專(zhuān)利名稱(chēng)：蜘蛛拖牽絲蛋白基因在轉(zhuǎn)基因家蠶中時(shí)空表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明專(zhuān)利涉及蜘蛛拖牽絲和家蠶絲蛋白L鏈的氨基酸序列及其空間結(jié)構(gòu)，更具體涉及一種蜘蛛拖牽絲蛋白基因在轉(zhuǎn)基因家蠶中高效時(shí)空表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法。
目前，國(guó)外在大腸桿菌和酵母菌中成功地表達(dá)了蜘蛛絲蛋白基因，但不能形成具有天然纖維特殊機(jī)械性能的產(chǎn)物。對(duì)由蛋白到天然絲纖維的分泌加工過(guò)程人們了解得不多，這是人造蛛絲纖維的最大障礙。因此，上述技術(shù)路線，短期內(nèi)難以達(dá)到產(chǎn)業(yè)化的程度。家蠶作為生物反應(yīng)器合成具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的多肽、蛋白等，已引起眾多研究者和投資者的極大興趣。但目前，在以家蠶作為外源基因受體的研究中，還存在一些不足之處(1)大多數(shù)的研究均有外源基因整合不穩(wěn)定、傳種接代不穩(wěn)定的缺點(diǎn)；(2)家蠶絲心蛋白的合成加工、運(yùn)輸、分泌機(jī)理還不太明了，因而應(yīng)用上受到限制，技術(shù)操作上工作量大，外源基因的家蠶轉(zhuǎn)化多為非穩(wěn)定整合的瞬間表達(dá)。
本發(fā)明專(zhuān)利的目的是提供了一種蜘蛛拖牽絲蛋白基因在家蠶中時(shí)空表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建的方法，將來(lái)自Trichoplusia ni的轉(zhuǎn)座子pigg-yBac改造成為轉(zhuǎn)基因載體，能夠穩(wěn)定地將目的基因轉(zhuǎn)移并整合在家蠶基因組中，操作方便，轉(zhuǎn)化率高。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施構(gòu)建的家蠶轉(zhuǎn)基因載體系統(tǒng)，包括兩個(gè)質(zhì)粒，其中之一含有一個(gè)目的基因表達(dá)單元和一個(gè)GFP基因標(biāo)記單元，以便于轉(zhuǎn)基因家蠶的篩選和外源基因的表達(dá)。該DNA區(qū)域兩側(cè)各有一段轉(zhuǎn)座子的末端重復(fù)序列，以便于轉(zhuǎn)座酶的識(shí)別，實(shí)現(xiàn)在家蠶基因組中的高頻率整合。另一個(gè)載體為帶有轉(zhuǎn)座酶編碼區(qū)的輔助質(zhì)粒。該載體系統(tǒng)的特征在于基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的構(gòu)建，蜘蛛拖牽絲基因與蠶絲蛋白L鏈cDNA融合，并置于L鏈基因啟動(dòng)子之后；家蠶轉(zhuǎn)座因子被改造成為整合型載體，形成家蠶基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，人工合成多克隆位點(diǎn)區(qū)和兩末端重復(fù)序列。蜘蛛融合基因在家蠶中得到時(shí)空表達(dá)。將蜘蛛絲蛋白基因4.4Kb的DNA片段插入0.7Kb的蠶絲蛋白L鏈cDNA片段末端，再將形成的融合片段置于L鏈基因5’端的1.5Kb的啟動(dòng)子區(qū)域后；家蠶轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)來(lái)自Trich-oplusia ni的轉(zhuǎn)座子pigg-yBac改造成為家蠶轉(zhuǎn)基因載體，轉(zhuǎn)座子的兩末端重復(fù)序列之間的序列被GFP基因取代，并加上多克隆位點(diǎn)，轉(zhuǎn)座酶基因的DNA片段克隆至另一載體中。人工合成轉(zhuǎn)座子pigg-yBac的兩端重復(fù)序列，包括在PCR引物中，其中上游引物的重復(fù)末端后還接上一個(gè)帶有一段長(zhǎng)為20bp的多克隆位點(diǎn)區(qū)的人工接頭。


