專利名稱：新型藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含CD44-透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)的分子用于生產(chǎn)藥物的用途。而且，本發(fā)明還涉及篩選與含CD44-透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)的分子結(jié)合的物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
在包括導(dǎo)致失明的眼疾如黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜低氧癥，慢性炎癥如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、動脈粥樣硬化、再狹窄以及癌癥發(fā)生和轉(zhuǎn)移在內(nèi)的多種不同病理狀態(tài)下通過血管生成而形成新血管是一個重要事件。另外，血管瘤是由于內(nèi)皮細(xì)胞增殖失控而引起的。例如這些疾病中許多疾病屬于慢性病而且目前缺少滿意的藥物，因此使得針對這些疾病的治療和藥物的研究變得至關(guān)重要。因此，一種血管生成阻斷劑具有構(gòu)成用于治療這些常見血管(和/或內(nèi)皮細(xì)胞)依賴性疾病的藥物的潛力。
一種備受關(guān)注的針對這種疾病的藥物的靶物質(zhì)是CD44(Naot等，Adv Cancer Res 1997；71241-319)。CD44是胞外基質(zhì)透明質(zhì)酸(HA)的大分子糖胺聚糖的細(xì)胞表面受體[Aruffo等，Cell 1990；611303-13]。CD44在多種細(xì)胞功能和生理功能中起作用，所述功能包括對HA的粘附和遷移、HA降解和腫瘤轉(zhuǎn)移。CD44受體在其胞外結(jié)構(gòu)域的可變區(qū)顯示出復(fù)雜的可變剪接模式[Screaton等，PNAS 1992；8912160-4]。CD44能夠與基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)結(jié)合，因而能夠?qū)MP-9定位到細(xì)胞膜上，這在某種程度上也說明了CD44具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的活性[Yu，1999#3]。
公開CD44及其上述與疾病間的關(guān)系的專利參考文獻(xiàn)有US-A-6025138，US-A-5902795，US-A-6150162，US-A-6001356，US-A-5990299和US-A-5951982。
WO 94/09811記載了CD44在治療炎癥或檢測造血源的癌癥轉(zhuǎn)移中的用途。沒有公開CD44用于抑制實(shí)體瘤生長或血管生成的用途。WO99/45942公開了HA-結(jié)合蛋白和含有CD44的肽在抑制癌癥和血管發(fā)生-依賴性疾病中的用途。CD44被作為一系列HA-結(jié)合蛋白的一個實(shí)例而得到描述。在兩個公開出版物中CD44的用途被限定到其與透明質(zhì)酸的結(jié)合力。
Ahrens等(Oncogene 2001；20；3399-3408)公開了可溶性CD44通過阻斷腫瘤細(xì)胞表面CD44與透明質(zhì)酸的結(jié)合來抑制黑素瘤的生長。因此，該工作教導(dǎo)了直接影響黑素瘤細(xì)胞生長的CD44的透明質(zhì)酸結(jié)合依賴機(jī)制。
Alpaugh等(Exp.Cell Res.261，150-158(2000))公開了肌上皮特異性CD44及其抗血管生成的特性。該研究涉及CD44的HA-結(jié)合特性。
Bajorath(PROTEINSStructure，F(xiàn)unction，and Genetics 39103-111(2000))公開了CD44及其與HA的結(jié)合、細(xì)胞粘附性和CD44-信號傳輸。而且，公開了CD44誘變實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)包括確定的非-HA-結(jié)合突變R41A和R78S及其對CD44與HA結(jié)合的影響。
因此，現(xiàn)有技術(shù)公開了CD44的潛在用途，用于說明任何影響都依賴于HA-CD44-相互作用。因此，所有與CD44-衍生肽有關(guān)的實(shí)用性都直接依賴于其與透明質(zhì)酸的結(jié)合能力。
因?yàn)橥该髻|(zhì)酸在體內(nèi)進(jìn)行廣泛的高表達(dá)，基于抑制胞外組分的治療產(chǎn)生除腫瘤以外的副作用高風(fēng)險。而且，由于體內(nèi)的HA總含量很高，即使增加了副作用的風(fēng)險，這種方案也需要高劑量的HA-阻斷重組蛋白。
因此，為了提供避免上述副作用的新型藥物靶物質(zhì)，需要找到用于治療腫瘤的新型藥物以及CD44與腫瘤生長間相關(guān)性的新途徑。
另外，還需要研制血管生成的新型抑制劑，這是因?yàn)檫@些抑制劑不但會成為潛在的癌癥藥物，而且還會成為上述一系列常見病的潛在藥物。為了達(dá)到這一目的，重要的是闡明CD44與血管生成間的關(guān)系，具體地是CD44對脈管系統(tǒng)和各種新血管形成-依賴性疾病的直接潛在作用。
本發(fā)明的概述Kogerman等[Kogerman等，Oncogene 1997；151407-16]發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)人CD44標(biāo)準(zhǔn)同種型(hCD44)的小鼠纖維瘤細(xì)胞在大體積的皮下腫瘤中喪失了hCD44的表達(dá)力。當(dāng)將得自這些原發(fā)腫瘤的hCD44陰性細(xì)胞皮下引入用于進(jìn)行第二輪腫瘤生長的新小鼠體內(nèi)時，產(chǎn)生腫瘤的潛伏期明顯地比hCD44陽性腫瘤的潛伏期短。
所觀察到的表達(dá)hCD44的腫瘤的較長潛伏期使得本發(fā)明人意識到hCD44超表達(dá)在皮下腫瘤生長過程中的抑制作用與腫瘤血管產(chǎn)生的抑制有關(guān)。血管生成的誘導(dǎo)對于實(shí)體瘤的生長和維持及其轉(zhuǎn)移是必需的。在沒有血管生成的條件下，腫瘤無法長大并且以微轉(zhuǎn)移灶的形式保持休眠狀態(tài)[Holmgren等，Nat Med 1995；1149-53]。本發(fā)明人在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)重組可溶性人CD44透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)(CD44HABD)抑制小雞血管的體內(nèi)生成和內(nèi)皮細(xì)胞的體外增殖，由此阻斷人腫瘤在小雞和小鼠體內(nèi)的生長。本發(fā)明人記載了一種新型血管生成抑制劑，同時他們還發(fā)現(xiàn)重組細(xì)胞表面受體CD44抑制體內(nèi)血管生成和腫瘤生長以及內(nèi)皮細(xì)胞的體外增殖。而且，本發(fā)明人創(chuàng)建了也能夠抑制血管生成的突變型CD44。CD44的這些突變體的優(yōu)勢在于它們不與HA結(jié)合，表明抑制血管生成的機(jī)制不依賴于與HA的結(jié)合。重要地是，突變CD44作為進(jìn)行全身施用的藥物的用途對血管的生成特異性更強(qiáng)，這是由于它在體內(nèi)沒有被HA結(jié)合，因此能以較低劑量進(jìn)行施用并且引起不希望的副作用的風(fēng)險也較小。
因此，本發(fā)明涉及含CD44-透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)的非-HA-結(jié)合變體的分子及其類似物和包括特定突變體在內(nèi)的重組變體用于生產(chǎn)治療血管生成抑制相關(guān)病癥的藥物的用途。而且，本發(fā)明還涉及一種方法，該方法用于篩選與CD44-透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)結(jié)合因而成為抑制血管生成和細(xì)胞增殖的潛在靶物質(zhì)的分子。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種用于實(shí)施該篩選方法的試劑盒以及由該方法選出的分子。并且本發(fā)明還涉及一種靶向內(nèi)皮細(xì)胞的含CD44-透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)的非-HA-結(jié)合變體的分子以及其類似物、重組和突變的變體。
因此，用于治療血管生成相關(guān)病癥如各種癌癥的藥物可以便捷地由本發(fā)明利用本發(fā)明人提出的新型機(jī)制來提供。而且，通過所述篩選方法還可以發(fā)現(xiàn)其它影響細(xì)胞增殖和/或血管生成的分子。
附圖的簡要描述

圖1表示重組GST和GST-CD44蛋白的SDS PAGE。該凝膠經(jīng)考馬斯亮蘭染色。分子量標(biāo)記物顯示于右側(cè)。
圖2表示重組CD44透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)與透明質(zhì)酸的結(jié)合。a，野生型CD44HABD，而不是與固定化的HA進(jìn)行結(jié)合的R41A，R78SY79S或R41AR78SY79S突變體。b，CD44HABD抑制人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞向HA的遷移，而R41A HA-非結(jié)合突變體沒有作用。A3，阻斷與HA結(jié)合的CD44的單克隆抗體，也抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。
圖3表示重組人CD44透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)阻斷小雞尿囊絨膜的體內(nèi)血管生成。a，濾片和從其中血管生成受bFGF誘導(dǎo)的典型血管生成實(shí)驗(yàn)中得到的相關(guān)CAM。b-d，以血管分支點(diǎn)數(shù)；平均血管生成指數(shù)±SEM來評價血管的生成；*(P＜0.05)，結(jié)果顯著。
圖4表示重組CD44透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)抑制黑色瘤(SMMU-1，M21)和肝細(xì)胞癌(HepG2)小雞CAM中的生長。
