專利名稱：：一種檢測海水中病原菌污染的寡核苷酸微陣列技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于海水污染監(jiān)測領(lǐng)域，主要內(nèi)容是一種寡核苷酸微陣列技術(shù)，能夠高通量地監(jiān)測海水中病原細菌污染情況。能夠同時檢測多種致病細菌，包括河流弧菌，副溶血弧菌，溶藻弧菌，霍亂弧菌，擬態(tài)弧菌，弗尼斯弧菌，哈維弧菌，創(chuàng)傷弧菌，糞腸球菌，李斯特菌，銅綠假單胞菌，沙門氏菌，金黃色葡萄球菌，產(chǎn)氣莢膜梭菌。并且這種微陣列技術(shù)能夠不通過富集培養(yǎng)，直接從海水中檢測多種指標(biāo)菌，包括不能被人工培養(yǎng)的細菌，而不受季節(jié)的影響。除了能夠評估相應(yīng)海域的病原菌的污染程度，還能指示該海域是否受到生活廢水污染等。
背景技術(shù)：
：海洋的病原菌污染和其他污染相比，比較隱蔽，但是卻直接威脅到沿岸居民的健康。并且海水病原菌污染的致病細菌種類的分布特點能夠直接反映海水受到生活污水、城市污水的污染情況。檢測海水中致病細菌的分布狀況具有多重意義。海水中污染病原菌種類多樣，陸地上的一些致病細菌經(jīng)過地表徑流最終匯入海水中，因此各種能夠?qū)е氯祟惣膊〉牟≡加锌赡茉诤Ｋ写嬖?。此外海水中本身自然生存有豐富的病原菌，其中許多病原菌能夠感染人類。這些特點要求海洋病原菌的監(jiān)測提供盡可能全面和有代表性的檢測信息。DNA微陣列檢測技術(shù)能同時檢測多個病原菌指標(biāo)，并且可以按照需求對檢測信息進行細化。這一優(yōu)點正好滿足海水致病菌污染監(jiān)測的要求。此外，DNA微陣列技術(shù)在DNA分子水平檢測，還具有反應(yīng)靈敏，操作簡單，耗時短，準(zhǔn)確性高，易于推廣等特點。由于使用過濾富集，因此不需培養(yǎng)增菌。該技術(shù)還能檢出不能人工培養(yǎng)的苛刻性菌和死菌，大大提高陽性率。鑒于這些優(yōu)點，DNA微陣列技術(shù)能夠作為開發(fā)海水病原菌檢測的良好技術(shù)平臺。目前，全面檢測海水中的污染病原菌的報道不多，大多數(shù)只能夠檢測有限的少數(shù)種病原菌。比如多重PCR技術(shù)。但是檢測兩三種菌病不能有效地給出海水病原菌的整體污染狀況。并且多數(shù)已報道的海水檢測技術(shù)并不是以評估海水污染狀況為目的。而DNA微陣列技術(shù)能夠很好地克服這些缺點。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種綜合監(jiān)測海水中多種病原菌及污染指標(biāo)菌的寡核苷酸微陣列技術(shù)。該微陣列技術(shù)以16S-23SrRNA基因轉(zhuǎn)錄間區(qū)序列作為檢測耙點，通過一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增，并同時獲得地高辛標(biāo)記，然后進行寡核苷酸雜交；通過酶標(biāo)抗體催化底物顯色，判讀獲得監(jiān)測結(jié)果。檢測信息豐富詳盡，具有高通量的特點。并且檢測不需要通過目標(biāo)菌培養(yǎng)富集，能夠在較短的時間內(nèi)快速得到檢測結(jié)果。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種檢測海水中病原菌污染的寡核苷酸微陣列技術(shù)的43條探針序列如下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本發(fā)明中寡核苷酸微陣列技術(shù)使用方法如下:(1)寡核苷酸微陣列制作1)制備探針稀釋液IX鮭魚精DNA溶液(Ig/L)2)制備探針溶液用探針稀釋液配置成0.1ug/nL探針溶液3)把探針溶液點于5cmX5cm尼龍膜基質(zhì)上，80。C保溫2小時。探針點樣順序如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(2)海水樣本處理和DNA提取1)樣本處理①取表層海水20L，分裝于滅菌處理的塑料桶中。取得的海水在3h內(nèi)進行處理。②先用0.15毫米孔徑篩子過濾除去懸浮物質(zhì)，然后用Mini-pelliconsystem(Millipore，美國)進行加壓過濾收集菌體，濾膜孔徑為0.22um(Milipo，美國)。每過濾2L海水對應(yīng)一張濾膜，即每2L海水作為一個樣本，每個采樣點對應(yīng)10個平行樣本。③用無菌水將濾膜上的菌體沖洗下來，并立即用10000r/min離心5min收集菌體。收獲的菌體和雜質(zhì)沉淀用于DNA抽提。2)DNA提?、俸Ｋw過濾得到樣本的菌體和泥沙懸濁液12000r/min離心2min。②沉淀物加入550uL的TE緩沖液(10mMTrisHC1，lmMEDTA;pH8.0)，反復(fù)吹打使之重新懸浮，加入30nL10。/。