圖1基因轉(zhuǎn)移載體的物理圖譜示意2融合基因的構(gòu)建示意3轉(zhuǎn)基因家蠶的篩選示意4轉(zhuǎn)基因家蠶的Southern雜交分析示意圖下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述依據(jù)圖1可知，載體的構(gòu)建路徑如下首先根據(jù)已知的GFP基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)用于擴(kuò)增GFP基因的PCR引物，將轉(zhuǎn)座因子兩端重復(fù)序列設(shè)計(jì)在PCR上、下游引物的末端，引物的核苷酸序列為上游引物5’-GTGAATTCCCCTAGAAAGATACC GCGGCTGCAGATGAGCAAGGGCG-3’下游引物5’-TCGAATTCCCCTAGAAAGATACT GCAGCCTTGTACAGCTCG-3’擴(kuò)增出片段后，再在片段上游加上一個(gè)帶有一段長(zhǎng)20bp的多克隆位點(diǎn)區(qū)(MCS)的人工接頭；其次，將該擴(kuò)增DNA片段克隆在載體pBS中，并在GFP基因編碼區(qū)前面加入家蠶組成型表達(dá)的基因啟動(dòng)子，其后面接相應(yīng)的終止子序列，構(gòu)建成功家蠶基因的運(yùn)載質(zhì)粒；第三，將轉(zhuǎn)座子中的轉(zhuǎn)座酶編碼區(qū)序列采用PCR技術(shù)克隆至質(zhì)粒pUC18中，編碼區(qū)前邊加上基因啟動(dòng)子，后面接相應(yīng)的終止子序列，即為基因轉(zhuǎn)移的輔助質(zhì)粒。二者共同構(gòu)成了家蠶基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以確保外源目的基因在家蠶基因組中的多拷貝、高頻率整合，進(jìn)一步提高外源基因的表達(dá)水平。因此，研制的整合載體，通過(guò)轉(zhuǎn)座的方式，可實(shí)現(xiàn)外源基因在家蠶基因組中高頻率的整合，轉(zhuǎn)化頻率可達(dá)0.5％；按照?qǐng)D2所知，顯示的是融合基因的構(gòu)建過(guò)程，首先提取家蠶后部絲腺中的mRNA，根據(jù)已知的家蠶絲心L鏈蛋白基因的序列，設(shè)計(jì)上、下游引物，RT-PCR擴(kuò)增，從而獲得家蠶絲心蛋白L鏈cDNA，大約為0.7Kb，從家蠶總DNA中，根據(jù)已知的L鏈5’端設(shè)計(jì)上、下游引物，擴(kuò)增出L鏈5’端及其上游的啟動(dòng)子區(qū)域的DNA片段，其中包括信號(hào)肽序列，將上述片段按正確的讀碼框連接成融合的L鏈基因，將已有的蜘蛛拖牽絲基因SP14.4kb片段插入到L鏈的3’末端區(qū)域第7個(gè)外顯子之中，構(gòu)建成L-SP1融合片段，根據(jù)已知的L鏈基因終止子序列合成PCR上下游引物，PCR擴(kuò)增出L鏈基因基因終止子片段，大小為0.5Kb，將該終止子片段插入到L-SP1融合基因編碼區(qū)后，形成完整的L-SP1融合基因。
根據(jù)圖3可知，顯示家蠶的基因轉(zhuǎn)化和篩選。把上述構(gòu)建的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，用顯微注射儀注入家蠶蠶卵中，25℃培養(yǎng)，孵化，形成蟻蠶，用桑葉喂養(yǎng)，形成5齡幼蠶的第二天，即可用于轉(zhuǎn)基因家蠶的鑒定，初步鑒定出的轉(zhuǎn)基因家蠶，用于繼代培養(yǎng)，為孟德?tīng)柺竭z傳。研究中，注射了2000只蠶卵中，形成795條幼蠶，420條能形成產(chǎn)卵的蛾子，G0代中0.7％顯示熒光蛋白陽(yáng)性。用350nm-390nm熒光檢驗(yàn)儀，初步鑒定轉(zhuǎn)基因蠶。對(duì)轉(zhuǎn)基因家蠶進(jìn)行繼代培養(yǎng)，將獲得的熒光蛋白陽(yáng)性家蠶進(jìn)行回交和姊妹交配，將產(chǎn)下的蠶卵分為兩份，一份采用熒光蛋白基因的上下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若顯示陰性，棄去另一份蠶卵，若為陽(yáng)性，則保留另一份，并于5齡以后第二天，再用熒光檢測(cè)，取其中部分陽(yáng)性個(gè)體，提取總DNA，PCR快速分子鑒定，對(duì)陽(yáng)性個(gè)體的總DNA進(jìn)行Southern雜交分析(圖4為以蜘蛛拖牽絲基因特異性片段為探針進(jìn)行的Southern雜交的結(jié)果)。對(duì)陽(yáng)性個(gè)體進(jìn)一步進(jìn)行姊妹交，以純化轉(zhuǎn)基因家蠶至到G3代，獲得的G3后代陽(yáng)性個(gè)體即為外源基因整合的轉(zhuǎn)基因家蠶。