圖5表示重組CD44透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)抑制CD44陰性黑素瘤的生長。a，經(jīng)CD44HABD、CD44HABDR41AR78SY79S或作為對照的GST處理的裸鼠體內(nèi)的皮下SMMU-1腫瘤的生長曲線，每組n＝8。b，第16天的腫瘤重量，其中黑線代表中值。c，如所示處理的小鼠在第16天時的典型照片。d，每一高分辨率視野(HPF)內(nèi)腫瘤邊界上的血管數(shù)目。*(P＜0.005)，**(0.05)結(jié)果顯著。
圖6.CD44-HABD融合蛋白抑制在裸鼠體內(nèi)人胰腺癌細(xì)胞的生長。經(jīng)GST-CD44HABD(■)、GS-CD44HABDR41AR78SY79S(▲)或作為對照的GST(◆)處理的裸鼠體內(nèi)的BxPC-3胰腺癌(a)腫瘤(n＝6-7)。b，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時的BxPC-3腫瘤的平均重量。曲線中的數(shù)值和棒形圖代表平均值±s.e.m。星號表示P＜0.05。
圖7.重組CD44HABD特異性阻斷內(nèi)皮細(xì)胞循環(huán)。當(dāng)用GST(■)、GST-CD44HABD 或GS-CD44HABDR41AR78SY79S 處理時的S期細(xì)胞比例。HUVEC，人血管內(nèi)皮細(xì)胞；CPAE，牛肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞；NHDF，正常人皮膚成纖維細(xì)胞；MCF-7，人乳腺癌細(xì)胞。
圖8表示CD44HABD缺失突變體對內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。CD44HABD缺失突變體得自3mut CD44HABD(突變位點(diǎn)以粗體表示，圖8A)，按照實(shí)施例1中的記載生產(chǎn)和純化重組蛋白。在含10％血清的培養(yǎng)基中采用所示蛋白(終濃度分別為15μg/ml和30μg/ml)將牛肺內(nèi)皮細(xì)胞(CPAE)處理48小時。通過顯微照相術(shù)(B)或通過MTT染色(Sigma)和分光光度法(C)分析細(xì)胞的增殖。
定義“透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)”在下文當(dāng)中被稱作habd。
habd的“非-HA-結(jié)合變體”是指通過突變或其它任何方式而被修飾的變體，因此它至少失去了與HA結(jié)合的部分能力，但仍能夠抑制血管生成和/或內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。
含CD44-habd分子的“類似物或重組變體”是指含有CD44-habd的分子，諸如融合蛋白，因而至少基本上具有CD44-habd的特性。
“血管生成和/或內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制相關(guān)病癥”是指這樣的病癥，該病癥通過抑制血管生成和/或內(nèi)皮細(xì)胞增殖而得到治療或受到影響。
含CD44-habd分子的“結(jié)合配偶體”是指對CD44-habd或其突變體具有親合力的分子。
“受體分子或部分受體分子”是指起著受體作用或是部分受體的分子。
全文當(dāng)中的“修飾的變體”是指對正常野生型分子進(jìn)行的任意修飾，諸如缺失、插入、取代、類似物、片段或其重組變體。
本發(fā)明的詳細(xì)描述WO 94/09811記載了CD44在治療炎癥或檢測癌轉(zhuǎn)移中的用途。該作者指明CD44在炎癥性病癥中被上調(diào)以及CD44肽能夠抑制T-細(xì)胞的活化。沒有提供CD44抑制轉(zhuǎn)移的相關(guān)數(shù)據(jù)和權(quán)利要求而且也沒有要求保護(hù)CD44在抑制腫瘤生長或血管生成中的用途。WO 99/45942公開了HA-結(jié)合蛋白和含CD44的肽抑制癌癥和血管生成-依賴性疾病的用途。該出版物利用metastatin，一種軟骨連接蛋白的38kDa片段，以及由該片段產(chǎn)生的HA-結(jié)合肽來抑制B16小鼠黑素瘤和路易斯(Lewis)肺癌的肺轉(zhuǎn)移。在有HA-結(jié)合肽存在的條件下，小雞CAM上的B16黑素瘤的生長以及內(nèi)皮細(xì)胞在HA上的遷移受到抑制。在上述兩個出版物中，HA-結(jié)合肽的用途直接與它們結(jié)合透明質(zhì)酸的能力有關(guān)。
CD44最初參與了通過依賴其與基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的結(jié)合能力的機(jī)制來加快血管生成的過程(Yu和Stamenkovic，Genes Dev1999；1335-48；Yu和Stamenkovic，Genes Dev 2000；14163-76)?？扇苄訡D44(sCD44v6-10)在小鼠TA3乳癌細(xì)胞中的超表達(dá)抑制了MMP-9與腫瘤細(xì)胞表面的結(jié)合，由此阻斷了腫瘤的生長和血管形成(Yu和Stamenkovic 2000)。MMP-9被證實(shí)在腫瘤的發(fā)生和腫瘤內(nèi)主要參與了血管的生成(Vu等，Cell 1998；93411-22；Bergers等，Nat CellBiol 2000；2737-44；Coussens等，Cell 2000；103481-90)。由于體外小管生成(tubulogenesis)通過封閉TGFβ而受到抑制，所以CD44-MMP-9復(fù)合物還參與了潛伏狀態(tài)的TGFβ的活化(Yu和Stamenkovic，2000)。
本發(fā)明人使用的CD44-HABD的突變體對MMP-9的親合力差別很大，但不受其影響，對血管生成的抑制作用卻非常相同，因而MMP-9結(jié)合力對于本發(fā)明中公開的血管生成抑制作用起至關(guān)重要作用的可能性不大。另外，本發(fā)明人描述了CD44直接抑制血管生成的機(jī)理。而且，本發(fā)明人證實(shí)了與前面提及的在被轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞表面破壞CD44與MMP-9結(jié)合的機(jī)理相比，CD44在正常內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)具有不同靶向物的機(jī)理。Gao等(Cancer Res1998；582350-2)指出大鼠Dunning AT3.1前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力而非腫瘤形成不取決于與HA的結(jié)合，因?yàn)镃D44標(biāo)準(zhǔn)同種型和R44A非HA-結(jié)合突變體的超表達(dá)都明顯降低了轉(zhuǎn)移性肺集落的形成，卻沒有減緩局部腫瘤的生長。這表明不同于HA的其它CD44結(jié)合配偶體一定參與了轉(zhuǎn)移。已經(jīng)記載了包括HGF、bFGF、纖連蛋白、骨橋蛋白、選擇蛋白等在內(nèi)的多種CD44結(jié)合蛋白。然而，這些蛋白中的幾種蛋白的結(jié)合卻依賴于CD44翻譯后修飾和/或我們的重組融合蛋白中不存在的CD44的另外外顯子的存在。而且，這些CD44-結(jié)合蛋白中的許多種大量存在于體內(nèi)，從而使得與這些蛋白結(jié)合的CD44-衍生物很少被用作藥物，這是由于存在著產(chǎn)生副作用的高風(fēng)險。另外，上述蛋白中沒有一種特定于靶向血管細(xì)胞，并且它們也不會阻斷內(nèi)皮細(xì)胞生長所特別需要的途徑。因此該配體以及該途徑一定是新的。本發(fā)明公開了一種用于鑒定CD44的結(jié)合配偶體以及與血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞生長受到抑制相關(guān)的途徑的方法。
本發(fā)明的第一個方面涉及含CD44-透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)的非-HA結(jié)合變體及其類似物、重組和突變變體的分子用于制備治療血管生成和/或內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制相關(guān)病癥的藥物的用途。
在一個實(shí)施方案中，CD44-HABD含有至少一個突變，因而賦予其非-HA-結(jié)合的性質(zhì)。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述突變選自F34A，F(xiàn)34Y，K38R，K38S，R41A，Y42F，Y42S，R46S，E48S，K54S，Q65S，K68S，R78K，R78S，Y79F，Y79S，N100A，N100R，N101S，Y105F，Y105S，S112R，Y114F，F(xiàn)119A，F(xiàn)119Y。優(yōu)選地，所述突變選自R41A，R78S，Y79S中的一個或多個。而且，產(chǎn)生3至110個氨基酸長度的任何CD44片段的缺失突變都可能被用于本發(fā)明的目的。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員輕易就能意識到可以在CD44-HABD部分中引進(jìn)針對野生型HA-結(jié)合CD44的任何突變，諸如一種或多種能夠獲得所需特性的缺失、取代或插入，所述突變使CD44-HABD或其片段至少部分成為非-HA結(jié)合性質(zhì)的。
CD44-HABD是一種具有人的完整CD44分子中第21-132位氨基酸的蛋白，或者與人CD44的這個區(qū)域具有高度同源性。小雞CD44-HABD是由本發(fā)明人分離出來的差別最大的HABD，其含有在氨基酸水平上與人HABD具有55％同源性的序列。因此高度序列同源性意味著至少約55％的氨基酸同源性，理想地是至少65％的同源性，以及最理想地是至少75％的同源性。
而且，本發(fā)明的分子涉及缺失型的或以其它任何方式得到的改變型或突變的CD44-HABD蛋白，其中所述的改變型基本具有與原始CD44-HABD蛋白或本文指定的CD44-HABD突變體相同的性質(zhì)，所述性質(zhì)是通過本文記載的任意一種方法測得的。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，含CD44-透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)的非-HA結(jié)合變體分子選自人CD44-HABD(SEQ ID NO2)，狗CD44-HABD(SEQ ID NO4)，小雞CD44-HABD(SEQ ID NO6)，人CD44-HABD-R41A(SEQ ID NO8)，人CD44-HABD-R78SY79S(SEQ ID NO10)和CD44-HABD-R41AR78SY79S(SEQID NO12)，上述序列進(jìn)一步含有至少一種修飾，從而使它們成為非-HA-結(jié)合性質(zhì)的。其它變體也是可行的，諸如具有R41A，R78S或Y79S突變的CD44-HABD-R78S，CD44-HABD-Y79S以及GST-CD44-HABD-融合蛋白。
