專利名稱：從動物血液中提取血紅素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種血紅素的提取方法，特別是涉及一種利用血紅素在不同酸堿度溶液中溶解性不同的性質(zhì)提取血紅素的方法。
血紅素是從豬血或其它動物血液中提取出來的一種含鐵的卟啉化合物，它是制備抗癌特效藥——血卟啉衍生物藥物的主要原料，也是一種高效的天然補(bǔ)Fe2+劑，可用于治療缺鐵性貧血和鉛中毒，還可以作為食品制作中的色素添加劑，應(yīng)用范圍十分廣闊，市場上供不應(yīng)求。
關(guān)于血紅素的提取方法，迄今已有多種方法報(bào)導(dǎo)。其中最常用的方法是冰乙酸法，該方法是將動物血液與冰乙酸、NaCl混合后，在90℃下加熱回流，靜置得到血紅素結(jié)晶，經(jīng)洗滌干燥后獲得產(chǎn)品，其中的冰乙酸經(jīng)蒸餾回收后再循環(huán)利用。目前的工業(yè)生產(chǎn)中大都采用此方法，但其缺點(diǎn)是冰乙酸耗用量大，成本高，而且從溶解有蛋白質(zhì)的冰乙酸廢液中蒸餾回收冰乙酸，處理比較困難。丙酮鹽酸法是另外一種提取血紅素的常用方法，該方法需要采用新鮮的動物血液作為原料，即需要在新鮮血液中加入抗凝血劑檸檬酸鈉，放置分層，除去上層血清后，利用新鮮的血細(xì)胞作為提取原料，用鹽酸丙酮溶液提取血細(xì)胞中的血紅素，過濾除去沉淀物后，濾液中加入醋酸鈉的氫氧化鈉溶液，靜置析出血紅素沉淀，洗滌干燥后獲得產(chǎn)品。該方法得到的血紅素產(chǎn)品純度不高，需要進(jìn)一步精制，而且工藝中丙酮用量很大，由于丙酮是易揮發(fā)物質(zhì)，使得工藝操作和設(shè)備要求比較嚴(yán)格苛刻，工藝制備比較復(fù)雜。
堿基物有機(jī)溶劑法和離子交換法是另外兩種提取血紅素的方法。堿基物有機(jī)溶劑法是利用含堿基物質(zhì)的有機(jī)溶劑，使得血細(xì)胞中的珠蛋白與血紅素分離從而獲取血紅素的方法，其中的堿基試劑如二乙氨、吡啶等有機(jī)胺對人體有毒副作用，有機(jī)溶劑的揮發(fā)性也比較大，特別是在血紅素的制備操作中需要反復(fù)多次進(jìn)行離心、升溫和降溫，步驟繁瑣、復(fù)雜，使生產(chǎn)成本增加許多。離子交換法是將血紅素吸附在離子交換樹脂上，再用適當(dāng)?shù)南疵搫┙馕聛淼闹苽溲t素方法，離子交換法獲得的血紅素純度較高，但是該方法制備數(shù)量有限，需要耗用大量的淋洗劑和解吸劑，而且離子交換樹脂使用幾次后需要進(jìn)行再生處理，制備工藝比較復(fù)雜。
本發(fā)明的目的是提供一種簡便、快速提取血紅素的方法，以適合工業(yè)化大批量生產(chǎn)。
本發(fā)明是利用血紅素能夠溶解于堿性溶液中的性質(zhì)，在由除去血清的凝固血塊制成的血勻漿中加入堿性溶液，攪拌使血紅素充分完全溶解到堿性溶液中，與不溶于堿性溶液的珠蛋白分離，過濾除去珠蛋白后的濾液用鹽酸調(diào)節(jié)pH=2-3，靜置使析出血紅素沉淀，收集沉淀，經(jīng)洗滌烘干后，得到純的血紅素產(chǎn)品。
經(jīng)過試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)多種不同組合的堿性溶液都具有使血紅素與珠蛋白分離的作用，本發(fā)明采用的堿性溶液是下述溶液組合中的一種a)1mol/L(NH4)2SO4堿性溶液，稱取132g(NH4)2SO4，用0.4mol/LNaOH溶液溶解并定容至1000mL；b)1.5mol/L NaCl堿性溶液，稱取87gNaCl，用0.4mol/L NaOH溶液溶解并定容至1000mL；c)1mol/L Na2SO4堿性溶液，稱取117gNa2SO4，用0.4mol/L NaOH溶液溶解并定容至1000mL；d)1mol/L Zn(OH)2堿性溶液，稱取99gZn(OH)2，用0.4mol/L NaOH溶液溶解并定容至1000mL；e)0.8mol/L CuSO4堿性溶液，稱取200g CuSO4·5H2O，用0.4mol/LNaOH溶液溶解并定容至1000mL；f)0.5mol/L Pb(Ac)2堿性溶液，稱取135gPb(Ac)2，用0.4mol/L NaOH溶液溶解并定容至1000mL；g)60％堿性丙酮溶液，0.4mol/L NaOH溶液400mL與600mL丙酮混合；h)70％堿性甲醇溶液，0.4mol/L NaOH溶液300mL與700mL甲醇混合；f)60％堿性乙醇溶液，0.4mol/L NaOH溶液400mL與600mL乙醇混合；i)30％三氯乙酸堿性溶液，稱取300g三氯乙酸，用1mol/L NaOH溶解并定容至1000mL。
