免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的工程改造的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供在框架區(qū)（FR）包含一個或多個非常規(guī)二硫鍵的單域抗體（sdAb）骨架。所述一個或多個非常規(guī)二硫鍵可以在通過突變引入至FR2和FR3中的半胱氨酸之間形成。在所述sdAb骨架是VH的情況下，所述Cys可以在基于Kabat編號的位置（47-49）中的任一位置處以及位置（67-71）中的任一位置處引入；在一個實例中，Cys可在基于Kabat編號的位置（49）和（69）處引入。在所述sdAb骨架是VL的情況下，所述Cys殘基可以在基于Kabat編號的位置46-49中的任一位置處和位置（62-66）中的任一位置處引入；在一個實例中，所述Cys殘基可以在基于Kabat編號的（位置48和64處）引入。
【專利說明】免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的工程改造
[0001]相關(guān)專利申請的交叉引用
[0002]本申請要求享有2011年I月28日提交的美國臨時專利申請USSN61/437174的優(yōu)選權(quán)，其全部內(nèi)容以引用的方式納入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的工程改造。更具體地，本發(fā)明涉及對免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域進行工程改造以改善所述免疫球蛋白的生物物理特性。
【背景技術(shù)】
[0004]蛋白質(zhì)穩(wěn)定性在蛋白質(zhì)治療中起很重要的作用，因為不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)在體內(nèi)會導致可變的治療有效性以及無法預測的生理作用(Horwich，2002 ；ffetzel, 1988 ；Mitraki和King, 1992 ;Worn 和 Pluckthun, 2001 ;Hurle et al.，1994)。在抗體治療領(lǐng)域中，人常規(guī)抗體和抗體片段太大和/或具有較差生物物理特性，例如穩(wěn)定性低、不可逆的去折疊以及表達低；因此，它們的臨床應用受限?！疤烊淮嬖诘摹眴斡蚩贵w(sdAb)(例如，駱駝科(camelid)VhH、鯊魚Vnak)不存在上述問題，但是它們因其非人的性質(zhì)而是免疫原性的。
[0005]全人sdAb(例如，Vh或八)由于它們具有預期的低(或缺乏)免疫原性，將會是用于人療法的理想分子；但是，由于它們的低穩(wěn)定性和溶解度，它們易于聚集(Ward et al.，1989 ；Davies and Reichmann，1994 ;Davies and Riechmann，1995 ;Tanha et al.,2001 ；Kazlauskas and Bornscheuerj2009 ；Holliger and Hudson, 2005 ;Hoogenboom，2005)。這限制了它們在人療法中 的應用?？紤]到穩(wěn)定抗體作為治療分子的重要性，已經(jīng)做出了很多努力以選出更穩(wěn)定/可溶的單域抗體這一事實并不令人驚訝(Davies andRiechmann, 1996a ； Jespers et al.，2004 ；To et al.，2005 ；Tanha et al.，2006 ；Arbab1-Ghahroudi et al.，2009a ；Arbab1-Ghahroudi et al.，2009b ；Arbab1-Ghahroudiet al.，2010)。
[0006]一種提高sdAb穩(wěn)定性的典型方法是使用一種sdAb作為骨架(scaffold)來產(chǎn)生展示文庫，所述文庫包含上億種sdAb，每種均具有獨特的特異性；然后通過淘選技術(shù)選出針對靶抗原的結(jié)合物(sdAb)。在實現(xiàn)該方法的一種途徑中，首先對親本骨架進行工程改造以使其是非聚集性的，然后基于所述非聚集性的骨架來構(gòu)建所述文庫；因為假定說是文庫中的子代sdAb大體上“遺傳” 了所述親本骨架的非聚集特性，所以進行僅基于親和性標準的常規(guī)淘選以選出非聚集性的sdAb。在另一種途徑中，所述親本骨架可以是非聚集性的，也可以不是非聚集性的，因此基于親和性和非聚集標準來對其文庫進行淘選。不管是哪種途徑，聚集性的和非聚集性的sdAb經(jīng)常被一起選出來(co-selected);在很多情況下,聚集性的sdAb在篩選過程中占主導，或者所選的結(jié)合物具有低溶解性、穩(wěn)定性和表達水平。此外，在親和篩選的過程中，很多％抗體丟失，其中出現(xiàn)大范圍的氨基酸取代使Vh去穩(wěn)定化，導致了聚集(Kazlauskas and Bornscheuer, 2009; Bloom et al.,2006)。這些因素使得非聚集性的sdAb的篩選是令人厭倦且勞動密集型的，并且有時是令人氣餒的。[0007]因此，本領(lǐng)域仍然需要非聚集性的、可溶且穩(wěn)定的抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明涉及免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的工程改造。更具體地，本發(fā)明涉及對免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域進行工程改造以改善所述免疫球蛋白的生物物理特性。
