專利名稱：用于校正共聚焦掃描顯微鏡中的圖像失真的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于確定(identify)用于操作共聚焦掃描顯微鏡掃描單元的掃描坐標(biāo)值或者校正掃描坐標(biāo)值的方法。本發(fā)明還涉及一種借助于共聚焦顯微鏡來創(chuàng)建樣本圖像的方法。
背景技術(shù)：
共聚焦掃描顯微鏡能夠用來例如激發(fā)樣本特別是組織樣本中的熒光物質(zhì)，并檢測由此產(chǎn)生的熒光。其原理在于，照射光束經(jīng)由掃描單元引導(dǎo)到樣本上，掃描單元根據(jù)包含掃描坐標(biāo)值的驅(qū)動信號來操作。該掃描坐標(biāo)值表示掃描單元的定位元件的位置。從樣本中發(fā)出的熒光經(jīng)由掃描單元以及從照射光中分離該熒光的分束器引導(dǎo)到檢測針孔，該檢測針孔允許小部分檢測光(detected light)通過而到達檢測器。借助于檢測器所測出的檢測光 根據(jù)掃描坐標(biāo)值而被檢測。換句話說，除了掃描單元所檢測的信號，還記錄在對檢測光的檢測中掃描單元的定位元件所處的位置，該位置是由掃描坐標(biāo)值表示的。檢測光能夠根據(jù)用以驅(qū)動掃描單元的掃描坐標(biāo)值而被檢測；如果掃描單元(特別是它的位置)是以閉環(huán)方式控制的，那么也能夠?qū)⒃擃A(yù)定義掃描坐標(biāo)值稱為“目標(biāo)”掃描坐標(biāo)值?；蛘?，掃描單元的真實位置能夠借助于傳感器測出，然后就能夠?qū)⑦@些測出的掃描坐標(biāo)值與在該測出位置所檢測到的檢測光關(guān)聯(lián)起來；再者，如果掃描單元的位置是以閉環(huán)方式控制的，那么也能夠?qū)⑦@些測出的掃描坐標(biāo)值稱為“實際”掃描坐標(biāo)值。在樣本的光學(xué)掃描期間或者之后，樣本的圖像能夠基于許多的采集像點組合而成，每個像點的位置是由一對圖像坐標(biāo)值確定的，并且相應(yīng)的掃描坐標(biāo)值是關(guān)聯(lián)到圖像坐標(biāo)值的。通過近似法確定圖像坐標(biāo)值與掃描坐標(biāo)值的這一關(guān)聯(lián)是已知的。然而，這能夠產(chǎn)生失真和/或變形，特別是在樣本圖像的邊緣處。圖像失真的產(chǎn)生不僅僅因為近似計算得到的掃描坐標(biāo)值，而且因為共聚焦掃描顯微鏡的光學(xué)元件的光學(xué)效應(yīng)，該光學(xué)效應(yīng)在已知的掃描顯微鏡或者用于操作掃描顯微鏡的方法中未加考慮。失真是成問題的，特別是要從多個并置的單個圖像組成成樣本的整個圖像的時候，因為此時圖像在它們的邊緣處彼此并不匹配。此外，在將以共聚焦方式獲取的樣本的圖像疊置于寬視場圖像上時，這可能更成問題，因為在圖像邊緣處的這種失真對于寬視場成像不會產(chǎn)生，而樣本的兩幅圖像在一起不會適配，尤其是在圖像的邊緣處。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種用于確定用于操作共聚焦掃描顯微鏡的掃描單元的掃描坐標(biāo)值或者校正掃描坐標(biāo)值的方法，或者一種借助于掃描顯微鏡來創(chuàng)建樣本圖像的方法，其能夠利用簡單的手段創(chuàng)建樣本的精確圖像，特別是在圖像邊緣處。