專利名稱：海藻中提取鐵超氧化物歧化酶的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從海藻中提取鐵超氧化物歧化酶的方法。
背景技術：
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，簡稱SOD)是一類廣泛存在于生物體內的金屬酶。目前人們按金屬輔基的不同已發(fā)現(xiàn)了四種SOD，分別是Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD和Ni-SOD。由于SOD能清除生物氧化產生的氧自由基而起保護細胞的作用，對氧自由基引起的許多疾病都有較好的療效，并可減慢機體衰老，所以將SOD開發(fā)應用為藥物具有積極的意義。大量實驗證明，SOD具有防止脂質過氧化、抗衰老、治療冠心病、再灌流損傷(器官移植等)、關節(jié)炎、自身免疫、放射病及化療引起的骨髓損傷等疾病的作用。它作為一類新型的治療酶制劑和化妝品新原料在臨床治療及機體保護方面都有著重要的意義。
含鐵超氧化物歧化酶(Fe-SOD)呈黃褐色，主要存在于原核細胞和真核細胞的基質中。海藻(例如螺旋藻)中的鐵超氧化物歧化酶不僅含量較高，而且海藻的來源豐富，是Fe-SOD的大規(guī)模生產的好材料。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供從海藻中提取鐵超氧化物歧化酶的方法。
海藻中提取鐵超氧化物歧化酶的方法，包括以下步驟1)取新鮮海藻以1∶2～3的重量體積比加入pH值7～8、濃度為50～l00mmol/L、含0.5mmol/L EDTA的磷酸緩沖液，將混和液進行超聲破碎，破碎液離心，取上清；2)將上清在50℃～55℃水浴中不斷攪拌，進行熱變性處理，去雜蛋白；3)離心步驟2)所得上清液，加入(NH4)2SO4至飽和濃度40～50％，靜置數(shù)小時，再離心、取上清，在上清液中加(NH4)2SO4至飽和濃度85％，靜置數(shù)小時，離心、取沉淀；4)取步驟3)所得沉淀，用pH值7～8的磷酸緩沖液溶解，上Sephadex G-25脫鹽柱，用自動收集器收集酶活性部分；5)將步驟4)收集的酶活性部分上陰離子DEAE-Sepharose Fast Flow交換層析柱，用pH值7.0～8.0的磷酸緩沖溶液作梯度洗脫，鹽梯度為0～0.8mol/LNaCl，收集酶活性部分；6)將步驟5)收集的酶活性部分經透析后上陽離子CM-Sepharose Fast Flow交換層析柱，用pH值5.0～5.8的醋酸緩沖液作梯度洗脫，鹽梯度為0～0.8mol/L NaCl，流速控制在12ml/min，再收集酶活性部分；7)將步驟6)收集的活性部分上分子篩Sephadex G-100/SephadexG75柱，用pH值7～8的磷酸緩沖液洗脫，收集活性峰，活性峰用雙蒸水透析，透析完全得樣品溶液，用聚乙二醇20,000濃縮，凍干，即得含鐵超氧化物歧化酶。
本發(fā)明以新鮮海藻為原料，加入的磷酸緩沖液的pH值為7至8、濃度為50至100mmol/L，這樣才能有效的抑制海藻中蛋白水解酶的活性，保證Fe-SOD酶的活性。
本發(fā)明中，采用大功率超聲破碎儀(3～5KW)進行超聲破碎，顯微鏡檢細胞完全破碎為止，使細胞內的Fe-SOD完全釋放出來。
本發(fā)明中，步驟2)將上清在50℃～55℃水浴中不斷攪拌，在50℃大部分蛋白變性而沉淀，F(xiàn)e-SOD能耐受較高溫度仍溶解在上清液中，但水溫一般不超過55℃，否則Fe-SOD將發(fā)生變性而失活。
本發(fā)明中，步驟3)加入(NH4)2SO4采用分級鹽析，每級鹽析的時間一般6小時以上，以保證鹽析完全。
本發(fā)明中，步驟4)沉淀，用pH值7～8的磷酸緩沖液溶解，上Sephadex G-25柱脫鹽，而不用透析方法，主要考慮工業(yè)生產的自動化，且快速省時省力，避免了透析法的煩瑣。
本發(fā)明，步驟5)和步驟6)中使用的柱層析，填充料采用Sepharose Fast Flow作為層析介質，一是Sepharose Fast Flow可承受較大壓力使流速加快，提高分離效率，二是Sepharose Fast Flow可反復使用，不易破碎。
本發(fā)明由于是從天然材料中提取鐵超氧化物歧化酶(Fe-SOD)，海藻原料充足，不存在緊缺現(xiàn)象，同時材料成本相對于提取產品來說也是十分低廉。得到的產品比活相當高，活力損失相對較小，可以滿足一般的醫(yī)藥需求，并且符合當代人“崇尚自然，回歸自然”的心理需求，不存在轉基因生產導致的基因污染問題。工藝中采用了DEAE-Sepharose Fast Flow和CM-Sepharose Fast Flow兩種層析材料，其特點是流速快、可大量分離樣品，同時可反復再生利用，能實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產，具體實施方式
以下通過實施例進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不局限于此實施例。
實施例海藻中提取鐵超氧化物歧化酶的方法，包括以下步驟(1)取新鮮螺旋藻5Kg加入2倍體積pH值7.6、濃度為50mmol/L、含0.5mmol/L EDTA的磷酸緩沖液，冰浴超聲波破碎，直至鏡檢細胞完全破碎為止。破碎液10000rpm、離心30min，取上清液。留樣I，測酶活。
