專利名稱：硫化礦浸礦菌株的原生質(zhì)體融合技術(shù)的制作方法
專利說明硫化礦浸礦菌株的原生質(zhì)體融合技術(shù) 本發(fā)明涉及一種硫化礦專屬浸礦菌株的原生質(zhì)體融合技術(shù)，專用于新型浸礦菌株的構(gòu)建。傳統(tǒng)選冶技術(shù)流程復雜，需經(jīng)歷地質(zhì)、采礦、選礦、冶金、材料等多個生產(chǎn)環(huán)節(jié)，要求精料和多種設(shè)備，反應激烈、污染嚴重、成本高。而生物濕法冶金技術(shù)是利用氧化亞鐵硫桿菌、氧化鐵鐵桿菌、氧化硫硫桿菌等細菌直接吸附在礦粒表面并以礦粒中硫化礦作為生長能源，將其氧化形成硫酸，使金屬離子進入溶液，或間接利用被細菌氧化生成的Fe(III)將金屬氧化，使金屬離子進入溶液。生物浸出工藝對礦石品位要求低，具有設(shè)備簡單、反應溫和、流程短、環(huán)境友好等優(yōu)點，可用于處理銅、鋅、鎳、鈾、金礦等。
用于硫化礦細菌浸出的主要菌株是氧化亞鐵硫桿菌(Thiobacillusferrooxidans)、氧化亞鐵微螺菌(Leptosprillum ferrooxidans)以及氧化硫硫桿菌(Thiobacillus thiooxidans)等。這些菌株具有各自不同的生物學特性，對營養(yǎng)的需求也存在較為明顯的差異。氧化亞鐵微螺菌等氧化亞鐵的能力強，氧化還原硫的能力弱；氧化硫硫桿菌則剛好相反，其氧化還原硫的能力強，氧化亞鐵的能力弱。而氧化亞鐵硫桿菌對亞鐵和還原硫都具有較強的氧化能力。目前常規(guī)的生物浸出工藝，往往需要添加不同的菌群對硫化礦進行氧化，浸出速度慢、生產(chǎn)周期長。
目前對浸礦菌種的遺傳改良，國內(nèi)外主要是對野生優(yōu)良浸礦菌株進行馴化培養(yǎng)或人工誘變，以獲得所需要的生產(chǎn)菌株。在菌株的分子生物學、生物化學等方面雖然開展了一些研究，如關(guān)鍵酶的研究，某些基因的克隆和功能研究，但大多還沒有涉及利用基因工程技術(shù)改良菌株。本發(fā)明的目的是提供一種浸礦菌株的原生質(zhì)體融合技術(shù)，對優(yōu)良的野生菌株進行遺傳改良，以獲得氧化亞鐵和氧化還原硫速率快的浸礦細菌，提高黃銅礦等難處理含鐵、硫礦石細菌浸礦的速率。
本發(fā)明采用雙滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)，將氧化亞鐵的氧化亞鐵微螺菌、氧化還原硫的氧化硫硫桿菌以及對亞鐵和還原硫都具有氧化能力的氧化亞鐵硫桿菌分別進行原生質(zhì)體融合，獲得融合重組細菌，提高對亞鐵和還原硫的氧化能力，為黃銅礦等難處理礦石的生物浸出提供優(yōu)良浸礦菌株。
1.技術(shù)原理在細菌對數(shù)生長期造成細菌細胞壁殘缺破損，在溶菌酶作用下，形成去壁的原生質(zhì)體。將兩種親本菌株的原生質(zhì)體采用不同的理化手段進行滅活，將滅活后的原生質(zhì)體混合，形成融合的原生質(zhì)體；將融合原生質(zhì)體在再生培養(yǎng)基中使融合細菌的細胞壁再生，形成新的融合細菌；然后分別以含還原硫和亞鐵的選擇性固體培養(yǎng)基篩選出能夠穩(wěn)定遺傳的子代融合細菌菌落。
2.技術(shù)方案(1)原生質(zhì)體制備將親本菌株分別加入高滲培養(yǎng)液中，于細菌最適生長溫度20～30℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，然后加入乙二胺四乙酸(EDTA)，半小時后再加入青霉素再培養(yǎng)1～5小時終止培養(yǎng)，離心收集菌體。用SMK緩沖液洗滌兩遍后，加入適量溶菌酶液于42℃水浴保溫，并且不時搖動。根據(jù)鏡檢情況終止水浴，離心洗滌除去酶液獲得原生質(zhì)體。SMK緩沖液為含171g/L蔗糖，23g/L順丁烯二酸的混合液。
(2)原生質(zhì)體雙滅活、融合及再生將原生質(zhì)體濃度調(diào)整在107個/mL左右。各取4～5mL分別置于15W紫外燈下或100℃熱水浴中滅活，將滅活后的原生質(zhì)體等量混合，離心去上清液，加入預熱的融合劑(30％PEG 6000)42℃保溫數(shù)分鐘后，離心去除融合劑。加入高滲緩沖液，稀釋涂布于固體再生培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)7～8d，可以進行融合細菌的再生。
(3)子代融合細菌的篩選分別以含還原硫和亞鐵的選擇性固體培養(yǎng)基篩選出能夠穩(wěn)定遺傳的子代融合細菌集落。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(1)與基因工程技術(shù)相比，雙滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)改良浸礦菌種技術(shù)對親本菌株的遺傳特性無需了解太多，技術(shù)相對簡單，周期短、成本低；而與誘變育種比較，融合菌株的遺傳性狀改變顯著，可以使融合細菌獲得多種所需要的優(yōu)良性狀(見表1)。