該目的通過獨立權(quán)利要求的特征來實現(xiàn)。有利的實施例出現(xiàn)在從屬權(quán)利要求中。根據(jù)第一方面，本發(fā)明特征在于通過笛卡爾圖像坐標(biāo)值到球面坐標(biāo)系統(tǒng)的坐標(biāo)轉(zhuǎn)換，根據(jù)樣本的要創(chuàng)建的圖像的像點的笛卡爾圖像坐標(biāo)，確定球面掃描坐標(biāo)值。根據(jù)該球面掃描坐標(biāo)值來操作該掃描單元。笛卡爾圖像坐標(biāo)值到球面坐標(biāo)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)換有助于樣本的圖像的像點(其通過對檢測光的檢測來確定)與共聚焦掃描顯微鏡的掃描單元的位置之間的精確關(guān)聯(lián)，掃描單元的該位置由球面掃描坐標(biāo)值來預(yù)定義。這得到了這樣的結(jié)果樣本的圖像精確地對應(yīng)于樣本，特別是在圖像的邊緣處。球面掃描坐標(biāo)值以一定格式存在，或者被格式化，以使掃描單?？筛鶕?jù)球面掃描坐標(biāo)值來操作。就這一點來說，其意即，將球面掃描坐標(biāo)值保存在關(guān)聯(lián)明細(xì)例如表格中，之后將該關(guān)聯(lián)明細(xì)存儲在掃描顯微鏡的控制單元的存儲單元中，并且在共聚焦掃描顯微鏡的工作期間由控制單元讀出。調(diào)制驅(qū)動信號，以使掃描單元的定位元件居于與球面掃描坐標(biāo)值對應(yīng)的位置。或者，能夠?qū)⑶蛎鎾呙枳鴺?biāo)值正好以如下方式格式化，即，它們已經(jīng)作為驅(qū)動信號、例如調(diào)制過的而存在(無需轉(zhuǎn)換)；并且將這些例如以數(shù)字化方式存儲在控制單元的存儲單元中。在每種情形下，掃描單元的位置指的都是，借助于掃描單元而偏轉(zhuǎn)的照明光束與在掃描單元參考位置時借助于掃描單元而偏轉(zhuǎn)的參考光束形成的夾角。在有利的實施例中，當(dāng)確定該球面掃描坐標(biāo)值時對掃描顯微鏡的不同的變焦步進(zoom step)加以考慮?！白兘埂敝傅氖菂^(qū)域或者坐標(biāo)區(qū)域的極限。變焦步進對應(yīng)于放大率步進，并且也能夠這樣稱呼它。就此而言，如果該不同的變焦步進是通過將像點彼此之間的間隔預(yù)定義為與變焦步進相關(guān)來加以考慮的，那么這是特別有利的。對變焦步進加以考慮使得總是可以保證以后操作掃描顯微鏡時圖像創(chuàng)建有相同的精度，而不管變焦步進如何。根據(jù)一個改進，借助于坐標(biāo)轉(zhuǎn)換來僅僅確定第一球面掃描坐標(biāo)值，而通過對該第一掃描坐標(biāo)值進行插值來確定第二球面掃描坐標(biāo)值。當(dāng)僅僅具有有限的計算能力或者當(dāng)球面掃描坐標(biāo)值的確定必須要特別快地實施的時候，例如在掃描顯微鏡的操作期間，這是特別有利的。一個改進提供了將預(yù)定義掃描坐標(biāo)值基于該球面掃描坐標(biāo)值來校正。這使得能夠驅(qū)動已有的掃描顯微鏡，特別是它的掃描單元，從而獲得圖像的精準(zhǔn)確定。預(yù)定義掃描坐標(biāo)值可以例如用球面掃描坐標(biāo)值來替代，或者可以僅僅對預(yù)定義掃描坐標(biāo)值和球面什么坐標(biāo)值之間的不同進行確定，并且僅僅基于該不同來校正預(yù)定義掃描坐標(biāo)值，就此而言，也可以將該不同稱為“校正項”。