CD44-HABD-R41A，CD44-HABD-R78SY79S和CD44-HABD-R41AR78SY79S是CD44-HABD的突變變體的優(yōu)選實(shí)例，其中最后四個字母/數(shù)字表示突變的位置和類型。
GST-CD44-HABD是GST-部分和CD44-HABD的融合蛋白。其它可能的融合蛋白可以選自IgG，IgM，IgA，His，HA，F(xiàn)LAG，c-myc，EGFP。GST是一種短鏈谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，其被用作采用GST-結(jié)合柱對融合蛋白進(jìn)行純化目的以及檢測目的的標(biāo)記物。GST的天然存在形式為26kDa的蛋白質(zhì)(Parker，M.W.等，J.Mol.Biol.213，221(1990)；J1，X.等，Biochemistry 31，10169(1992)；Maru，Y.等，J.Biol.Chem.271，15353(1996))。
因此，在另一個實(shí)施方案中，所述重組變體是具有GDT-部分和CD44-HABD部分的融合蛋白，其中所述CD44-HABD-部分是野生型或突變型。除GST以外的其它標(biāo)記物也完全可以使用。
優(yōu)選地，所述CD44-透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)與SEQ ID NO2序列具有至少55％的同源性，更優(yōu)選地至少65％的同源性，甚至更優(yōu)選地至少75％的同源性。最優(yōu)選地是所述CD44-透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)是序列SEQ IDNO1的一種修飾變體(非-HA-結(jié)合基因產(chǎn)物)。
待治療的病癥或疾病可以是選自以下的任一種引起失明的眼疾或視力損傷如黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病和視網(wǎng)膜低氧癥，慢性炎癥如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、動脈粥樣硬化、再狹窄，以及癌生長和轉(zhuǎn)移，以及所有類型的癌癥和腫瘤如乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、皮膚癌、肝癌、腦癌、卵巢癌、睪丸癌、骨癌、上皮癌、內(nèi)皮癌、胰腺癌、腎癌、肌肉癌、腎上腺癌、腸癌、內(nèi)分泌腺癌、口腔癌、頭癌和頸癌或其它實(shí)體組織源癌癥或任何形式的白血病以及血管瘤。
本發(fā)明可以被用于人和獸的醫(yī)療中。例如，本發(fā)明可以被用于普通動物園中的小鼠、大鼠、小雞、狗、馬、貓、牛和所有長壽物種。優(yōu)選地，本發(fā)明被用于人。
本發(fā)明的另一方面涉及含有GST-部分和CD44-HABD部分的重組分子。所述CD44-HABD部分可以例如進(jìn)行了以下突變中的一種或多種突變F34A，F(xiàn)34Y，K38R，K38S，R41A，Y42F，Y42S，R46S，E48S，K54S，Q65S，K68S，R78K，R78S，Y79F，Y79S，N100A，N100R，N101S，Y105F，Y105S，S112R，Y114F，F(xiàn)119A，F(xiàn)119Y。優(yōu)選地，所述突變選自R41A，R78S，Y79S中的一種或多種。然而，技術(shù)人員很容易就能意識到可以在CD44-HABD部分中引進(jìn)針對野生型HA-結(jié)合CD44的任何突變，諸如一種或多種能夠獲得所需特性的缺失、取代或插入，所述突變使CD44-HABD或其片段至少部分成為非-HA結(jié)合性質(zhì)的。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述CD44-HABD-部分含有氨基酸序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO23、SEQ ID NO26中的任一個氨基酸序列的CD44-HABD的非-HA結(jié)合變體，上述序列進(jìn)一步含有至少一種修飾，從而使其成為非HA-結(jié)合性質(zhì)的。
在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，CD44-HABD含有CD44的第23-132位氨基酸中的至少三個連續(xù)氨基酸。基本上，3-110個氨基酸大小的所有片段，例如23-25、24-26、25-27位氨基酸等，23-26、24-27位氨基酸等23-27位氨基酸等，23-28位氨基酸等都可能有效。因此，正如技術(shù)人員所能容易理解到的，只要具有所需的特性，連續(xù)氨基酸多達(dá)110個原始分子的氨基酸的所有組合都可以被用于本發(fā)明，其中所述特性通過本申請實(shí)施例部分的所述方法來檢測。
在另一個實(shí)施方案中，所述CD44-HABD部分由與SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQID NO11中的任意一個核苷酸序列具有至少55％的同源性、優(yōu)選65％的同源性、更優(yōu)選地75％的同源性的序列所編碼，最優(yōu)選地是由SEQ IDNO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11中的任意一個核苷酸序列所編碼，其中所述核苷酸序列是一種修飾的形式(非-HA-結(jié)合基因產(chǎn)物或肽)。
另一方面，本發(fā)明涉及一種抑制血管生成和/或內(nèi)皮細(xì)胞增殖的藥物組合物，其特征在于含有至少一種含CD44-透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)及其類似物、重組的或突變的變體的分子，混合或同時含有至少一種藥用載體或賦形劑。
所述藥物組合物通過對制藥領(lǐng)域中的技術(shù)人員來說是已知的方式來制備。所述載體或賦形劑可以是固體的、半固體的或液體的材料，該材料能夠作為活性成分的載體或介質(zhì)。合適的載體或賦形劑在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的。所述藥物組合物可以是適于經(jīng)口或非腸道施用的并且可以以片劑、膠囊、栓劑、溶液、混懸液等形式來對患者進(jìn)行施用。
所述藥物組合物可以進(jìn)行口服，例如與一種惰性稀釋劑或可食用載體一起進(jìn)行口服。它們可以被包封在明膠膠囊中或被壓成片劑。本發(fā)明的用于經(jīng)口治療施用的化合物可以與賦形劑進(jìn)行組合并被用作片劑、錠劑、膠囊、酏劑、混懸液、糖漿劑、糯米紙囊劑、咀嚼劑等。這些制劑應(yīng)當(dāng)含有重量百分含量至少為4％的作為活性成分的本發(fā)明化合物，但是可以根據(jù)特定的劑型進(jìn)行變化，而且可以適當(dāng)?shù)厥?-70％單位重量比。所述組合物所含活性成分的量高至能夠得到適于施用的單位劑量形式。
片劑、丸劑、膠囊、錠劑等還可含有至少一種下列輔劑結(jié)合劑如微晶纖維素、西黃蓍膠或明膠，賦形劑如淀粉或乳糖，崩解劑如海藻酸、原膠(Primogel)、玉米淀粉等，潤滑劑如硬脂酸鎂或Sterotex，潤滑劑(glidant)如膠體二氧化硅和甜味劑如蔗糖或糖精或風(fēng)味劑如薄荷、水楊酸甲酯或桔子調(diào)味料。當(dāng)單位劑量形式是膠囊時，除了上述物質(zhì)外它還可含有液體載體如聚乙二醇或脂肪油。其它單位劑量形式可以含有改變單位劑量形式的物理形式的其它不同物質(zhì)，例如包衣。因此，片劑或丸劑可以用糖、蟲膠或其它腸衣物質(zhì)來包衣。糖漿劑除了含有所述活性成分外還可含有蔗糖作為甜味劑和某些防腐劑、染料和風(fēng)味劑。用于這些不同組合物制劑的物質(zhì)應(yīng)當(dāng)是藥學(xué)純的并且在所用量是無毒性的。
為了進(jìn)行非腸道施用，本發(fā)明的化合物可被配制成溶液或混懸液。非腸道施用是指不通過消化道而通過某種其它途徑進(jìn)行注射的施用方式，如皮下、肌內(nèi)、眼內(nèi)、囊內(nèi)、脊柱內(nèi)、胸骨內(nèi)、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、肺內(nèi)、通過泌尿道、通過家畜的輸乳管注射到器官如骨髓等中。骨髓還可以進(jìn)行體外處理。這些制劑可含有至少為0.1％重量百分比的本發(fā)明活性化合物，而且還可以在約為0.1-50％(重量)的范圍內(nèi)變化。這種組合物所含活性成分的量高到能夠達(dá)到適當(dāng)?shù)膭┝俊Ｋ鋈芤夯蚧鞈乙哼€可以含有至少一種下列輔劑無菌稀釋劑如注射用水、鹽水、不揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑，抗菌劑如芐醇或羥苯甲酸甲酯，抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉，螯合劑如乙二胺四乙酸，緩沖劑如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，以及用于調(diào)節(jié)漲度的物質(zhì)如氯化鈉或葡萄糖。非腸道制劑可以被裝在安瓿、一次性注射器或多劑量的玻璃或塑料容器中。為了進(jìn)行局部施用，本發(fā)明的化合物可被配制成溶液、混懸液或軟膏的形式。這些制劑可含有至少為0.1％重量比的本發(fā)明活性化合物，而且還可以在約為0.1-50％重量比的范圍內(nèi)進(jìn)行變化。這種組合物所含活性成分的量高到能夠達(dá)到適當(dāng)?shù)膭┝?。采用對皮膚觸摸、按壓、按摩或加熱、加溫或紅外線的方式來增強(qiáng)皮膚的滲透性從而有利于施用。Hirvonen等，NatBiotechnology 1996；141710-13記載了如何利用電場的驅(qū)動力來增強(qiáng)藥物透過皮膚而進(jìn)行傳輸。優(yōu)選地，在微堿性pH條件下進(jìn)行離子電滲療法。
另一方面，本發(fā)明涉及一種治療受試者癌癥腫瘤或任何其它血管生成和/或內(nèi)皮細(xì)胞增殖相關(guān)性疾病的方法，該方法包括施用藥用劑量的含有CD44-透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)及其類似物、重組或突變變體的分子。