SDS和15uL的蛋白酶K，混勻，37'C溫育lh.③加入100iiL5mol/LNaCl'混勻，再加入80yLCTAB/NaCl溶液(5gCTAB溶于100mL0.5MNaCl溶液中)，混勻，65'C溫育10min。加入等體積的酚/氯仿/異戊醇充分混勻，離心4-5ndn,將上清轉(zhuǎn)入一只新管中，加入0.6-0.8倍體積的異丙醇，輕柔顛倒混勻，-2(TC放置20min。⑤沉淀用lmL的70。/。乙醇洗滌，倒置干燥，重溶于50nLTE緩沖液。⑥D(zhuǎn)NA樣品煮沸5分鐘然后在冰上淬火。-2(TC保存?zhèn)溆谩?3)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和地高辛標(biāo)記1)擴增和標(biāo)記體系試劑IOX聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)BufferF-E-TB-E-Td,體系中各組分終濃度和體積(yL)5.0uL10umol/L(4.OnL)10yraol/L(4.OpL)10mmol/L(0.3iiL)Digoxigenin-l1-dUTP25nmol/L(0.3tiL)DNA模板5.0jxLTaqDNAPolymerase5U/uL(0.3yL)雙蒸水31.1u1.總計50.OnLIOX聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)Buffer:Tris-HC1pH8.5，100mmol/L;KC1，500ranol/L;MgCl2，15mmol/L。2)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)程序①預(yù)變性階段95'C5min②第一循環(huán)階段(5個循環(huán))94°C30sec54。C30sec72。C50sec③第二循環(huán)階段(5個循環(huán))94°C30sec56'C30sec72。C40sec④第三循環(huán)階段(IO個循環(huán))94°C30sec58°C30sec72。C40sec⑤第三循環(huán)階段(15個循環(huán))94°C30sec62。C40sec⑥結(jié)束階段72。C5min4°C保溫(4)雜交檢測過程雜交反應(yīng)使用美國Roch公司地高辛檢測試劑盒。1)每個寡核苷酸微陣列浸入600yL雜交液(Roch公司)中50。C預(yù)雜交45min。2)將地高辛標(biāo)記的PCR擴增產(chǎn)物95'C變性10min然后淬火。3)將50uL變性的PCR產(chǎn)物加入到600yL新?lián)Q的雜交液(Roch公司)中，加入預(yù)雜交完的尼龍膜5(TC晃動雜交1小時。4)雜交完成后將膜冷卻，室溫下分別用2XSSC(+0.1%SDS)，0.5XSSC(+0.1%SDS)和洗滌緩沖液(Roch公司)按順序各洗滌2min，5)用封閉液封閉30min,加入酶聯(lián)抗-地高辛抗體結(jié)合30min。6)用洗滌緩沖液洗滌15minX2次。用檢測緩沖液(Roch公司)平衡5min，加入含色原底物的顯色液避光顯色2小時后觀察結(jié)果。20XSSC:175.3gNaCl和88.2g檸檬酸鈉，溶于800mL水，加入NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，定容1L。2XSSC:將20XSSC用水稀釋10倍。0.5XSSC:將20XSSC用水稀釋40倍。本發(fā)明的一種檢測海水中病原菌污染的寡核苷酸微陣列技術(shù)還可以在檢測其它海水水域病原菌污染中的應(yīng)用。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的優(yōu)點在于運用微陣列技術(shù)檢測獲得眾多致病菌和污染指標(biāo)菌的分布狀況，即具有高通量的優(yōu)點；能夠直接利用海水作為樣本，在保持海水中菌群數(shù)目天然比例的情況下真實地獲得目標(biāo)菌的污染狀況信息，而現(xiàn)有的檢測技術(shù)大多數(shù)需要富集培養(yǎng)的步驟，不僅破壞了菌群組成的原始比例，由于苛刻性菌不被人工培養(yǎng)，結(jié)果的可靠程度也較低，并且檢測流程較長；寡核苷酸微陣列技術(shù)檢測操作流程短，特異性高，比較準(zhǔn)確，靈敏，快速。圖l:海水樣本l檢測結(jié)果具體實施例方式下面結(jié)合附圖與具體實施方式對本發(fā)明作進一步詳細描述。實施例l:海水樣本l1寡核苷酸微陣列制作1)制備探針稀釋液IX鮭魚精DNA溶液(Ig/L)2)制備探針溶液用探針稀釋液配置成0.1llg/pL探針溶液3)固定探針于尼龍膜基質(zhì)上把探針溶液點于5cmX5cm尼龍膜基質(zhì)上，8(TC保溫2小時。2海水樣本處理和DNA提取1)樣本處理①取表層海水20L,分裝于滅菌處理的塑料桶中。