根據(jù)第二方面，本發(fā)明的顯著之處在于，將照明光束經(jīng)由掃描顯微鏡的掃描單元引導(dǎo)到參考樣本上。根據(jù)預(yù)定義掃描坐標(biāo)值驅(qū)動掃描單元，以使照明光束對參考樣本進行光學(xué)掃描。根據(jù)預(yù)定義掃描坐標(biāo)值測出來自參考樣本的檢測光。將預(yù)定義掃描坐標(biāo)值與該參考樣本的要確定的圖像的像點的圖像坐標(biāo)值關(guān)聯(lián)起來?；谠趯?yīng)的預(yù)定義掃描坐標(biāo)值處測出的檢測光對在圖像坐標(biāo)值處的像點進行確定?；诖_定的像點創(chuàng)建參考樣本的圖像。將參考樣本的該圖像與該參考樣本進行比較，并且，根據(jù)該比較校正預(yù)定義掃描坐標(biāo)值。參考樣本的圖像的創(chuàng)建、以及基于所創(chuàng)建的圖像實施的預(yù)定義掃描坐標(biāo)值的校正，能夠有助于例如在較不精確的預(yù)定義掃描坐標(biāo)值的情形下確定校正項的能力，采用該校正項，較不精確的掃描坐標(biāo)值能夠用相對其較為精確的掃描坐標(biāo)值來代替。沒有了借助于參考樣本所實施的校正，就很可能產(chǎn)生由于掃描顯微鏡的光學(xué)效應(yīng)而導(dǎo)致的樣本的圖像失真現(xiàn)象，即使存在精確的預(yù)定義掃描坐標(biāo)(例如上面述及的球面掃描坐標(biāo)值)。這些失真能夠借助于參考樣本而考慮進來并將其消除。任何具有明確結(jié)構(gòu)的樣本，例如包括緊密點陣的樣本，適合作為參考樣本。例如通過微芯片制造中已知的方式蝕刻半導(dǎo)體襯底能夠產(chǎn)生具有非常精確的參考圖案的參考樣本。例如通過對參考樣本的圖像和參考樣本的精確產(chǎn)生的參考圖像進行比較，能夠產(chǎn)生參考樣本的圖像和參考樣本之間的比較。特別地，該比較能夠借助于計算機上的圖像處理系統(tǒng)來自動實施。預(yù)定義掃描坐標(biāo)值的校正可以例如通過用校正掃描坐標(biāo)值來代替預(yù)定義掃描坐標(biāo)值而產(chǎn)生；或者可以僅僅對預(yù)定義掃描坐標(biāo)值和校正掃描坐標(biāo)值之間的不同值進行確定，并且能夠?qū)⒔?jīng)如此確定得到的不同用預(yù)定義掃描坐標(biāo)值來校正構(gòu)成校正項。在一個改進中，參考樣本的圖像以該掃描顯微鏡的不同的變焦步進來獲取，并且根據(jù)對應(yīng)的變焦步進校正預(yù)定義掃描坐標(biāo)值。換句話說，用于確定校正掃描坐標(biāo)值的該方法是以掃描顯微鏡的不同的放大率來實施的，并且經(jīng)確定校正掃描坐標(biāo)值，或者對應(yīng)的校正項以與對應(yīng)的變焦步進或者放大步進相關(guān)聯(lián)的方式保存，該掃描坐標(biāo)值以后在掃描顯微鏡的操作期間按照當(dāng)前設(shè)置的變焦步進來預(yù)定義。用于確定校正掃描坐標(biāo)值的該方法能夠在按照期望地使用共聚焦掃描顯微鏡之前，或者也可以在將掃描顯微鏡完成之后，例如以常規(guī)校準(zhǔn)的方式來實施。