受試者是指任何包括人在內(nèi)的哺乳動物。人類受試者是優(yōu)選的。
另一實(shí)施方案中，本發(fā)明可被用于治療特征在于血管過度形成和/或內(nèi)皮細(xì)胞增殖失控的疾病或病癥。這些疾病或病癥包括但不限于由糖尿病視網(wǎng)膜癥或黃斑變性引起的成人失明或視力下降、牛皮癬和各種慢性炎癥以及血管瘤。
CD44-HABD或其片段可以通過本技術(shù)領(lǐng)域中已知的任何重組表達(dá)或化學(xué)合成方法來獲得?？梢匀鐚?shí)施例1所述，在細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。其可被克隆到桿狀病毒載體當(dāng)中并在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。其還可在哺乳動物細(xì)胞或任何其它表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)?？梢詫⒂H和標(biāo)記物加到蛋白產(chǎn)物上，并且可以利用帶有選擇性標(biāo)記物的親和層析來純化該蛋白。親和標(biāo)記物在本技術(shù)領(lǐng)域中是公知的，并且包括但不限于GST-標(biāo)記物，His-標(biāo)記物，S-標(biāo)記物，T7-標(biāo)記物，V5-標(biāo)記物，E2-標(biāo)記物，c-myc-標(biāo)記物，HA-標(biāo)記物，F(xiàn)LAG-標(biāo)記物。該蛋白也可以在沒有任何標(biāo)記物的條件下進(jìn)行表達(dá)，并且利用免疫親和、離子交換或凝膠過濾層析或其組合方式來進(jìn)行純化。而且CD44-HABD、其片段或其類似物可以通過已知的化學(xué)合成法來獲得，所述化學(xué)合成法包括但不限于固相肽合成。由所述的任何方法獲得的CD44-HABD被包含在本發(fā)明中。
另一方面，本發(fā)明涉及篩選含CD44-透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)的分子及其類似物、突變和重組變體的結(jié)合配偶體的方法，該方法包括以下步驟a)提供含CD44-透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)或其片段的分子；b)使?jié)撛诮Y(jié)合配偶體與所述分子接觸；和
c)測定所述分子對所述潛在結(jié)合配偶體的作用。
可行的篩選方法包括(I)a)將HABD、HABD類似物或其突變體與細(xì)胞、細(xì)胞裂解物、細(xì)胞碎片、組織、生物體、動物或生物體或動物的部分結(jié)構(gòu)一起進(jìn)行溫育。
b)HABD結(jié)合配偶體的純化和檢測(例如通過親和柱、凝膠電泳和利用抗體或蛋白染色或同位素的任何檢測方法或其它檢測HABD或與HABD連接的標(biāo)記物任何方法c)通過凝膠電泳(例如2D電泳)定位、利用質(zhì)譜、測序、抗體或其它鑒定手段來鑒定HABD結(jié)合配偶體。
d)測定HABD對被鑒定結(jié)合配偶體的作用或測定所述潛在結(jié)合配偶體的其它相互作用物質(zhì)的體外或體內(nèi)作用。
e)利用被鑒定的HABD-結(jié)合配偶體來設(shè)計(jì)細(xì)胞增殖和/或血管生成的新型抑制劑。
(II)a)以HABD作為遺傳篩選DNA、cDNA、噬菌體、肽、蛋白、細(xì)胞或生物體文庫的誘餌(bait)或以HABD、其類似物或突變體作為誘餌來篩選合成肽、蛋白、多糖、脂質(zhì)、硫酸乙酰肝素或蛋白聚糖文庫。
b)通過選擇性標(biāo)記來檢測HABD結(jié)合配偶體。
c)通過測序、雜交、限制性分析、抗體或通過文庫內(nèi)的逐步排除法或通過其它鑒定手段來鑒定HABD結(jié)合配偶體。
d)測定HABD對被鑒定配偶體的作用或者測定所述潛在結(jié)合配偶體的其它相互相互作用物在體外或體內(nèi)的作用。
e)利用被鑒定的HABD-結(jié)合配偶體來設(shè)計(jì)細(xì)胞增殖和/或血管生成的新型抑制劑。
而且，本發(fā)明的篩選方法可以被用于測定所述潛在結(jié)合配偶體的其它激活劑或功能阻斷劑的作用。
而且，HABD-突變體或其片段還可被用于篩選。這可以提供一種更特異的尋找抗-血管生成分子的研究方法。
在一個實(shí)施方案中，所述潛在結(jié)合配偶體選自蛋白、糖蛋白、蛋白聚糖、硫酸乙酰肝素、脂質(zhì)、聚糖、糖苷和糖。
在另一個實(shí)施方案中，潛在結(jié)合配偶體是一種受體分子或受體分子的一部分或結(jié)合細(xì)胞表面受體分子的分子或定位在細(xì)胞表面但并非受體分子的分子。
在另一個實(shí)施方案中，所述潛在結(jié)合配偶體是胞外分子，并且定位在胞外基質(zhì)、組織竇、淋巴或血管中。
另一方面，本發(fā)明涉及通過上述方法找到的含CD44-透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)的分子的結(jié)合配偶體。該結(jié)合配偶體是促進(jìn)或抑制血管生成的分子，因而成為研制新型血管生成抑制劑的潛在靶物質(zhì)，該結(jié)合配偶體例如是通常產(chǎn)生原血管生成信號的細(xì)胞表面受體，包括可溶性血管生成因子的受體，如生長因子受體(例如VEGF-受體家族、FGF-受體家族、EGF-受體家族、PDGF-受體家族)，胞外基質(zhì)受體(例如整合蛋白、多配體聚糖、蛋白聚糖)，細(xì)胞-細(xì)胞粘附受體(例如Cadherins、Ig-類超家族、選擇蛋白)。該受體將原-血管生成信號轉(zhuǎn)入內(nèi)皮細(xì)胞或阻斷或促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞中的抗血管生成信號。該信號受體的激活通過與胞外配體結(jié)合或通過利用胞內(nèi)信號事件而使受體的胞質(zhì)區(qū)域定向活化作用來實(shí)現(xiàn)?；蛘?，細(xì)胞表面上的受體起著將其配體轉(zhuǎn)運(yùn)和定位到胞內(nèi)受體(例如核受體)上的載體的作用，兩者都是潛在結(jié)合配偶體的實(shí)例，所述潛在結(jié)合配偶體可以通過要求保護(hù)的篩選方法來進(jìn)行鑒定并且可以被用作抗-血管生成靶物質(zhì)。
在另一方面，本發(fā)明涉及用于實(shí)施上述方法的試劑盒，該試劑盒在各個小瓶中裝有含CD44-透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)、其類似物或突變體或片段以及潛在結(jié)合配偶體或其片段的分子或遺傳信息。
另一方面，本發(fā)明涉及含CD44-透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)及其類似物、重組和突變的變體或其片段的分子用于靶向內(nèi)皮細(xì)胞的用途。由于本發(fā)明的CD44-HABD-分子顯示出了與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的能力，所以其可被用于靶向這種細(xì)胞。
在一個實(shí)施方案中，所述分子進(jìn)一步含有具有化療和基因療法性能的部分。因此，本發(fā)明的修飾的變體形式的CD44-HABD-分子可以被用作針對內(nèi)皮細(xì)胞的抗腫瘤藥物。正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所能理解的，本發(fā)明的CD44-HABD分子除抗腫瘤以外，還具有其它性能，諸如抗-內(nèi)皮細(xì)胞增殖和/或遷移、原-細(xì)胞編程性死亡或破壞內(nèi)皮細(xì)胞或其它血管細(xì)胞的基本功能。然而，具有抗腫瘤特性的部分是一個優(yōu)選的實(shí)施方案。
“具有化療特性”是指具有這種特性的分子具有抑制其靶向細(xì)胞的生長和/或殺死其靶向細(xì)胞的能力，該能力通過利用以下方法來測定細(xì)胞或組織的體外組織培養(yǎng)，體外酶活性如激酶、磷酸酶、糖基化作用、乙?；饔谩⒌鞍姿庾饔?、接頭連接或任何其它酶活性的篩選，質(zhì)子轉(zhuǎn)移、離子泵功能的體外或體內(nèi)篩選和/或細(xì)胞生長、細(xì)胞編程性死亡、或其它細(xì)胞死亡方式、腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移、侵襲、血管生成和/或組織體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的體內(nèi)或體外篩選。
具有化療和/或基因療法特性的部分可以例如選自對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說已知的用于基因療法、各種化療的各種病毒、與habd、其突變體或片段偶聯(lián)的裸DNA以及其它DNA-載體，包括但不限于脂質(zhì)、肽和蛋白質(zhì)。
例如Arap等(science，1998，279377-380)，Ellerby等(NatureMedicine，1999，5；91032-1038)和Trepel等(Human Gene Therapy，2000，111971-1981)分別公開了用于靶向內(nèi)皮細(xì)胞的阿霉素分子(cytostatica)的偶聯(lián)，細(xì)胞編程性死亡誘導(dǎo)肽的偶聯(lián)和病毒的偶聯(lián)。這些文件被引入本文作為參考。
病毒偶聯(lián)是內(nèi)皮-靶向分子如何被用于基因治療的實(shí)例。
因此，在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含CD-44透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)及其類似物、重組和突變變體或片段和具有化療和/或基因治療特性的部分的分子。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及與具有上述化療特性的部分相偶聯(lián)而用于醫(yī)藥用途的本發(fā)明的分子。