②先用0.15mm孔徑篩子過濾除去懸浮物質(zhì)，然后用Mini-pelliconsystem(Millipore，美國)進行加壓過濾收集菌體，濾膜孔徑為0.22ym(Milipo，美國)。每過濾2L海水對應(yīng)一張濾膜，即每2L海水作為一個樣本，每個采樣點對應(yīng)10個平行樣本。③用無菌水將濾膜上的菌體沖洗下來，并立即用10000r/min離心5min收集菌體。收獲的菌體和雜質(zhì)沉淀用于DNA抽提。2)DNA提?、俸Ｋw過濾得到樣本的菌體和泥沙懸濁液12000r/min離心2min。②沉淀物加入550yL的TE緩沖液(10mMTris'HCl，lraMEDTA;pH8.0)，反復(fù)吹打使之重新懸浮，加入30uL10y。SDS和15uL的蛋白酶K，混勻，37。C溫育lh.③加入100uL5mol/LNaCl，混勻，再加入80uLCTAB/NaCl溶液(5gCTAB溶于lOOmLO.5mol/LNaCl溶液中)，混勻，65。C溫育10min。加入等體積的酚/氯仿/異戊醇充分混勻，離心4-5min,將上清轉(zhuǎn)入一只新管中，加入0.6-0.8倍體積的異丙醇，輕柔顛倒混勻，-2(TC放置20min。沉淀用ltnL的70%乙醇洗滌，倒置干燥，重溶于50uLTE緩沖液。DNA樣品煮沸5分鐘然后在冰上淬火3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和地高辛標(biāo)記1)擴增和標(biāo)記體系試劑IOX聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)BufferF-E-TB-E-TdNTPDigoxigenin_ll-dUTPDNA模板TaqDNAPolymerase雙蒸水總計IOX聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)BufferMgCl2，15mmol/L。2)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)程序①預(yù)變性階段-循環(huán)階段(5個循環(huán))-2(TC保存?zhèn)溆?體系中各組分終濃度和體積(uL)5.OnLlOtimol/L(4.OnU10pmol/L(4.OnL)10mmol/L(0.3uL)25畫1/L(0.3uL)5.OnL5U"L(0.3wL)31.1pL50.OnLTris-HClpH8.5，10Ommol/L;KC1，500mraol/L;③第二循環(huán)階段(5個循環(huán))④第三循環(huán)階段(IO個循環(huán)):⑤第三循環(huán)階段U5個循環(huán))⑥結(jié)束階段:95°C5min94°C30sec54°C30sec72°C50sec94°C30sec56。C30sec72°C40sec94°C30sec58°C30sec72°C40sec94°C30sec62°C40sec72°C5min4°C保溫4雜交檢測過程雜交反應(yīng)使用美國Roch公司地高辛檢測試劑盒。1)每個寡核苷酸微陣列浸入600yL雜交液(Roch公司)中50'C預(yù)雜交45min。2)將地高辛標(biāo)記的PCR擴增產(chǎn)物95'C變性10min然后淬火。3)將50yL變性的PCR產(chǎn)物加入到600wL新?lián)Q的雜交液(Roch公司)中，加入預(yù)雜交;的尼龍膜5(TC晃動雜交1小時。4)雜交完成后將膜冷卻，室溫下分別用2XSSC(+0.1%SDS)，0.5XSSC(+0.WSDS)和洗滌緩沖液(Roch公司)按順序各洗滌2min，5)用封閉液封閉30min，加入酶聯(lián)抗-地高辛抗體結(jié)合30min。6)用洗滌緩沖液洗滌15minX2次。用檢測緩沖液(Roch公司)平衡5min，加入含色原底物的顯色液避光顯色2小時后觀察結(jié)果。結(jié)果見附圖。附圖海水樣本l檢測結(jié)果附圖中方格內(nèi)顯現(xiàn)出圓點的表示陽性結(jié)果，未顯色的表示陰性結(jié)果。其中1行9列^~一陽性對照，]行3列的探針是Vfu710b，表示檢測出了弗尼斯弧菌；l行6列的探針是Sal-l，6行7列的探針是Sal-2，5行7列的探針是Sal-3，表示檢測出了沙門氏菌；2行1列的探針是Vpiapro，4行2列的探針是Vp-nl，表示檢測出了副溶血弧菌；4行6列的探針是PSE-1，2行6列的探針是PSE-3，表示檢測出了銅綠假單胞菌；4行3列的探針是Mchar，表示檢測出了霍亂弧菌；5行4列的探針是Vh710b，表示檢測出了哈維弧菌。序列列表SEQUENCELISTING<110>南開大學(xué)<120〉一種檢測海水中病原菌污染的寡核苷酸微陣列技術(shù)<130〉20090622<160>43<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>26<212>DM<213>人工合成〈220〉<221>misc—feature<222>(1)..