(2)上清液在50℃水浴中，熱變性處理1小時，期間用攪拌機不斷溫和攪拌，使加熱均勻。
(3)熱處理后的樣品溶液10000rpm、離心30min，取上清液。留樣II，測酶活。高速離心后的上清液加(NH4)2SO4至45％飽和濃度，8小時后，10000rpm、離心30min，再取上清液。上清液繼續(xù)鹽析，加(NH4)2SO4至85％飽和濃度，8小時后，10000rpm、離心30min，取沉淀。
(4)沉淀用pH值7.6、濃度為10mmol/L、含0.5mmol/L EDTA的磷酸緩沖液溶解，上Sephadex G-25柱(φ5×100cm)進行脫鹽，用自動收集器收集酶活性部分。
(5)脫鹽后的樣品溶液上陰離子DEAE-Sepharose Fast Flow交換層析柱。事先將已處理好的DEAE-Sepharose Fast Flow裝入層析柱(φ10×60cm)中，用pH值7.6、濃度為10mmol/L、含0.5mmol/L EDTA的磷酸緩沖液平衡過夜，體積大約為柱體積的3～5倍。樣品上柱，用pH值7.6、10mmol/L、含0.5mmol/LEDTA的磷酸緩沖液作梯度洗脫，鹽梯度為0～0.8mol/L NaCl，收集酶活性部分。
(6)將收集的酶活性部分用pH值5.5、濃度為2.5mmol/L、含0.5mmol/L EDTA的醋酸緩沖液透析，每隔2～3hr，換透析液1次共換4～5次。留樣IV，測酶活。透析完全的樣品溶液上陽離子CM-Sepharose Fast Flow交換層析柱。事先將已處理的CM-Sepharose Fast Flow裝入層析柱(φ10×60cm)中，用pH值5.5、濃度為2.5mmol/L、含0.5mmol/L EDTA的醋酸緩沖液平衡過夜，體積大約為柱體積的3～5倍。樣品上柱，用pH值5.5、濃度為2.5mmol/L、含0.5mmol/L EDTA的醋酸緩沖液梯度洗脫，鹽梯度為0～0.8mol/L NaCl，流速控制在12ml/min，收集酶活性部分。
(7)將收集的酶活性部分，上Sephadax G-100分子篩柱(φ5.0×100cm)。事先將已處理好的Sephadex G-100裝入層析柱中，用pH7.6、濃度為10mmol/L、含0.5mmol/L EDTA的磷酸緩沖液平衡過夜，體積大約為柱體積的3～5倍。樣品上柱后，用pH7.6，濃度為10mmol/L、含0.5mmol/L EDTA的磷酸緩沖液洗脫。流速控制在2ml/min，部分收集器收集酶活性峰，用重蒸水透析，每隔3～4hr換透析液1次，共換4～5次。透析完全的樣品溶液聚乙二醇20000濃縮，凍干，共得Fe-SOD凍干粉末820mg。
最后得到得產品為淺灰色粉末，經鄰苯三酚的自氧化法測定，SOD比活可達到3500U/mg以上。
權利要求
1.海藻中提取含鐵超氧化物歧化酶的方法，其特征是包括以下步驟1)取新鮮海藻以1∶2～3的重量體積比加入pH值7～8、濃度為50～100mmol/L、含0.5mmol/L EDTA的磷酸緩沖液，將混和液進行超聲破碎，破碎液離心，取上清；2)將上清在50℃～55℃水浴中不斷攪拌，進行熱變性處理，去雜蛋白；3)離心步驟2)所得上清液，加入(NH4)2SO4至飽和濃度40～50％，靜置數(shù)小時，再離心、取上清，在上清液中加(NH4)2SO4至飽和濃度85％，靜置數(shù)小時，離心、取沉淀；4)取步驟3)所得沉淀，用pH值7～8的磷酸緩沖液溶解，上Sephadex G-25脫鹽柱，用自動收集器收集酶活性部分；5)將步驟4)收集的酶活性部分上陰離子DEAE-Sepharose Fast Flow交換層析柱，用pH7.0～8.0的磷酸緩沖溶液作梯度洗脫，鹽梯度為0～0.8mol/LNaCl，收集酶活性部分；6)將步驟5)收集的酶活性部分經透析后上陽離子CM-Sepharose Fast Flow交換層析柱，用pH值5.0～5.8的醋酸緩沖溶液作梯度洗脫，鹽梯度為0～0.8mol/L NaCl，流速控制在12ml/min，再收集酶活性部分；7)將步驟6)收集的活性部分上分子篩Sephadex G-100/SephadexG75柱，用pH值7～8的磷酸緩沖液洗脫，收集活性峰，活性峰用雙蒸水透析，透析完全得樣品溶液，用聚乙二醇20000濃縮，凍干，即得含鐵超氧化物歧化酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了從海藻中提取鐵超氧化物歧化酶(Fe－SOD)的方法。由于該方法是從天然材料中提取鐵超氧化物歧化酶，海藻原料充足，不存在緊缺現(xiàn)象，同時材料成本相對于提取產品來說也是十分低廉。得到的產品比活相當高，活力損失相對較小，可以滿足一般的醫(yī)藥需求，并且符合當代人“崇尚自然，回歸自然”的心理需求，不存在轉基因生產導致的基因污染問題。工藝中采用了DEAE－Sepharose Fast Flow和CM－Sepharose Fast Flow兩種層析材料，其特點是流速快、可大量分離樣品，同時可反復再生利用，能實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產。
文檔編號C07K1/36GK1415748SQ02150920
公開日2003年5月7日 申請日期2002年11月28日 優(yōu)先權日2002年11月28日
發(fā)明者龔興國, 曾冬云, 周遠 申請人:浙江大學