本發(fā)明將通過下列實(shí)施例得到描述，而這些實(shí)施例只是說明目的的，無論如何不會限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1-以GST融合蛋白形式的野生型和突變型人CD44 HA結(jié)合區(qū)的構(gòu)建和純化人CD44標(biāo)準(zhǔn)同種型cDNA[Stamenkovic等，EMBO J 1991；10343-8]被用于PCR擴(kuò)增具有21-132位氨基酸的透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)，采用了寡核苷酸5′CGCGAATTCCAGATCGATTTGAATATG 3′(SEQ ID NO13)(含內(nèi)部EcoR1切割位點(diǎn))和5′CGCGAGCTCCTTCTAACATGTAGTCAG 3′(SEQ IDNO14)(含內(nèi)部SacI切割點(diǎn))。得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物被克隆到pGEX-KG載體[Guan和Dixon，Anal Biochem1991；192262-7]中。按照廠商提供的方案通過位點(diǎn)定向誘變進(jìn)行CD44 HABD透明質(zhì)酸非結(jié)合突變體的制備(Quickchange，Stratagene)。誘變寡配對體(oligo pairs)R41A(5′GAGAAAAATGGTGCCTACAGCATCTCTCGG-3′(SEQ ID NO15)，5′AGATGCTGTAGGCACCATTTTTCTCCACG-3′(SEQ ID NO16))和R78SY79S(5′GACCTGCAGCTCTGGGTTCATAG 3′(SEQ ID NO17)，5′ATGAACCCAGAGCTGCAGGTCTC 3′(SEQ ID NO18))被用于將R41A和R78S，Y79S突變分別引進(jìn)野生型CD44 HABD當(dāng)中。
利用得自Ambion的RNAqueous試劑盒(Austin TX)并按照出廠說明書來從每種組織中提純小雞CAM和狗肝RNA。利用特定于得自各個物種的CD44的第63-81位和第359-330位核苷酸的引物通過RT-PCR獲得編碼小雞和狗CD44-HABD的cDNA。所述引物對如下所述用于小雞的5′-CAGAGACACAATTCAATATA-3′(SEQ ID NO19)，5′-TTGGCTCACATGCTTTG-3′(SEQ ID NO20)和用于狗的5′-CGCAGATCGATTTGAACATA-3′(SEQ ID NO21)，5′-CCGATGTACAATCCTCTTC-3′(SEQ ID NO22)。將與SEQ ID NO 3(狗)和SEQ ID NO 5(小雞)對應(yīng)的cDNA克隆到細(xì)菌表達(dá)載體pET15b(Novagen)中，該表達(dá)載體在E.Coli中表達(dá)與His-標(biāo)記物融合的蛋白。在OD600＝0.7的條件下于27℃下利用1mM IPTG來誘導(dǎo)大腸桿菌BL21(E.coli BL21)菌株中野生型和R41A，R78S，Y79S突變體GST-CD44 HABD的表達(dá)，并利用谷胱甘肽瓊脂糖珠子(Sigma)按照廠商提供的方案進(jìn)行純化。通過考馬斯亮蘭染色SDS聚丙烯酰胺電泳分離的產(chǎn)物測得所得的蛋白基本上是純的(圖1)。利用HICAM樹脂(Sigma)按照廠商提供的方案純化小雞和狗CD44 HABD。通過考馬斯亮蘭染色SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測得所得的蛋白基本上是純的而不含污染物。
實(shí)施例2-重組的野生型而非突變的CD44HABD能夠以劑量依賴方式與透明質(zhì)酸(HA)結(jié)合并且能夠抑制人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)向HA的趨觸性(haptotaxis)用1mg ml-1高分子量的透明質(zhì)酸(Sigma)的PBS在室溫(RT)下過夜包被Maxisorp(Nunc)平板。用PBS沖洗各孔并用2％BSA在RT下封閉2小時。用PBS稀釋的純化蛋白被加到各孔中并在RT下溫育1小時。用PBS-T沖洗三次后，將小鼠抗-GST抗體B-14(Santa CruzBiotechnology)在RT下溫育1小時，進(jìn)一步?jīng)_洗，并且在RT下與HRP-綴合的山羊抗小鼠的二抗(Dako)一起溫育1小時。HA結(jié)合力通過利用OPD產(chǎn)色底物(Sigma)顯色并在450nm下測吸光度。如圖2A所示，野生型而非突變型CD44融合蛋白以濃度依賴方式與HA結(jié)合。
人主動脈、內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)得自Clonetics并用添加了10％FCS，2μg ml-1小鼠EGF(Sigma)和50ug ml-1慶大霉素的EBM-2培養(yǎng)基(Clonetics)進(jìn)行培養(yǎng)。在Transwell遷移室(孔徑8mm；Costar)中進(jìn)行細(xì)胞遷移分析。較低的隔室含有1μg ml-1高分子量的透明質(zhì)酸(Sigma)。將CD44HABD、CD44HABDR41A或GST(10μg ml-1)加到較低隔室內(nèi)。為了進(jìn)行抗體抑制分析，將細(xì)胞與10μgml-1抗CD44mAb A3(Guo等，1993，1994)預(yù)先溫育30分鐘。主動脈內(nèi)皮細(xì)胞被加到Transwell室的較高隔室當(dāng)中并使其向膜下側(cè)遷移2.5小時。利用0.5％的結(jié)晶紫對遷移細(xì)胞固定并染色。沖洗后，將膜干燥并用10％的乙酸乙酯洗脫結(jié)合染料。通過分光光度法在600nm下讀取回收洗脫液的光密度。如圖2B所示的結(jié)果表明野生型CD44HABD而不是各種非-HA-結(jié)合的R41A突變體抑制人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞向HA的遷移，而遷移還受到特異阻斷CD44與HA結(jié)合的抗體的抑制(A3)。
實(shí)施例3-重組CD44融合蛋白阻斷小雞CAM中的非HA-結(jié)合依賴型的血管生成按照[Brooks等，J Clin Invest 1995；961815-22]中記載的方法制備10-天齡的小雞胚胎。為了進(jìn)行血管生成分析，將用100ngml-1VEGF(Sigma)、100ng ml-1TGFa(Sigma)或1μg ml-1bFGF(GibcoLifetech)浸泡的濾片放置在CAM上，接下來每天異位(ectopical)添加10μg的CD44HABD、CD44HABDR41AR78SY79S或GST和作為對照的PBS(每組n＝6)。72小時后，將濾片與周圍的CAM組織分開并利用解剖顯微鏡進(jìn)行血管生成的定量分析。血管生成通過所述濾片正下方的CAM區(qū)域內(nèi)的血管分支點(diǎn)數(shù)來進(jìn)行評估。
GST-CD44HABD和GST-CD44HABDR41AR78SY79S而非GST的處理徹底消除了VEGF、bFGF或TGFα(圖3a-d)的血管生成作用，表明可溶性CD44HABD阻斷了由三種不同血管生成因子誘導(dǎo)的血管生成。由于HA-非結(jié)合突變體在抑制血管生成的過程中效力相同，所以該抑制作用不依賴于HA的結(jié)合。
實(shí)施例4-重組的CD44 HABD蛋白阻斷小雞CAM上的不同腫瘤細(xì)胞系的生長SMMU-1人黑素瘤細(xì)胞最初分離自原發(fā)腫瘤并且是CD44-陰性的(Guo等，Cancer Res 1994；541561-5)。利用含10％胎牛血清和50mg ml-1ginomycin的RPMI1640培養(yǎng)HepG2人肝細(xì)胞癌。利用含10％胎牛血清和50μg ml-1慶大霉素的DMEM培養(yǎng)SMMU-1-細(xì)胞和M21細(xì)胞。通過胰蛋白酶消化從平板上將所述細(xì)胞分離下來并將一百萬個細(xì)胞接種在10天齡的小雞胚胎CAMS上。每兩天利用10μg得自人或雞的融合蛋白(在100μl的PBS中)或只利用載體對腫瘤進(jìn)行處理。7天后切除腫瘤并測定濕重。如圖4所示，所有測試的腫瘤細(xì)胞系的腫瘤生長得到明顯抑制。
實(shí)施例5-重組CD44融合蛋白抑制裸鼠內(nèi)腫瘤的生長1×106SMMU-1細(xì)胞被皮下注射到6-周齡雌性BALB/cABom裸鼠(M & B)的背部中。第二天在腫瘤附近給小鼠皮下注射了含在100μlPBS中的2.4mg的GST-CD44HABD，GST-CD44HABDR41AR78SY79S或GST/kg體重。每兩天重復(fù)一次處理并且兩周后殺死動物，剝離出腫瘤、進(jìn)行測重并準(zhǔn)備用于組織分析。與GST-處理的對照相比，采用CD44HABD或非-HA-結(jié)合突變體CD44HABDR41AR78SY79S對小鼠進(jìn)行的皮下處理明顯減緩了腫瘤的生長(圖5a，c，所有時間點(diǎn)的P＜0.05)。在第16天殺死小鼠時，CD44HABD和CD44HABDR41AR78SY79S處理的小鼠的腫瘤重量比GST處理的小鼠平均減小了45％(分別是47％和43％)(圖5b)。
為了進(jìn)行免疫組化分析，從福爾馬林固定和石蠟包埋的大小類似的SMMU-1腫瘤上切下4μm厚的組織切片。利用山羊抗小鼠PECAM-1(Santa Cruz Biotech)的一抗抗體進(jìn)行組織切片上的血管染色，并且利用綴合了堿性磷酸酯酶的抗-山羊二抗測定一抗的結(jié)合，利用Vectastain試劑盒(Vector Laboratories)進(jìn)行顯色。通過對PECAM-1陽性血管染色而進(jìn)行的免疫組織化學(xué)分析表明CD44HABD和CD44HABDR41AR78SY79處理的腫瘤在腫瘤邊界形成的血管較少(圖5d)。實(shí)施例6-CD44-HABD融合蛋白也抑制裸鼠體內(nèi)的人胰腺癌的生長將1×106BxPC-3(ATCC，Manassas，Virginia)細(xì)胞皮下注入6-8周齡雌性BALB/cABom裸鼠(M & B，Ry，Denmark)的背部。當(dāng)出現(xiàn)腫塊時，開始在小鼠的腫瘤附近皮下注射20μg(BxPC-3)或50μg(SMMU-1)的GST-CD44HABD，GS-CD44HABDR41AR78SY79S或含在100μl PBS中的GST。所述處理每兩天重復(fù)一次，并且當(dāng)大多數(shù)對照腫瘤的直徑達(dá)到25mm時殺死動物。腫瘤體積利用公式(寬度2×L長度)×0.52來計(jì)算。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，剝離出腫瘤，分析重量并準(zhǔn)備用于組織分析。BxPC-3細(xì)胞開始緩慢長出腫瘤。GST-處理的對照在第52天殺死小鼠時平均體重達(dá)到0.267±0.042g(圖2d-g)。用GST-CD44HABD或GS-CD44HABDR41AR78SY79S處理小鼠后明顯地抑制了BxPC-3腫瘤的生長，與對照相比，腫瘤的平均重量分別被降低了60％(0.108±0.028g)和70％(0.085±0.017g)(P＜0.05；n＝6)。