(26)<400>1catc肪t肪tateitgtgtgeigeicgta26<210〉2<211〉26<212〉DNA<213>人工合成<220><221>misc_feature<222>(1)..(26)<400〉2tcaatcagtatgctacgatagcaacc26〈210〉3<211>26〈212〉DNA<213〉人工合成<220〉<221〉misc_feature<222>(1)..(26)〈400〉3gcatgcteitggatgcatactgattca26<210>4<211>28<212〉DNA<213〉人工合成<220〉<221〉misc_feature<222〉(1)..(28)<400>4tatcgtaggtacagatcactaactctca28<210>5<211>26<212〉腿<213〉人工合成<220><221〉misc—feature<222〉(1).(26)<400〉5gactctccatcttgtataataatagc26<210〉6<211〉26<212〉DNA<213〉人工合成<220〉<221>misc—feature<222>(1)..(26)<400〉6ttattatgctgtatgtcatatagtca26<210〉7<211>22<212〉DNA<213〉人工合成<220><221〉misc_feature<222>(1).(22)<400〉7ttaatcacatacacgaatataa22<210>8<211〉27<212>DNA〈213〉人工合成<220〉<221〉miscfeature<222>(1)..(27)<400>8gcttactacataagaagtgataaggtc27<210>9<211>26<212〉DM<213>人工合成<220〉<221〉misc—feature<222〉(1).(26)<400〉9gtcgtstctgcttsgaatctscgagt26<210>10<211〉26<212〉DM<213〉人工合成<220〉<221〉邁isc—feature<222〉(1)..(26)<400>10ctaggtgagacgttctaccacacttc26<210〉11〈211〉27<212〉DNA<213〉人工合成<220><221〉misc_feature<222>(1)..(27)<400〉11atatatattatggtgaccttgcttctg27<210〉12<211>26<212>DM<213>人工合成<220><221>misc_feature<222〉(1)..(26)<400>12tctgtattcatgctgacggaatcccg26<210〉13<211〉21<212〉DNA<213〉人工合成<220〉<221>misc—feature<222〉(l)..加<400〉13atgccttatcgctgacattgt21<210〉14<211〉26<212〉腿〈213〉人工合成<220〉<221〉misc一feature〈222>(1)..(26)<400〉14aagttaacttgtatatacagcaagcc26<210>15<211>26<212>DNA<213>人工合成<220><221>misc一feature<222>(1)..(26)<400>15gagtccttcgtatggaattagacatc26<210>16<211>26<212>DNA<213>人工合成<220>〈221>misc—feature<222>(1)..(26)<400>16atcttacgttgtttatacatcaagcc26<210>17<211>21<212>DNA<213>人工合成<220〉〈221>misc_feature〈222>(1)..(21)<400>17tatgtccaatcg肪gagtcct21<210>18<211〉25<212>DNA<213〉人工合成<220><221>misc一feature<222>(1)..(25)〈400〉18gtatagacatcagtgcggctatatc25<210>19<2il>22<212〉DNA<213>人工合成<220><221>misc_feature<222>(1)..(22)<400>19tactaataatgtaggt3tacag22<210>20<211>26<212〉腿<213>人工合成<220><221>misc一feature<222>(1)..(26)<400>20ctgactactatggtcatttcttcatc26<210>21<211>21<212>DNA<213〉人工合成<220><221>misc—feature<222>(l)..加<400>21tc貼tcagcgtgagtcataac21<210>22<211>26<212>DNA<213>人工合成<220><221>misc_feature<222〉(1)..(26)<400>22gcaatctcactattagtgtctaatgg26<210>23<211>25<212>DNA<213>人工合成<220〉<221〉misc_feature<222>(1)..