吸收值穩(wěn)定在基線附近。然后，在凝膠柱兩側(cè)加上交變電場，并以恒定流速加入預冷卻的BSA樣品液。出口處蛋白質(zhì)的濃度由在線UV檢測，當出口UV吸收值達到進樣蛋白質(zhì)UV的70％，停止上樣。改用平衡緩沖液沖洗色譜柱以除去未吸附的BSA，出口UV吸收值會逐漸下降并接近基線，這時停止電源供應。然后，改用線性梯度洗脫法洗脫色譜柱，洗脫體積為15個柱體積。最后，用再生液再生填料，再生后用平衡緩沖液平衡系統(tǒng)，準備下一次穿透實驗。其他實驗條件如附圖2說明中所述，結(jié)果如圖2所示，電場下的動態(tài)吸附容量顯著提高(3～5倍)。
實施例2利用DEAE-Sepharose FF分離牛血清白蛋白和免疫球蛋白G混合物電色譜填料室的尺寸為(長×寬×深)3.0×0.5×1.2cm，平衡緩沖液是含5.0mmol/L氯化鈉的3.9mmol/L三羥甲基氨基甲烷-47mmol/L甘氨酸緩沖液(pH8.2)；洗脫液和再生液分別為含0.5和1.0mol/L氯化鈉的3.9mmol/L三羥甲基氨基甲烷-47mmol/L甘氨酸緩沖液(pH8.2)?？倽舛葹?.0mg/mL的蛋白質(zhì)混合物是由等體積、濃度均為2.0mg/L的牛血清白蛋白和免疫球蛋白G樣品液混合而成。實驗過程中，電極液由冷卻器冷卻在6℃，流動相則由冰水混合物冷卻。
采用重力沉降法將預平衡的填料(DEAE-Sepharose FF)裝入中心室。電極電壓為75伏，電流變化周期20秒。色譜柱由平衡緩沖液平衡后，打開電源在色譜柱的橫向施加交變電場。然后，以流速160cm/h的速度加入預冷卻的蛋白質(zhì)混合物32mL，改用平衡緩沖液沖洗色譜柱以除去未吸附的蛋白質(zhì)。出口UV吸收值會逐漸下降并接近基線，這時停止電源供應。然后切換到洗脫液，以線性梯度洗脫，洗脫體積為13.3個柱體積。收集到的餾分由SDS-PAGE來分析。實驗結(jié)果在超載情況下，得到電泳純的牛血清白蛋白和免疫球蛋白G產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1.一種橫向電場提高離子交換吸附劑動態(tài)吸附容量的方法，所述的制備型橫向電場電色譜分離設備，其中橫向電場是指電場方向與液體流動方向垂直，電色譜包括凝膠室和兩側(cè)的電極室構(gòu)成，凝膠室是兩側(cè)有對稱的槽溝、槽溝內(nèi)平臺上有密封凹槽和中間為長方形中空的有機玻璃體；槽溝內(nèi)設置具有截留分子量大于1000道爾頓的、可自由通過導電離子的膜板；在凝膠室外兩側(cè)各有一個電極室；電極室內(nèi)壁固定惰性鉑電極；電極室與凝膠室中充有包括乙酸鹽、磷酸鹽、碳酸氫鹽或三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液；采用該設備分離生物大分子的方法，其特征在于，包括以下過程配制含有0-100mmol/L氯化鈉的1.0-20mmol/L乙酸鹽、磷酸鹽、碳酸氫鹽或三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液為流動相和電極液，流動相使用前經(jīng)0.45μm超濾膜和超聲處理；生物大分子溶于流動相中制備成濃度為0.1-100mg/ml的溶液；凝膠室和兩側(cè)的電極室用流動相平衡后，將帶有季胺鹽、磺酸基或二乙基乙二胺基修飾基團的離子交換吸附劑按重力填充的方法填充到電色譜柱的凝膠室；流動相流速為10-200cm/h，溫度為2-25℃；在凝膠室兩側(cè)施加電極電壓為1-600伏、電流交變周期為2-200秒的等周期交變電場，電極液流速為20-400cm/h，溫度為4-25℃；待系統(tǒng)穩(wěn)定后，待分離樣品以迎頭方式進樣，色譜柱流出液經(jīng)檢測器檢測；當出口處樣品穿透達到進樣濃度2-80％后；改用流動相緩沖液沖洗色譜柱以除去未吸附的蛋白質(zhì)；切斷電源，改用線性梯度洗脫法洗脫色譜柱，洗脫體積為2-20個柱體積；吸附和洗脫過程可交替連續(xù)進行。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的色譜分離方法，其特征在于流動相和電極液為含有5-50mmol/L氯化鈉的濃度為2.0-15mmol/L緩沖液；生物大分子溶于流動相中制備成濃度為0.5-50mg/ml的溶液；流動相流速為20-70cm/h，溫度為4-15℃；在凝膠室兩側(cè)施加電極電壓為5-300伏、電流交變周期為4-120秒的等周期交變電場，電極液流速為40-300cm/h，溫度為5-15℃。當出口處樣品穿透達到進樣濃度5-40％后停止進樣；洗脫色譜柱所用洗脫體積為5-15個柱體積。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用交變電場作用提高蛋白質(zhì)等生物大分子在離子交換吸附劑上的動態(tài)吸附容量的方法，所述的制備型電色譜分離設備包括凝膠室和兩側(cè)的電極室構(gòu)成；采用該設備分離生物大分子的方法，其特征在于，配制乙酸鹽、磷酸鹽、碳酸氫鹽或三羥甲基氨基甲烷－鹽酸緩沖液為流動相；流動相流速為10－200cm/h，溫度為2－25℃；在凝膠室兩側(cè)施加電極電壓為1－600伏、電流交變周期為2－200秒的等周期交變電場，電極液流速為20－400cm/h，溫度為4－25℃；樣品溶液用迎頭方式進樣；穿透達到進樣濃度2－80％后停止進樣；蛋白質(zhì)用2－20個柱體積洗脫液洗脫。本發(fā)明的方法具有操作方便、設備結(jié)構(gòu)簡單、適用范圍廣等優(yōu)點，在蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的分離與純化中具有廣闊的應用前景。
文檔編號C07K1/18GK1736538SQ20051001469
公開日2006年2月22日 申請日期2005年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月2日
發(fā)明者孫彥, 譚國民, 史清洪, 董曉燕, 白姝 申請人:天津大學