實(shí)施例7-重組CD44HABD特異性抑制內(nèi)皮細(xì)胞的體外增殖并且阻斷了內(nèi)皮細(xì)胞周期為了進(jìn)行細(xì)胞周期分析，在有30μg/ml GST-CD44HABD、GST-CD44HABDR41AAR78SY79S、GST或PBS存在的條件下將指數(shù)生長期的初級人血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)、牛肺動脈內(nèi)皮(CPAE)細(xì)胞、初級人成纖維細(xì)胞(NHDF)、MCF-7或SMMU1細(xì)胞培養(yǎng)48小時。用30μg/ml溴脫氧尿苷(BrdU)將細(xì)胞刺激60分鐘，回收細(xì)胞并用冰冷乙醇進(jìn)行固定。用1∶50稀釋的抗-BrdU mAb G3G4(Developmental Studies HybridomaBank，University of Iowa，Iowa)、接著用綴合了異硫氰酸熒光素-的山羊抗小鼠的抗體(Jackson Immunoresearch，West Grove，Pennsylvania)結(jié)合、同時用碘化丙錠染色來染色細(xì)胞上的BrdU。然后采用FACScan流式血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Becton Dickinson，F(xiàn)ranklinLakes，New Jersey)分析細(xì)胞周期的分布。
與對照處理細(xì)胞(25％；圖7D)相比，接觸了GST-CD44HABD或GST-CD44HABDR41AR78SY79S的人血管內(nèi)皮細(xì)胞和牛肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞明顯降低了S-期中的細(xì)胞量(分別為5％和6％)。而且，CD44HABD對初級人成纖維細(xì)胞(NHDF)或任何測試的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期都沒有產(chǎn)生明顯的作用，表明CD44HABD對細(xì)胞周期的抑制是內(nèi)皮細(xì)胞特異性的。
實(shí)施例8-CD44HABD的中心結(jié)構(gòu)域?qū)τ谄湟种苾?nèi)皮細(xì)胞增殖的活性是重要的為了著手分析CD44HABD中對抑制內(nèi)皮系增殖的重要區(qū)域，利用PCR制備了幾種CD44的缺失突變體。三聯(lián)突變體CD44HABD被用作模板。CD44HABD的特定寡聚核苷酸與用于PCR擴(kuò)增的載體-特異性引物一起使用，并將產(chǎn)物進(jìn)行連接以便分別得到產(chǎn)生CD44HABD的aa21-60、21-100或93-132的載體。wt和3mut CD44HABD以及缺失突變體21-100、21-60和93-130的序列如圖8所示，所述序列被列為SEQID No.23(21-100)，SEQ ID No.24(21-60)和SEQ ID No.25(93-132)。與內(nèi)皮細(xì)胞增殖有關(guān)的CD44HABD中心區(qū)域的序列被表示為SEQ ID No.26。所有重組蛋白產(chǎn)生于細(xì)菌體內(nèi)并按照實(shí)施例1記載的方法進(jìn)行純化。
在含10％血清的培養(yǎng)基中采用所示蛋白(終濃度分別為15μg/ml和30μg/ml)將指數(shù)生長期的牛肺內(nèi)皮細(xì)胞(CPAE)處理48小時。細(xì)胞增殖通過顯微照相術(shù)(圖8B)或通過MTT染色(Sigma)和分光光度法(圖8C)來測定。如圖8C所示，CD44HABD aa 21-100而非21-60或93-130。因此，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的重要序列含有例如定位在CD44HABD的aa61-100區(qū)域的序列(SEQ ID No.26)。然而，也不能排除側(cè)翼序列在完整CD44 HABD中的貢獻(xiàn)。
序列表<110>Strmblad，StaffanPll，TaaviKogerman，Priit<120>新藥<130>cd44habd<150>SE0102823-2<151>2001-08-24<150>US 60/314,971<151>2001-08-24<160>26<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>336<212>DNA<213>人類(homo sapiens)<400>1cagatcgatt tgaatataac ctgccgcttt gcaggtgtat tccacgtgga gaaaaatggt 60cgctacagca tctctcggac ggaggccgct gacctctgca aggctttcaa tagcaccttg120cccacaatgg cccagatgga gaaagctctg agcatcggat ttgagacctg caggtatggg180ttcatagaag ggcatgtggt gattccccgg atccacccca actccatctg tgcagcaaac240aacacagggg tgtacatcct cacatacaac acctcccagt atgacacata ttgcttcaat300gcttcagctc cacctgaaga agattgtaca tcagtc 336<210>2<211>112<212>PRT<213>人類<400>2Gln Ile Asp Leu Asn Met Thr Cys Arg Phe Ala Gly Val Phe His Val1 5 10 15Glu Lys Asn Gly Arg Tyr Ser Ile Ser Arg Thr Glu Ala Ala Asp Leu20 25 30Cys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Leu Pro Thr Met Ala Gln Met Glu Lys35 40 45Ala Leu Ser Ile Gly Phe Glu Thr Cys Arg Tyr Gly Phe Ile Glu Gly50 55 60His Val Val Ile Pro Arg Ile His Pro Asn Ser Ile Cys Ala Ala Asn65 70 75 80
Asn Thr Gly Val Tyr Ile Leu Thr Ser Asn Thr Ser Gln Tyr Asp Thr85 90 95Tyr Cys Phe Asn Ala Ser Ala Pro Pro Glu Glu Asp Cys Thr Ser Val100 105 110<210>3<211>336<212>DNA<213>犬(canis familiaris)<400>3cgcagatcga tttgaacata acctgccgct acgcaggtgt gttccatgtg gagaaaaacg 60gtcgctacag catctccagg acggcggctg ccgacctctg caaggctttc aacagcaccc120tgcccaccat ggcccagatg gagcgagccc tgagcgtggg ctttgagacc tgcaggtacg180ggttcataga aggacatgtg gtgatccccc gtatccaacc caatgctatt tgtgctgcaa240accatacagg ggtgtacatc ctcatatcca acacctccca gtacgacacg tattgcttca300atgcttcagc tccacctgaa gaggattgta catcgg 336<210>4<211>112<212>PRT<213>犬<400>4Gln Ile Asp Leu Asn Ile Thr Cys Arg Tyr Ala Gly Val Phe His Val1 5 10 15Glu Lys Asn Gly Arg Tyr Ser Ile Ser Arg Thr Ala Ala Ala Asp Leu20 25 30Cys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Leu Pro Thr Met Ala Gln Met Glu Arg35 40 45Ala Leu Ser Val Gly Phe Glu Thr Cys Arg Tyr Gly Phe Ile Glu Gly50 55 60His Val Val Ile Pro Arg Ile Gln Pro Asn Ala Ile Cys Ala Ala Asn65 70 75 80His Thr Gly Val Tyr Ile Leu Ile Ser Asn Thr Ser Gln Tyr Asp Thr85 90 95Tyr Cys Phe Asn Ala Ser Ala Pro Pro Glu Glu Asp Cys Thr Ser Val100 105 110<210>5<211>339<212>DNA
<213>紅原雞(gallus gallus)<400>5cagagacaca attcaatata acttgcagat atggaggagt gtttcatgtg gagaaaaatg 60gtcgctacag tctcacacga gctgaagcaa ttgagctctg tagagctctc aatagtacct120tggcaacact ggagcaattt gaaagagctc atgcacttgg atttgaaacg tgcaggtatg180gttttatagt ggggcatatt gttatcccac gaatcaatcc atatcatctt tgtgcagcaa240atcatacagg catttacaaa ctttcagcaa atacaactgg ccggtatgat gcatattgtt300acaatgcaac agaaacgagg agcaaagcat gtgagccaa 339<210>6<211>113<212>PRT<213>紅原雞<400>6Glu Thr Gln Phe Asn Ile Thr Cys Arg Tyr Gly Gly Val Phe His Val1 5 10 15Glu Lys Asn Gly Arg Tyr Ser Leu Thr Arg Ala Glu Ala Ile Glu Leu20 25 30Cys Arg Ala Leu Asn Ser Thr Leu Ala Thr Leu Val Gln Phe Glu Arg35 40 45Ala His Ala Leu Gly Phe Glu Thr Cys Arg Tyr Gly Phe Ile Val Gly50 55 60His Ile Val Ile Pro Arg Ile Asn Pro Tyr His Leu Cys Ala Ala Asn65 70 75 80His Thr Gly Ile Tyr Lys Leu Ser Ala Asn Thr Thr Gly Arg Tyr Asp85 90 95Ala Tyr Cys Tyr Asn Ala Thr Glu Thr Arg Ser Lys Ala Cys Glu Pro100 105 110Ile<210>7<211>336<212>DNA<213>人類<400>7cagatcgatt tgaatataac ctgccgcttt gcaggtgtat tccacgtgga gaaaaatggt 60gcctacagca tctctcggac ggaggccgct gacctctgca aggctttcaa tagcaccttg120cccacaatgg cccagatgga gaaagctctg agcatcggat ttgagacctg caggtatggg180