(25)<400>23atcatcggtatctggctcaatcata25<210>24<211>27<212>DNA<213>人工合成<220><221>邁isc一feature<222>(1).(27)<400>24aagattacgaccttctttatctcagtg27<210>25<211>35<212>腿<213>人工合成<220><221>misc—feature<222〉(1)..(35)<400>25aagctaBctatactaactatcttatgtagtattca35<210〉26<211〉31<212>■<213>人工合成<220><221〉misc—feature<222>(1)..(31)<400〉26tatcctctcattactcaacatacagagaaga31<210〉27<211>31<212>DNA〈213>人工合成<220><221>misc—feature<222>(l)..加<400>27ttctttatctgtcatcatagagactaacgtc31<210>28〈211>31<212>DNA<213>人工合成<220><221〉misc一feature<222>(l)..加<400>28cggtagatgaagtgatctagacgcaacggta31<210>29<211>31〈212>■<213>人工合成〈220><221>邁isc一feature<222>(l)..加<400>29ggttatatattcattatccttctaacgctag31<210>30<211>31<212>DNA〈213>人工合成<220><221>misc—feature〈222〉(l)..加<400>30tctattggttatatatagattatccttctat31〈210>31〈211>31<212>DNA<213>人工合成<220><221>misc一feature<222>(l)..加<400>31aactgatcaatgtatageicgatatgtctatt31<210>32<211〉31<212>DNA<213>人工合成<220><221>misc_feature<222>(l)..加<400>32aacataccgtgaacacggcgtagaatcagtt31〈210>33<211>27<212〉DNA<213>人工合成<220>〈221〉misc_feature<222>(1)..(27)<400>33aactatcctccaaagctcagatstgat27<210>34〈211〉30<212>DNA<213>人工合成<220><221>misc—feature<222>(1),.(30)<柳>34atgctceigatatgaatgtacgtcaatcaac30<210>35<211>37<212>DNA<213>人工合成<220>〈221>misc一feature<222>(1)..(37)<400>35aactatcgtcgatagctcagatatgtatgttcgtgta37<210>36<211>28<212>■<213>人工合成〈220><221>misc—feature<222>(l)..咖〈400>36■ttatgggtaaagagcttctcacaagacg28<210>37<211>37<212>■<213>人工合成<2加><221>misc—feature〈222>(1).(37)<400>37cacgatttattatcggtaaagaggtactgactacacg37<210>38<211〉28〈212〉DNA<213〉人工合成<220〉<221〉邁isc—feature<222>(l)..卿<400>38ttc'肪cgtgagtctgacaattatcgcaa28<210>39<211>30<212>DNA<213>人工合成<220><221>misc—feature〈222>(1)..(30)<400>39agtataataacgcgtttggtgtagcatgga30〈210>40<211>30<212>DNA<213>人工合成<220><221>misc一feature<222>(1)..(30)<400>40gccattcctcaaggatggaaacattgatta30<210>41〈211>36〈212>醒<213>人工合成<220><221>misc—feature<222>(1)..(36)<400>41caattaattacagagatattatccacaattcattgt36<210>42<211>31<212>DNA<213>人工合成<220〉<221〉misc一feature<222〉(1)..(31)<400〉42ttaatcagagatataatcctgtattcattgt31<210〉43<211>27<212>■<213>人工合成<220><221>邁isc一feature<222>(1).(27)<400〉43acacagatattctccagtattgattga2權(quán)利要求1.