其中堿性溶液中的溶劑除采用NaOH溶液外，還可以用KOH溶液、NH3·H2O溶液等替代。
用于分離溶解血紅素的堿性溶液的用量是血勻漿體積的2-3倍。
在向溶解有血紅素的堿性溶液中加入鹽酸之前，應(yīng)先將堿性溶液在60℃-80℃下進(jìn)行常壓蒸餾或者在1Kpa-2Kpa真空度下進(jìn)行減壓蒸餾，一方面除去溶液中的可揮發(fā)物質(zhì)，另一方面蒸走溶液中的大部分水分，使溶液濃度增加，便于血紅素的沉淀析出。
加入的沉淀劑鹽酸的濃度為1mol/L。
沉淀得到的血紅素產(chǎn)品經(jīng)洗滌后應(yīng)在60℃-70℃溫度下烘干。
本發(fā)明所提供的血紅素提取方法工藝簡單，操作容易，適合于工業(yè)化大批量生產(chǎn)，生產(chǎn)周期短、回收率高。而且本發(fā)明采用的溶劑對人體無毒副作用，使用安全，對生產(chǎn)設(shè)備也無特殊要求，生產(chǎn)成本低。
以下是本發(fā)明的幾個具體應(yīng)用實(shí)施例。
實(shí)施例1取1L非抗凝血，待其凝血析出血清后，棄去上層血清，得到凝固血塊約500mL。將凝固血塊用超速粉碎器粉碎成血勻漿，在攪拌下往血勻漿中緩慢地加入1000mL 1mol/L(NH4)2SO4堿性溶液，之后停止攪拌，靜置2小時(shí)，將溶液通過布氏漏斗抽濾，除去珠蛋白沉淀，接著用0.7mo1/L(NH4)2SO4堿性溶液2000mL沖洗沉淀物，直至將沉淀中的血紅素之紫色洗干凈為止，收集濾液約3000mL，合并于真空干燥器中，于1.33Kpa真空度下減壓蒸餾，除去可揮發(fā)物質(zhì)和大部分的水分，餾余物剩余約1000mL時(shí)，停止蒸餾，用1mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)使溶液pH=2，并靜置30min，此時(shí)有大量的紫紅色沉淀出現(xiàn)，將沉淀物通過漏斗過濾，并用蒸餾水洗滌沉淀，除去水溶性雜質(zhì)，最后收集的沉淀物置于干燥箱中于60℃溫度下烘干，得到2.8g純血紅素，回收率93％。經(jīng)分析產(chǎn)品純度99％。
實(shí)施例2取1L非抗凝血，待其凝血析出血清后，棄去上層血清，得到凝固血塊約500mL。將凝固血塊用超速粉碎器粉碎成血勻漿，在攪拌下往血勻漿中緩慢地加入1000mL1mol/L Zn(OH)2堿性溶液，之后停止攪拌，靜置過夜，將溶液通過布氏漏斗抽濾，除去珠蛋白沉淀，接著用1mol/LZn(OH)2堿性溶液2000mL沖洗沉淀物，直至將沉淀中的血紅素之紫色洗干凈為止，收集濾液約3000mL，合并于真空干燥器中，于1.58Kpa真空度下減壓蒸餾，除去可揮發(fā)物質(zhì)和大部分的水分，餾余物剩余約1000mL時(shí)，停止蒸餾，用1mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)溶液的pH=2，并靜置30min，此時(shí)有大量的紫紅色沉淀出現(xiàn)，將沉淀物通過漏斗過濾，并用蒸餾水洗滌沉淀，除去水溶性雜質(zhì)，最后收集的沉淀置于干燥箱中于60℃溫度下烘干，得到2.3g純血紅素，回收率77％，產(chǎn)品純度99％。
實(shí)施例3取血勻漿500mL，加入1200mL60％堿性乙醇溶液，靜置2小時(shí)，抽濾除去珠蛋白沉淀，再用2400mL60％堿性乙醇溶液沖洗沉淀物，收集濾液約4000mL，于蒸餾瓶中進(jìn)行常壓蒸餾并回收60℃-80℃之餾份。餾余物剩余約800mL時(shí)停止蒸餾，用1mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)體系pH=3，靜置30min析出血紅素沉淀，沉淀經(jīng)過濾洗滌后于干燥箱中烘干，烘干溫度60℃，得到2.8g純血紅素，回收率93％，產(chǎn)品純度99.5％。