根據(jù)第三方面，本發(fā)明的顯著之處在于，將照明光束經(jīng)由掃描顯微鏡的掃描單元引導(dǎo)到樣本上，根據(jù)預(yù)定義掃描坐標(biāo)值驅(qū)動掃描單元，使得照明光束對樣本進行光學(xué)掃描，確定用以表示該掃描單元的真實位置的掃描單元的掃描坐標(biāo)值，校正經(jīng)確定的掃描坐標(biāo)值。根據(jù)校正掃描坐標(biāo)值測出來自樣本的檢測光。將校正掃描坐標(biāo)值與要確定的樣本的圖像的像點的圖像坐標(biāo)值關(guān)聯(lián)起來?；谠趯?yīng)的校正掃描坐標(biāo)值處測出的檢測光來確定在圖像坐標(biāo)值處的像點?；诖_定的像點來創(chuàng)建樣本的圖像。根據(jù)第四方面，本發(fā)明的顯著之處是一種與根據(jù)第三方面所述的方法非常對應(yīng)的方法。與之相反，首先根據(jù)確定的掃描坐標(biāo)值測出來自樣本的檢測光，然后校正確定的掃描坐標(biāo)值，其結(jié)果是，檢測光與掃描坐標(biāo)值的關(guān)聯(lián)性被修改。根據(jù)第一或者第二方面，原則上，能夠?qū)㈩A(yù)定義和/或球面和/或校正掃描坐標(biāo)值用來驅(qū)動掃描單元。與此相反，根據(jù)第三方面和第四方面所述的經(jīng)確定的掃描坐標(biāo)值的校正指的是，在掃描顯微鏡的操作期間測出的掃描坐標(biāo)值。如果掃描單元，特別是掃描單元的定位元件，是以閉環(huán)控制系統(tǒng)來操作的，那么就也能夠?qū)㈩A(yù)定義掃描坐標(biāo)值稱為“目標(biāo)”掃描坐標(biāo)值，并且也能夠?qū)⒔?jīng)確定的掃描坐標(biāo)值稱為“實際”掃描坐標(biāo)值。換句話說，例如，按照第一和第二方面，能夠產(chǎn)生目標(biāo)掃描坐標(biāo)值的校正，而按照第三或者第四方面，能夠產(chǎn)生實際掃描坐標(biāo)值的校正。就此而言，例如，預(yù)定義掃描坐標(biāo)值能夠是前述的球面掃描坐標(biāo)值或者校正掃描坐標(biāo)值，和/或經(jīng)確定的掃描坐標(biāo)值能夠是未校正掃描坐標(biāo)值。


下面參照示意性附圖來進一步解釋本發(fā)明的示例性實施例，其中圖I示出共聚焦掃描顯微鏡，圖2繪出坐標(biāo)轉(zhuǎn)換， 圖3示出用于實施坐標(biāo)轉(zhuǎn)換的公式，
圖4使出參考樣本和該參考樣本的圖像，圖5示出關(guān)聯(lián)明細(xì)，圖6示出用于識別校正掃描坐標(biāo)值的方法，圖7是用于操作共聚焦掃描顯微鏡的第一種方法的流程圖，圖8是用于操作共聚焦掃描顯微鏡的第二種方法的流程圖，在整個附圖中，同一設(shè)計或者功能的元件用相同的附圖標(biāo)記標(biāo)示。
具體實施方式

圖I示出共聚焦掃描顯微鏡20。掃描顯微鏡20包括產(chǎn)生照明光束24的激光源