一種檢測海水中病原菌污染的寡核苷酸微陣列技術(shù)，其特征在于，微陣列的43條探針序列如下<tablesid="tabl0001"num="0001"></tables>2.按照權(quán)利要求1所述的一種檢測海水中病原菌污染的寡核苷酸微陣列技術(shù)，其特征在于，該寡核苷酸微陣列技術(shù)使用方法如下(1)寡核苷酸微陣列制作1)制備探針稀釋液IX鮭魚精DNA溶液(Ig/L)，2)制備探針溶液用探針稀釋液配置成0.1ug^L探針溶液，3)把探針溶液點于5cmx5cm尼龍膜基質(zhì)上，80。C保溫2小時；探針點樣順序如下表-Vp710bKeliarvVfu710bVvgproN1386Sal-lCp-2ConVpiaproVal2Vm710bTetglavmN1385PSE-3Cp-lRiverglavrVallVm710eVviaproN簡PSE-2Str陽2Vf710eVp-nlMcharVh710eLis-3-RVPSE-1Str-3vfl-n2HemglvmVc710eVh710bLis-2-RVN1388Sal-3vfl-nlVp710eVc710bVfu710eLis-l-RVN1387Sal-2Cp-3(2)海水樣本處理和DNA提取1)樣本處理①取表層海水20L，分裝于滅菌處理的塑料桶中，取得的海水在3h內(nèi)進行處理；②先用0.15毫米孔徑篩子過濾除去懸浮物質(zhì)，然后用Mini-pelliconsystem(Millipore,美國)進行加壓過濾收集菌體，濾膜孔徑為0.22nm(Milipo，美國)。每過濾2L海水對應(yīng)一張濾膜，即每2L海水作為一個樣本，每個采樣點對應(yīng)10個平行樣本；③用無菌水將濾膜上的菌體沖洗下來，并立即用10000r/min離心5min收集菌體。收獲的菌體和雜質(zhì)沉淀用于DNA抽提；2)DNA提?、俸Ｋw過濾得到樣本的菌體和泥沙懸濁液12000r/min離心2min;②沉淀物加入550|iL的TE緩沖液(10mMTris'HCl,lmMEDTA;pH8.0)，反復(fù)吹打使之重新懸浮，加入30pL10%SDS和15nL的蛋白酶K，混勻，37。C溫育lh;③加入100nL5mol/LNaCl，混勻，再加入80pLCTAB/NaCl溶液(5gCTAB溶于100mL0.5MNaCl溶液中)，混勻，65。C溫育10min;④加入等體積的酚/氯仿/異戊醇充分混勻，離心4-5min，將上清轉(zhuǎn)入一只新管中，加入0.6-0.8倍體積的異丙醇，輕柔顛倒混勻，-2(TC放置20min;沉淀用lmL的70%乙醇洗滌，倒置干燥，重溶于50pLTE緩沖液；⑥D(zhuǎn)NA樣品煮沸5分鐘然后在冰上淬火，-20'C保存?zhèn)溆茫?3)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和地高辛標(biāo)記1)擴增和標(biāo)記體系<formula>formulaseeoriginaldocumentpage0</formula>6)用洗滌緩沖液洗滌15minX2次，用檢測緩沖液(Roch公司)平衡5min，加入含色原底物的顯色液避光顯色2小時后觀察結(jié)果；20XSSC:175.3gNaCl和88.2g擰檬酸鈉，溶于800mL水，加入NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，定容1L;2XSSC:將20XSSC用水稀釋IO倍；0.5XSSC:將20XSSC用水稀釋40倍。3.—種檢測海水中病原菌污染的寡核苷酸微陣列技術(shù)在檢測其它海水水域中病原菌污染的應(yīng)用。全文摘要一種檢測海水中病原菌污染的寡核苷酸微陣列技術(shù)，屬于海水污染監(jiān)測領(lǐng)域，主要技術(shù)方案是以16S-23SrRNA基因轉(zhuǎn)錄間區(qū)序列作為檢測靶點，通過一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增，并同時獲得地高辛標(biāo)記，然后進行寡核苷酸雜交；通過酶標(biāo)抗體催化底物顯色，判讀獲得監(jiān)測結(jié)果。與傳統(tǒng)檢測海水污染的產(chǎn)品相比，運用微陣列檢測獲得眾多致病菌和污染指標(biāo)菌的分布狀況，即具有高通量的優(yōu)點；能夠直接利用海水作為樣本，在保持海水中菌群數(shù)目天然比例的情況下真實地獲得目標(biāo)菌的污染狀況信息，而現(xiàn)有的檢測技術(shù)大多數(shù)需要富集培養(yǎng)的步驟，不僅破壞了菌群組成的原始比例，結(jié)果的可靠程度也較低，并且檢測流程較長；寡核苷酸微陣列檢測操作流程短，比較靈敏，快速。文檔編號C40B40/06GK101580877SQ20091006942公開日2009年11月18日申請日期2009年6月24日優(yōu)先權(quán)日2009年6月24日發(fā)明者謙孫,李永君,田雪瑩,許晶晶,黃熙泰申請人:南開大學(xué)