實(shí)施例4采用30％三氯乙酸堿性溶液作為血紅素的抽提劑，其余步驟同實(shí)施例1，最后得到血紅素2.3g，回收率77％，產(chǎn)品純度99％。
實(shí)施例5為驗(yàn)證得到產(chǎn)品的純度，在0.4mol/L NaOH+正丁醇+95％乙醇=30+35+35(V/V)的展開劑體系中，對血紅素標(biāo)準(zhǔn)品和得到的產(chǎn)品同時(shí)進(jìn)行紙層析展開，在同一位置均出現(xiàn)一個紫色的橢園形斑點(diǎn)，其Rf=0.59。用0.5％丙酮茚三酮溶液對層析紙進(jìn)行顯色反應(yīng)，均無蛋白質(zhì)的顯色斑點(diǎn)，說明得到產(chǎn)品純度較高。
用0.4mol/L NaOH溶液分別溶解血紅素標(biāo)準(zhǔn)品和得到產(chǎn)品，制作紫外吸收曲線，兩個溶液均在405nm處有最大吸收峰，未發(fā)現(xiàn)其它波長的吸收峰。
上述兩項(xiàng)試驗(yàn)均說明所得到的產(chǎn)品是血紅素，而且產(chǎn)品純度較高。
權(quán)利要求
1.從動物血液中提取血紅素的方法，是采用由除去血清的凝固血塊制成的血勻漿提取血紅素，其特征是在血勻漿中加入堿性溶液，溶解其中的血紅素，并與不溶于堿性溶液的物質(zhì)分離；用鹽酸調(diào)節(jié)溶解有血紅素的堿性溶液，至溶液pH=2-3，溶液中析出沉淀，收集沉淀物，經(jīng)洗滌、烘干，得到血紅素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是采用的堿性溶液是下述溶液中的一種a)1mol/L(NH4)2SO4堿性溶液；b)1.5mol/L NaCl堿性溶液；c)1mol/L Na2SO4堿性溶液；d)1mol/L Zn(OH)2堿性溶液；e)0.8mol/L CuSO4堿性溶液；f)0.5mol/L Pb(Ac)2堿性溶液；g)60％堿性丙酮溶液；h)70％堿性甲醇溶液；i)60％堿性乙醇溶液；j)30％三氯乙酸堿性溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是堿性溶液的用量是血勻漿體積的2-3倍。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是溶解有血紅素的堿性溶液在加入鹽酸之前，先蒸餾以除去溶液中的可揮發(fā)物質(zhì)和大部分水分。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是在60℃-80℃下常壓蒸餾。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是采用減壓蒸餾，真空度1Kpa-2Kpa。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是鹽酸濃度1mol/L。
8.根據(jù)利要求1所述的方法，其特征是血紅素的烘干溫度是60℃-70℃。
全文摘要
一種從動物血液中提取血紅素的方法,是在由除去血清的凝固血塊制成的血勻漿中加入堿性溶液,以溶解其中的血紅素,并與不溶于堿性溶液的珠蛋白相分離,繼而用鹽酸調(diào)節(jié)除去珠蛋白的堿性溶液使其pH=2－3,并析出沉淀,收集沉淀物經(jīng)洗滌、干燥,得到血紅素產(chǎn)品。本發(fā)明生產(chǎn)血紅素的方法簡單、快速,適用于工業(yè)化大批量生產(chǎn)。
文檔編號C07F15/02GK1306002SQ01102839
公開日2001年8月1日 申請日期2001年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月7日
發(fā)明者尹兆明, 段黎萍, 楊勇 申請人:尹兆明