ttcatagaag ggcatgtggt gattccccgg atccacccca actccatctg tgcagcaaac240aacacagggg tgtacatcct cacatacaac acctcccagt atgacacata ttgcttcaat300gcttcagctc cacctgaaga agattgtaca tcagtc 336<210>8<211>112<212>PRT<213>人類<400>8Gln Ile Asp Leu Asn Met Thr Cys Arg Phe Ala Gly Val Phe His Val1 5 10 15Glu Lys Asn Gly Ala Tyr Ser Ile Ser Arg Thr Glu Ala Ala Asp Leu20 25 30Cys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Leu Pro Thr Met Ala Gln Met Glu Lys35 40 45Ala Leu Ser Ile Gly Phe Glu Thr Cys Arg Tyr Gly Phe Ile Glu Gly50 55 60His Val Val Ile Pro Arg Ile His Pro Asr Ser Ile Cys Ala Ala Asn65 70 75 80Asn Thr Gly Val Tyr Ile Leu Thr Ser Asn Thr Ser Gln Tyr Asp Thr85 90 95Tyr Cys Phe Asn Ala Ser Ala Pro Pro Glu Glu Asp Cys Thr Ser Val100 105 110<210>9<211>336<212>DNA<213>人類<400>9cagatcgatt tgaatataac ctgccgcttt gcaggtgtat tccacgtgga gaaaaatggt60cgctacagca tctctcggac ggaggccgct gacctctgca aggctttcaa tagcaccttg120cccacaatgg cccagatgga gaaagctctg agcatcggat ttgagacctg cagctctggg180ttcatagaag ggcatgtggt gattccccgg atccacccca actccatctg tgcagcaaac240aacacagggg tgtacatcct cacatacaac acctcccagt atgacacata ttgcttcaat300gcttcagctc cacctgaaga agattgtaca tcagtc 336<210>10<211>112<212>PRT<213>人類
<400>10Gln Ile Asp Leu Asn Met Thr Cys Arg Phe Ala Gly Val Phe His Val1 5 10 15Glu Lys Asn Gly Arg Tyr Ser Ile Ser Arg Thr Glu Ala Ala Asp Leu20 25 30Cys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Leu Pro Thr Met Ala Gln Met Glu Lys35 40 45Ala Leu Ser Ile Gly Phe Glu Thr Cys Ser Ser Gly Phe Ile Glu Gly50 55 60His Val Val Ile Pro Arg Ile His Pro Asn Ser Ile Cys Ala Ala Asn65 70 75 80Asn Thr Gly Val Tyr Ile Leu Thr Ser Asn Thr Ser Gln Tyr Asp Thr85 90 95Tyr Cys Phe Asn Ala Ser Ala Pro Pro Glu Glu Asp Cys Thr Ser Val100 105 110<210>11<211>336<212>DNA<213>人類<400>11cagatcgatt tgaatataac ctgccgcttt gcaggtgtat tccacgtgga gaaaaatggt 60gcctacagca tctctcggac ggaggccgct gacctctgca aggctttcaa tagcaccttg120cccacaatgg cccagatgga gaaagctctg agcatcggat ttgagacctg cagctctggg180ttcatagaag ggcatgtggt gattccccgg atccacccca actccatctg tgcagcaaac240aacacagggg tgtacatcct cacatacaac acctcccagt atgacacata ttgcttcaat300gcttcagctc cacctgaaga agattgtaca tcagtc 336<210>12<211>112<212>PRT<213>人類<400>12Gln Ile Asp Leu Asn Met Thr Cys Arg Phe Ala Gly Val Phe His Val1 5 10 15Glu Lys Asn Gly Ala Tyr Ser Ile Ser Arg Thr Glu Ala Ala Asp Leu20 25 30Cys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Leu Pro Thr Met Ala Gln Met Glu Lys
35 40 45Ala Leu Ser Ile Gly Phe Glu Thr Cys Ser Ser Gly Phe Ile Glu Gly50 55 60His Val Val Ile Pro Arg Ile His Pro Asn Ser Ile Cys Ala Ala Asn65 70 75 80Asn Thr Gly Val Tyr Ile Leu Thr Ser Asn Thr Ser Gln Tyr Asp Thr85 90 95Tyr Cys Phe Asn Ala Ser Ala Pro Pro Glu Glu Asp Cys Thr Ser Val100 105 110<210>13<211>27<212>DNA<213>人工<220>
<223>PCR引物<400>13cgcgaattcc agatcgattt gaatatg 27<210>14<211>27<212>DNA<213>人工<220>
<223>PCR引物<400>14cgcgagctcc ttctaacatg tagtcag 27<210>15<211>30<212>DNA<213>人工<220>
<223>突變引物<400>15gagaaaaatg gtgcctacag catctctcgg 30<210>16<211>29<212>DNA<213>人工<220>
<223>突變引物<400>16agatgctgta ggcaccattt ttctccacg 29
<210>17<211>23<212>DNA<213>人工<220>
<223>突變引物<400>17gacctgcagc tctgggttca tag 23<210>18<211>23<212>DNA<213>人工<220>
<223>突變引物<400>18atgaacccag agctgcaggt ctc 23<210>19<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>RT-PCR-引物<400>19cagagacaca attcaatata 20<210>20<211>17<212>DNA<213>人工<220>
<223>RT-PCR-引物<400>20ttggctcaca tgctttg17<210>21<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>RT-PCR-引物<400>21cgcagatcga tttgaacata 20<210>22<211>19<212>DNA<213>人工
<220>
<223>RT-PCR-引物<400>22ccgatgtaca atcctcttc 19<210>23<211>80<212>PRT<213>人工<220>
<223>缺失突變體<400>23Gln Ile Asp Leu Asn Ile Thr Cys Arg Phe Ala Gly Val Phe His Val1 5 10 15Glu Lys Asn Gly Arg Tyr Ser Ile Ser Arg Thr Glu Ala Ala Asp Leu20 25 30Cys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Leu Pro Thr Met Ala Gln Met Glu Lys35 40 45Ala Leu Ser Ile Gly Phe Glu Thr Cys Ser Ser Gly Phe Ile Glu Gly50 55 60His Val Val Ile Pro Arg Ile His Pro Asn Ser Ile Cys Ala Ala Asn65 70 75 80<210>24<211>40<212>PRT<213>人工<220>
<223>缺失突變體<400>24Gln Ile Asp Leu Asn Ile Thr Cys Arg Phe Ala Gly Val Phe His Val1 5 10 15Glu Lys Asn Gly Ala Tyr Ser Ile Ser Arg Thr Glu Ala Ala Asp Leu20 25 30Cys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Leu35 40<210>25<211>38<212>PRT<213>人工<220>
<223>缺失突變體