22。照明光束24能夠包含單波長的光或者多波長的光，例如寬波段激光，特別是白光。作為選擇或者額外地，掃描顯微鏡20能夠包含例如產(chǎn)生不同波長的光或者波長區(qū)段的另外的激光源。將照明光束24引導(dǎo)到主分束器26上，主分束器26由例如二向色鏡構(gòu)成，其將照明光束24偏轉(zhuǎn)到掃描單元28。掃描單元28優(yōu)選包含與兩個或者多個定位元件耦合的一個或者多個鏡子。定位元件借助于掃描顯微鏡20的控制單元(未繪出)驅(qū)動，并且以這樣的方式耦合到鏡子在驅(qū)動定位元件時，鏡子以不同的方向偏轉(zhuǎn)照明光束24。掃描單元28將照明光束24引導(dǎo)到物鏡30，物鏡30將照明光束24聚焦到樣本上，該樣本可以是例如參考樣本32。樣本例如是組織樣本，其包括被導(dǎo)入到樣本中的發(fā)熒光的物質(zhì)、和/或包括借助于照明光束24可激活并在激活狀態(tài)下能夠被激發(fā)而發(fā)出熒光的物質(zhì)。任何具有明確結(jié)構(gòu)的樣本，例如包括緊密點陣的樣本，適合作為參考樣本32。這種參考樣本32能夠例如在微芯片制造中從半導(dǎo)體襯底蝕刻出。這能夠有助于極精確地制造參考樣本的結(jié)構(gòu)，甚至是在次納米范圍內(nèi)。來自樣本的檢測光相應(yīng)地包含例如突光或者反射光，其以檢測光束34的形式通過物鏡30到達掃描單元28，物鏡30將檢測光束34引導(dǎo)到主分束器26上，主分束器26允許檢測光通過到達檢測針孔36，從而到達檢測器38，該檢測針孔例如是一個開口。掃描單元28按照控制單元的存儲介質(zhì)中存儲的掃描坐標(biāo)值操作，并且測出的檢測光根據(jù)掃描坐標(biāo)值而測出。換句話說，借助于控制單元，將測出的檢測光與當(dāng)前設(shè)置的掃描單元28的位置關(guān)聯(lián)起來，該位置是用掃描坐標(biāo)值表示的。這些掃描坐標(biāo)值能夠是用以驅(qū)動掃描單元28的掃描坐標(biāo)值，或者，作為選擇，能夠提供測出掃描單元28的定位元件的真實位置的傳感器；然后就能夠?qū)⒁栽摲绞綔y出的掃描坐標(biāo)值與相應(yīng)的測出的檢測光關(guān)聯(lián)起來。如果掃描單元28的定位元件是借助于閉環(huán)控制系統(tǒng)來操作的，那么能夠?qū)⒂靡则?qū)動掃描單元28的掃描坐標(biāo)值稱為“目標(biāo)”掃描坐標(biāo)值，并且能夠?qū)y出的掃描坐標(biāo)值稱為“實際”掃描坐標(biāo)值。圖2示出坐標(biāo)轉(zhuǎn)換，通過該轉(zhuǎn)換，將要創(chuàng)建的圖像的像點的笛卡爾圖像坐標(biāo)值Xn、Yn與用以代表掃描單元28的定位元件的位置的球面掃描坐標(biāo)值Φη和Θ n關(guān)聯(lián)起來。該坐標(biāo)轉(zhuǎn)換能夠通過例如圖3所示的公式Fl到F6來實施。笛卡爾坐標(biāo)到球面坐標(biāo)的轉(zhuǎn)換特別地在圖2中示出，并且按照圖3的公式來實施。笛卡爾坐標(biāo)系統(tǒng)包括X軸40、Y軸42和Z軸44，每一個都與其它相垂直。作為選擇，如果僅僅顯示一個例如由X軸40和Y軸42定義的二維笛卡爾面，那么可能也夠了。在笛卡爾坐標(biāo)系統(tǒng)中能夠繪出中間像平面52和樣本平面54上的點，特別是圖像坐標(biāo)值Xn、Yn。該笛卡爾坐標(biāo)系統(tǒng)被布置成Z軸44表示與參考方向和位置對應(yīng)的方向和位置。把在參考方向上偏轉(zhuǎn)和位于Z軸44上的光束稱為參考光束。位于參考位置的掃描單兀28沿著參考方向偏轉(zhuǎn)參考光束。