[0009]本發(fā)明提供了一種含免疫球蛋白骨架的組合物以及制備和使用所述組合物的方法，所述免疫球蛋白骨架在框架區(qū)(FR)內(nèi)包含一個或多個非常規(guī)二硫鍵。在一個實施方案中，所述免疫球蛋白骨架是單域抗體(sdAb)。所述免疫球蛋白骨架可以是Vh ;所述Vh可以屬于VH3家族。或者,所述免疫球蛋白骨架可以是Vlj ;所述Vlj可以屬于K或λ家族。在一個實施方案中，所述免疫球蛋白骨架是人的。在一個實施方案中，所述免疫球蛋白骨架是人工程化(humaneered)的。在一個實施方案中,所述免疫球蛋白骨架是駱§它科的。在一個實施方案中，所述駱駝科物種選自美洲鴕、羊駝和駱駝。
[0010]在如上所述的免疫球蛋白骨架中，所述一個或多個非常規(guī)二硫鍵可以是在FR2和FR3中在通過突變引入的半胱氨酸之間形成。在所述免疫球蛋白骨架是情況下，本發(fā)明提供了一種制備所述骨架的方法，其中所述Cys可以在基于Kabat編號的位置47_49中的任一位置處以及位置67-71中的任一位置處引入。在一個實施方案中，Cys可在基于Kabat編號的位置49和69處引入。在所述免疫球蛋白骨架是\的情況下，本發(fā)明提供了制備所述骨架的方法，其中所述Cys殘基可以在基于Kabat編號的位置46_49中的任一位置處和位置62-66中的任一位置處引入。在一個實施方案中，Cys殘基可以在基于Kabat編號的位置48和64處引入。
[0011]本文描述的免疫球蛋白骨架可以包含多肽序列，所述多肽序列包含引入至抗體可變區(qū)的框架區(qū)FR2和FR3中的 至少2個非常規(guī)Cys殘基。在一個實施方案中，所述多肽包含在選自V11SdAb結(jié)構(gòu)域的VhFR2區(qū)域的殘基47-49的位置上的Cys殘基，以及在選自VHsdAb結(jié)構(gòu)域的VhFR3區(qū)域的殘基69-71的位置上的Cys殘基。在一個實施方案中，所述多肽包含在選自VpdAb結(jié)構(gòu)域的VJR2區(qū)域的殘基46-49的位置上的Cys殘基，以及在選自VpdAb結(jié)構(gòu)域的'FR3區(qū)域的殘基62-66的位置上的Cys殘基。
[0012]在一個實施方案中，所述多肽包含至少在Vh結(jié)構(gòu)域位置49上的Cys殘基以及至少在Vh結(jié)構(gòu)域位置69上的Cys殘基。在一個實施方案中，本發(fā)明的Vh結(jié)構(gòu)域包含sdAb片段。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明Vh sdAb片段的表達文庫，其中本發(fā)明的sdAb片段包含多種⑶R序列。在一個實施方案中，選自SEQ ID N0:2、4、6和8的本發(fā)明V11SdAb片段的⑶R區(qū)域的位置是PCT公開文本W(wǎng)02006/099747圖1A中提供的位置，選自SEQ IDNO: 70至83的那些是PCT公開文本W(wǎng)02006/099747圖2中為相應的野生型序列所提供的位置。
[0013]在一個實施方案中，所述多肽至少包含\結(jié)構(gòu)域位置48上的Cys殘基和至少\結(jié)構(gòu)域位置64上的Cys殘基。在一個實施方案中，本發(fā)明'結(jié)構(gòu)域包含sdAb片段。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明VpdAb片段的表達文庫，其中本發(fā)明的sdAb片段包含多個CDR序列。在一個實施方案中，選自SEQ ID N0:10、12、14、16、18、20、22和24的本發(fā)明VpdAb片段的⑶R區(qū)域的位置是FIG.1B中提供的位置。
[0014]在一個實施方案中，本發(fā)明多肽的CDR殘基可以是任意合適的序列，并且可以具有非圖1A和IB提供的數(shù)量的可變數(shù)量的殘基。[0015]在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫球蛋白多肽包含選自以下的一個或多個序列的骨架區(qū)域
【權(quán)利要求】
1.一種組合物，其包含在框架區(qū)(FR)包含一個或多個非常規(guī)二硫鍵的免疫球蛋白骨架。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述免疫球蛋白骨架選自Vh或'骨架，其中Vh骨架在FR中包含至少一個非常規(guī)二硫鍵，其中所述非常規(guī)二硫鍵在基于Kabat編號的位置49和69處引入的半胱氨酸殘基之間形成；所述\骨架在FR中包含至少一個非常規(guī)二硫鍵，其中所述非常規(guī)二硫鍵在基于Kabat編號的位置48和64處引入的半胱氨酸殘基之間形成。
3.權(quán)利要求1的組合物,其中所述骨架是選自單域抗體(sdAb)、scFv、Fab、F(ab)2或成熟免疫球蛋白的較大抗體蛋白或片段的一部分。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中所述成熟免疫球蛋白選自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgE和/ 或 IgM0
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述免疫球蛋白骨架是VH。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述Vh屬于Vh3家族。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中所述免疫球蛋白骨架是八。
8.權(quán)利要求7的組合物，其中所述'屬于K或λ家族。.