<400>25Ser Ile Cys Ala Ala Asn Asn Thr Gly Val Tyr Ile Leu Thr Tyr Asn1 5 10 15Thr Ser Gln Tyr Asp Thr Tyr Cys Phe Asn Ala Ser Ala Pro Pro Glu20 25 30Glu Asp Cys Thr Ser Val35<210>26<211>40<212>PRT<213>人工<220>
<223>缺失突變體<400>26Pro Thr Met Ala Gln Met Glu Lys Ala Leu Ser Ile Gly Phe Glu Thr1 5 10 15Cys Ser Ser Gly Phe Ile Glu Gly His Val Val Ile Pro Arg Ile His20 25 30Pro Asn Ser Ile Cys Ala Ala Asn35 40
權(quán)利要求
1.含CD44-透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)(CD44-HABD)的非-HA-結(jié)合變體的分子及其類似物、重組的和突變的變體或其片段用于生產(chǎn)治療與血管生成和/或內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制相關(guān)病癥的藥物的用途。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其中CD44-HABD含有至少一個突變，從而使其成為非-HA-結(jié)合的。
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其中所述突變選自F34A、F34Y、K38R、K38S、R41A、Y42F、Y42S、R46S、E48S、K54S、Q65S、K68S、R78K、R78S、Y79F、Y79S、N100A、N100R、N101S、Y105F、Y105S、S112R、Y114F、F119A和F119Y，優(yōu)選地選自R41A、R78S和Y79S。
4.如權(quán)利要求1-3中所述的用途，其中CD44-透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)與序列SEQ ID NO2具有至少55％、更優(yōu)選地至少65％、最優(yōu)選地至少75％的同源性。
5.如權(quán)利要求1-4中所述的用途，其中所述重組變體是含有CD44-HABD部分和GST-部分的融合蛋白，其中CD44-HABD-部分為非-HA-結(jié)合形式。
6.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中含CD44-透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)的非-HA-結(jié)合變體的分子選自人CD44-HABD(SEQ ID NO2)，狗CD44-HABD(SEQ ID NO4)，小雞CD44-HABD(SEQ ID NO6)，人CD44-HABD-R41A(SEQ ID NO8)，人CD44-HABD-R78SY79S(SEQ IDNO10)，CD44-HABD-R41AR78SY79S(SEQ ID NO12)，CD44-HABD(21-100)(SEQ ID NO23)和CD44-HABD(61-100)(SEQ IDNO26)，上述序列進(jìn)一步含有至少一個修飾，從而使它們成為非-HA-結(jié)合性質(zhì)的。
7.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述分子源自人、狗、小雞、靈長目動物、大鼠或小鼠。
8.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中待治療的病癥選自引起失明的眼疾或視力損傷如黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病和視網(wǎng)膜低氧癥，慢性炎癥如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、動脈粥樣硬化、再狹窄，以及癌生長和轉(zhuǎn)移，以及所有類型的癌癥和腫瘤如乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、皮膚癌、肝癌、腦癌、卵巢癌、睪丸癌、骨癌、上皮癌、內(nèi)皮癌、胰腺癌、腎癌、肌肉癌、腎上腺癌、腸癌、內(nèi)分泌腺癌、口腔癌、頭癌和頸癌或其它實(shí)體組織源癌癥或任何形式的白血病以及血管瘤。
9.含CD44-透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)的變體的分子及其類似物、重組的和突變的變體或其片段用于靶向內(nèi)皮細(xì)胞的用途。
10.如權(quán)利要求9所述的用途，其中所述分子還含有具有化療和/或基因治療特性的部分。
11.含有CD44-HABD部分、GST-部分和/或具有化療特性的部分的重組分子，其中所述CD44-HABD部分進(jìn)行了選自以下突變中的至少一種突變F34A，F(xiàn)34Y，K38R，K38S，R41A，Y42F，Y42S，R46S，E48S，K54S，Q65S，K68S，R78K，R78S，Y79F，Y79S，N100A，N100R，N101S，Y105F，Y105S，S112R，Y114F，F(xiàn)119A，F(xiàn)119Y，優(yōu)選地選自R41A、R78S和Y79S。
12.如權(quán)利要求11所述的重組分子，其中CD44-HABD部分被定義為SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO23、SEQ ID NO26中的任一個氨基酸序列的修飾的變體。
13.如權(quán)利要求11或12所述的重組分子，其中CD44-HABD部分由與SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11中的任意一個核苷酸序列具有至少55％的同源性、優(yōu)選65％的同源性、更優(yōu)選地75％的同源性的序列所編碼，最優(yōu)選地是由SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ IDNO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11中的任意一個核苷酸序列所編碼，其中所述核苷酸序列是一種修飾的形式。
14.如權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)所述的重組分子，用于醫(yī)藥用途。
15.含有至少一種權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述分子的藥物組合物，混合或結(jié)合至少一種藥用載體或賦形劑。
16.用于治療受試者的腫瘤或其它相關(guān)疾病的方法，包括施用藥學(xué)劑量的權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的分子。
17.篩選權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述分子的結(jié)合配偶體的方法，該方法包括以下步驟a)提供含CD44-透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)的分子；b)使?jié)撛诮Y(jié)合配偶體與所述分子接觸；和c)測定所述分子對所述潛在結(jié)合配偶體的作用。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中潛在結(jié)合配偶體選自蛋白、糖蛋白、蛋白聚糖、硫酸乙酰肝素、脂質(zhì)、聚糖、糖苷和糖。
19.如權(quán)利要求17或18所述的方法，其中潛在結(jié)合配偶體是受體分子、受體分子的一部分、與細(xì)胞表面受體分子結(jié)合的分子或定位在細(xì)胞表面而不是受體分子的分子。
20.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述分子的結(jié)合配偶體，是由權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)所述方法發(fā)現(xiàn)的。
21.用于實(shí)施權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)所述方法的試劑盒，該試劑盒包含獨(dú)立小瓶中的權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的分子和權(quán)利要求20的潛在結(jié)合配偶體。
全文摘要
CD44，透明質(zhì)酸的受體，在細(xì)胞生理學(xué)、細(xì)胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移方面具有復(fù)雜的功能。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人CD44受體在小鼠纖維肉瘤細(xì)胞中過表達(dá)抑制小鼠體內(nèi)的皮下腫瘤生長[Kogerman等，Oncogene 1997；151407－16；Kogerman等，Clin Exp Metastasis 1998；1683－93]。其中表明CD44對腫瘤生長的抑制作用是由于阻斷血管的生成而引起的。而且，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)了可溶性重組CD44透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)(CD44HABD)抑制小雞和小鼠體內(nèi)的血管生成，因而抑制人的各種來源的腫瘤生長。CD44－HABD的抗血管生成作用不依賴于與透明質(zhì)酸(HA)的結(jié)合，這是由于CD44HABD的非－HA－結(jié)合的突變體仍然保留了抗血管生成特性。本發(fā)明公開了建立在靶向血管細(xì)胞表面受體基礎(chǔ)上的可溶性CD44重組蛋白作為新型血管生成抑制劑。還公開了一種利用重組CD44蛋白及其類似物阻斷血管生成和人體腫瘤治療的方法。本發(fā)明的另一個實(shí)施方案提供了一種利用CD44重組蛋白及其類似物篩選新型藥物靶物的方法。
文檔編號C07K19/00GK1561223SQ02819275
公開日2005年1月5日 申請日期2002年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月24日
發(fā)明者斯塔凡·斯特倫布拉德, 普里特·科格曼, 塔維·帕爾 申請人:斯塔凡·斯特倫布拉德, 普里特·科格曼, 塔維·帕爾