(2)篩選出的融合細菌兼具兩種親本細菌的性狀且能夠穩(wěn)定遺傳，具有較強的氧化亞鐵和氧化還原硫的能力，能夠顯著提高硫化礦的浸出率并且縮短處理時間，特別適合于低品位黃銅礦等難處理硫化礦的處理。
表1 融合細菌與親本性狀的比較比生長速率/氧化活性/μ浸礦細菌傳代時間/h h-1LO2·L-1·min-1融合細菌 4.1 0.176 1.6氧化亞鐵硫桿菌5.1 0.128 0.7氧化亞鐵微螺菌4.8 0.145 0.8[


]圖1雙滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)原理圖。1.采用雙滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)，以氧化亞鐵硫桿菌和氧化亞鐵微螺菌為親本株進行融合，形成了新的融合細菌。與親本細菌相比，該融合細菌傳代時間縮短、比生長速率增加，而氧化活性顯著提高。
應用上述融合細菌，以及兩種親本菌株分別對廣東大寶山低品位銅礦進行搖瓶浸出。礦樣的化學成份和物相組成如表2，表3。礦樣總銅含量為1.35％，鐵含量56.49％，硫含量38.52％，以次生硫化銅礦為主，占有率為87％。浸出10天，融合細菌、氧化亞鐵硫桿菌和氧化亞鐵微螺菌對銅的浸出率分別達到96.78％，77.78％和83.68％，融合細菌的浸出速率明顯比兩種親本細菌快，分別提高24.4％，16.1％。
表2 礦樣化學成分Cu Fe CaOMgOAl2O3S SiO2化學組成/％ 1.35 56.4 90.29 0.066 1.3538.52 20.17表3 礦樣物相組成原生硫化 游離氧化結(jié)合氧化銅 次生硫化銅礦 銅 銅 總銅物相組成/％ 0.073 1.18 0.0410.0471.3權(quán)利要求
1.一種硫化礦浸礦菌株的原生質(zhì)體融合技術(shù)，其特征在于本發(fā)明采用雙滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)，將氧化亞鐵的氧化亞鐵微螺菌、氧化還原硫的氧化硫硫桿菌以及對亞鐵和還原硫都具有氧化能力的氧化亞鐵硫桿菌分別進行原生質(zhì)體融合，獲得融合重組細菌，主要包括(1)原生質(zhì)體制備將親本菌株分別加入高滲培養(yǎng)液中，于細菌最適生長溫度20～30℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，然后加入乙二胺四乙酸，半小時后再加入青霉素再培養(yǎng)1～5小時終止培養(yǎng)，離心收集菌體，用SMK緩沖液洗滌后，加入適量溶菌酶液于42℃水浴保溫，并且不時搖動，離心洗滌除去酶液獲得原生質(zhì)體；(2)原生質(zhì)體雙滅活、融合及再生將原生質(zhì)體濃度調(diào)整在107個/mL左右，各取4～5mL分別置于100℃熱水浴中滅活，將滅活后的原生質(zhì)體等量混合，離心去上清液，加入預熱的融合劑于42℃保溫，離心去除融合劑，加入高滲緩沖液，稀釋涂布于固體再生培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)7～8d，可以進行融合細菌的再生；(3)子代融合細菌的篩選分別以含還原硫和亞鐵的選擇性固體培養(yǎng)基篩選出能夠穩(wěn)定遺傳的子代融合細菌集落。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種硫化礦浸礦菌株的原生質(zhì)體融合技術(shù)。本發(fā)明采用雙滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)，將氧化亞鐵的氧化亞鐵微螺菌、氧化還原硫的氧化硫硫桿菌以及對亞鐵和還原硫都具有氧化能力的氧化亞鐵硫桿菌分別進行原生質(zhì)體融合，獲得融合重組細菌。與基因工程技術(shù)相比，本發(fā)明技術(shù)相對簡單，周期短、成本低；而與誘變育種比較，融合菌株的遺傳性狀改變顯著，可以使融合細菌獲得多種所需要的優(yōu)良性狀；本發(fā)明篩選出的融合細菌兼具兩種親本細菌的性狀且能夠穩(wěn)定遺傳，具有較強的氧化亞鐵和氧化還原硫的能力，特別適合于低品位黃銅礦等難處理硫化礦的處理。
文檔編號C22B3/00GK1401769SQ0211438
公開日2003年3月12日 申請日期2002年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月6日
發(fā)明者邱冠周, 周洪波, 楊宇, 黃菊芳, 周吉奎, 柳建設(shè), 傅建華, 張在海 申請人:中南大學