如果照明光束24對應(yīng)于參考光束，那么它將到達樣本平面上的點Χ(ι、7ο，該點在中間像平面52中對應(yīng)于像坐標(biāo)值為X0>Y0的像點。轉(zhuǎn)換箭頭50表示相對于參考光束偏轉(zhuǎn)的照明光束24。轉(zhuǎn)換箭頭50相對于Z軸40的角度為O1，并且相對于由X軸40和Z軸44構(gòu)成的平面的角度為Θ1Ι5以這種方式偏轉(zhuǎn)的照明光束24到達中間像平面52上的點Xl、yi，在樣本平面54內(nèi)與樣本上坐標(biāo)值為XpY1的點對應(yīng)。也可以將角度Φη和θ η稱為“掃描坐標(biāo)值”。公式Fl表示笛卡爾圖像坐標(biāo)到球面坐標(biāo)系統(tǒng)轉(zhuǎn)換的原理。公式F2表示借助于轉(zhuǎn)換箭頭50實施的轉(zhuǎn)換。轉(zhuǎn)換箭頭在公式F2中指的是“H θ ;Φ)”，其中Γ(ι是光束繞其偏轉(zhuǎn)的點與中間像平面52之間的距離(參考圖2)。這得到公式F3中示出的用于笛卡爾X坐標(biāo) 的校正，以及公式F4中示出的用于笛卡爾Y坐標(biāo)的校正。重新配置這些公式得到公式F5所示的用于第一球面坐標(biāo)值Oi的關(guān)系以及公式F6所示的用于第二球面掃描坐標(biāo)值Θ i的關(guān)系。圖4示出參考樣本32的表面、以及參考樣本32的圖像60。為了獲取參考樣本32的圖像60，能夠?qū)⑷缟纤_定的球面掃描坐標(biāo)值Φη、θ η用作掃描單元28的驅(qū)動值。然而，即使利用這種精確的球面掃描坐標(biāo)值Φη、θη，在參考樣本的圖像60的邊緣處，仍然能夠產(chǎn)生失真，為便于理解，在圖4中夸大地繪出該情形。這些失真可能源于例如掃描顯微鏡20的光學(xué)元件的光學(xué)效應(yīng)。作為選擇，也能夠使用相對不太精確的掃描坐標(biāo)值，例如借助于數(shù)學(xué)近似所確定的掃描坐標(biāo)值來操作掃描顯微鏡20。那么該失真一方面源自上述光學(xué)效應(yīng)，另一方面源自在確定掃描坐標(biāo)值時的近似。圖5示出以表格形式繪出的關(guān)聯(lián)明細(xì)。該關(guān)聯(lián)明細(xì)能夠存儲在例如掃描單元28的存儲介質(zhì)中和/或能夠借助于上面解釋的坐標(biāo)轉(zhuǎn)換和/或參考樣本32的圖像60的獲取而產(chǎn)生。為了按照所期望的操作掃描顯微鏡20，原則上僅僅將所繪表格的列中的兩列存儲在控制單元中就夠了。例如，能夠存儲第一和第二列、第一和第三列、或者第一和第四列。這樣就分別產(chǎn)生了笛卡爾圖像坐標(biāo)值Xn、Yn與球面掃描坐標(biāo)值Φη、θη或者校正掃描坐標(biāo)值Φλ、0nk、或者借助于校正項Φη Λ θ nL所校正的球面掃描坐標(biāo)值Φη、θ η之間的關(guān)聯(lián)。球面坐標(biāo)值Φη、θ η最好借助于圖2和圖3所解釋的坐標(biāo)轉(zhuǎn)換來獲得。作為選擇或者額外地，校正掃描坐標(biāo)值Φη1 、Θ nk能夠僅僅借助于參考樣本32的圖像60的所獲取的圖像，或者借助于坐標(biāo)轉(zhuǎn)換和參考樣本32的圖像60的所獲取的圖像來確定。這同樣用于對于該表格的第四列，在該列中，球面掃描坐標(biāo)值Φη、θ η借助于校正項φηΙΛ Qhl校正，校正項是通過將球面掃描坐標(biāo)值Φη、θ η和校正掃描坐標(biāo)值ΘΛ比較而獲得的。