抽取后部絲腺的蛋白質(zhì)，抽檢蠶繭中的蛋白質(zhì)，進(jìn)行SDS-PAGE分析等系列鑒定，結(jié)果表明蜘蛛絲蛋白含量高。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果方法易行，操作簡(jiǎn)便，轉(zhuǎn)化率高，經(jīng)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因家蠶的蠶絲中蛛絲含量為30％，為獲得蜘蛛絲纖維開(kāi)辟了新的途徑，具有顯著的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。
權(quán)利要求
1.一種蜘蛛拖牽絲蛋白基因在家蠶中時(shí)空表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的構(gòu)建，蜘蛛拖牽絲基因與蠶絲蛋白L鏈cDNA融合，并置于L鏈基因啟動(dòng)子之后；轉(zhuǎn)座因子被改造成為整合型載體，形成家蠶基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)；人工合成多克隆位點(diǎn)區(qū)和兩末端重復(fù)序列。
2.按權(quán)利要求1所述的一種蜘蛛拖牽絲蛋白基因在家蠶中時(shí)空表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于將蜘蛛拖牽絲蛋白基因4.4Kb的DNA片段插入蠶絲蛋白L鏈cDNA 0.7Kb的DNA片段末端外顯子之中，再將形成的融合片段置于L鏈基因5’端1.5Kb的啟動(dòng)子區(qū)域后。
3.按權(quán)利要求1所述的一種蜘蛛拖牽絲蛋白基因在家蠶中時(shí)空表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于家蠶轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)來(lái)自Trichoplusia ni的轉(zhuǎn)座子pigg-yBac改造成為轉(zhuǎn)基因載體，轉(zhuǎn)座因子的兩個(gè)反向重復(fù)末端之間的序列被GFP基因取代，并加上多克隆位點(diǎn)，轉(zhuǎn)座酶基因的DNA片段克隆至另一載體中。
4.按權(quán)利要求1或3所述的一種蜘蛛拖牽絲蛋白基因在家蠶中時(shí)空表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于人工合成轉(zhuǎn)座子pigg-yBac的兩端重復(fù)序列，包括在PCR引物中，其中上游引物的重復(fù)末端后還接上一個(gè)帶有一段長(zhǎng)為20bp的多克隆位點(diǎn)區(qū)的人工接頭。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種蜘蛛拖牽絲蛋白基因在家蠶中時(shí)空表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法。應(yīng)用DNA重組技術(shù)將蜘蛛拖牽絲蛋白基因與家蠶絲蛋白L鏈cDNA融合,并置于L鏈基因啟動(dòng)子之后構(gòu)建成完整的融合基因。將來(lái)自Trichoplusia ni的轉(zhuǎn)座子piggy－Bac改造成為轉(zhuǎn)基因的載體,包括兩個(gè)質(zhì)粒,一個(gè)用于目的基因的轉(zhuǎn)運(yùn),一個(gè)用作輔助質(zhì)粒。將構(gòu)建的融合基因插入基因轉(zhuǎn)移載體,注射到蠶卵中,獲得多個(gè)轉(zhuǎn)基因家蠶,蜘蛛拖牽絲基因和GFP標(biāo)記基因穩(wěn)定整合于家蠶基因組中,拖牽絲基因獲得表達(dá)。本發(fā)明方法易行,操作簡(jiǎn)便,轉(zhuǎn)化率高,家蠶的蠶絲中蛛絲含量為30%。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1362520SQ0110640
公開(kāi)日2002年8月7日 申請(qǐng)日期2001年1月2日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月2日
發(fā)明者劉天艷, 劉輝芬, 李維, 趙力賓 申請(qǐng)人:成都天友發(fā)展有限公司