9.權(quán)利要求1至8任一項的組合物，其中所述一個或多個非常規(guī)二硫鍵是在通過突變引入至FR2和FR3中的半胱氨酸殘基之間形成。
10.權(quán)利要求5或6的組合物，其中所述半胱氨酸殘基在基于Kabat編號的位置49和.69處引入。
11.權(quán)利要求7或8的組合物，其中所述半胱氨酸殘基在基于Kabat編號的位置48和.64處引入。
12.權(quán)利要求1至11任一項的組合物，其中所述骨架是多聚化的，其中所得到的多聚體至少包含二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體、七聚體或八聚體。
13.權(quán)利要求1至12任一項的組合物，其中所述骨架被融合至另一個序列，其中所述另一個序列選自Fe片段、靶向序列、信號序列和純化標簽或它們的任意組合。
14.權(quán)利要求1至13任一項的組合物，其中所述免疫球蛋白骨架包含選自以下的序列的框架區(qū) QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAAS⑶TVSDESMTWVRQAPGKGLEWV — AISSSGGSTYYADSVKGRFT 蜃SRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVTDNRSCQTSLCTSTTRSWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:2);
QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGVTLSPECMAWVRQAPGKGLEWV.AISSSGGSTYYADSVKGRF 傷 SRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVSCEGENAFWGQGTMVTvss(SEQ ID NO:4); QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGYTVSSECMGWVRQAPGKGLEWV醫(yī)AISSSSGSTYYADSVKGRFT暴SRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVRDSKNCHDKDCTRPYCSWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:6);
QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGFSVISESMTffVRQAPGKGLEffV§AISSSGGSTYYADSVKGRFT.|； SRDNSKNTVHLQMNSLRAEDTAVYYCAAKKIDGARYDYWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:8)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISTYLNWYQQKPGKAPKLL | FAASTLQSGVPSRFS |: SGSGTDFTLTISNLQPEDFATYYCQQSYSTPRTFGHGTKVTVL(SEQ ID NO:10);
15.編碼權(quán)利要求1至14任一項的組合物的核酸。
16.—種表達載體,包含權(quán)利要求15的核酸。
17.一種宿主細胞或生物體，包含權(quán)利要求16的表達載體。
18.—種重組文庫，包含至少一個權(quán)利要求2所限定的免疫球蛋白骨架，其中所述免疫球蛋白骨架還包含多個合適的⑶R序列，其中所述多個⑶R序列提供了至少105、至少106、至少107、至少108、至少IO9或多于IO9個克隆/文庫的多樣性。
19.一種提高含免疫球白骨架的組合物的穩(wěn)定性的方法，其包括在框架區(qū)引入一個或多個非常規(guī)二硫鍵。
20.權(quán)利要求1至14任一項或多項的組合物，其中所述免疫球蛋白序列源自非人的動物。
21.權(quán)利要求20的組合物，其中所述非人的動物選自鳥類、兩棲動物、爬行動物、哺乳動物、駱駝科、雞、大鼠、小鼠、兔、山羊、綿羊、牛、貓、狗、馬或非人靈長類。
22.權(quán)利要求21的組合物，其中所述非人的動物是駱駝科的。
23.權(quán)利要求22的組合物，其中所述駱駝科物種選自美洲鴕、羊駝和駱駝。
24.權(quán)利要求23的組合物，其中所述免疫球蛋白骨架選自Vh區(qū)、Vl或VhH區(qū)域中的任意一個或多個。
25.權(quán)利要求20至24任一項的組合物，其中所述免疫球蛋白骨架是人工程化的。
26.權(quán)利要求1至1 4任一項的組合物，其中所述免疫球蛋白序列源自人。
【文檔編號】C40B40/10GK103619875SQ201280016587
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2012年1月27日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月28日
【發(fā)明者】D·Y·金, J·坦納 申請人:加拿大國家研究委員會