圖6示出借助于參考樣本32確定校正掃描坐標(biāo)值Θ nk的程序的流程圖。在步驟S2中，根據(jù)預(yù)定義掃描坐標(biāo)值而將參考樣本32光學(xué)掃描。預(yù)定義掃描坐標(biāo)值能夠是球面掃描坐標(biāo)值Φη、θ η或者相對于其不精確的掃描坐標(biāo)值。在步驟S4中，根據(jù)預(yù)定義掃描坐標(biāo)值檢測從參考樣本32反射的檢測光。換句話說，除了其他之外，所測出的是，掃描單元28在檢測光的特定元件被測出的那個時刻怎樣被激活。
在步驟S6中，根據(jù)檢測光創(chuàng)建參考樣本32的圖像60。特別地，參考樣本32的圖像從單獨的像點匯總，并且像點是基于檢測光確定的。這里，借助于圖5所示的關(guān)聯(lián)規(guī)則，能夠產(chǎn)生對應(yīng)的預(yù)定義掃描坐標(biāo)值、特別是球面掃描坐標(biāo)值Φη、θ η或者借助于球面掃描坐標(biāo)值Φη、θ η校正的校正掃描坐標(biāo)值ΦηΚ Θ nk,與像點的笛卡爾圖像坐標(biāo)值Xn、Yn之間的關(guān)聯(lián)。參考樣本32的區(qū)域(檢 測光從該區(qū)域發(fā)出)因此而被獲知，從而能夠確定特定的像點。在步驟S8中，將參考樣本32的圖像60與參考樣本32進行比較。例如，能夠創(chuàng)建參考樣本32的參考圖像，并且例如借助于計算機中存儲的圖像處理程序，能夠?qū)⒖紭颖?2的圖像60與該參考圖像進行比較。該比較包含了對參考樣本32的圖像60和參考圖像之間的偏離、特別是失真的檢測。例如，能夠?qū)D像60的交叉點與參考圖像的交叉點進行比較，并且能夠確定它們的間隔和偏移方向，并用于校正。在步驟SlO中，根據(jù)該比較來校正預(yù)定義掃描坐標(biāo)值。在這個校正中，特別地，這樣考慮參考點的偏移這一因素，即，當(dāng)隨后驅(qū)動掃描單元28時，圖像60的交叉點對應(yīng)于參考樣本32中的參考點。除了球面掃描坐標(biāo)值Φη、θ η或者預(yù)定義掃描坐標(biāo)值,還能夠?qū)⑿Ｕ龗呙枳鴺?biāo)值ΦηΚ 0nk存儲在該關(guān)聯(lián)明細(xì)中。另一選擇，能夠?qū)㈩A(yù)定義掃描坐標(biāo)值用校正值ΦηΚ 0nk來替代。另一選擇，僅僅確定預(yù)定義掃描坐標(biāo)值和校正掃描坐標(biāo)值ΦηΚΘ nk之間的不同的項，并且與預(yù)定義掃描坐標(biāo)值關(guān)聯(lián)存儲。當(dāng)對另外的樣本例如組織樣本進行檢查時，于是如參照圖I所述，就能夠基于校正掃描坐標(biāo)值θη1 或者帶有校正值φΛ、Θ&的預(yù)定義掃描坐標(biāo)值來驅(qū)動掃描單元28。如果掃描單元28的定位元件的位置是以閉環(huán)的方式來控制的，那么校正掃描坐標(biāo)值Φη1 、Θ &或者帶有校正值ΦΛ、Θ nL的預(yù)定義掃描坐標(biāo)值就是定義掃描單元28的定位元件的目標(biāo)位置的目標(biāo)掃描坐標(biāo)值。圖7示出用于操作共聚焦掃描顯微鏡20的方法的流程圖。該方法適于獲取組織樣本的圖像。在步驟S12中，將樣本作為預(yù)定義掃描坐標(biāo)值的函數(shù)進行光學(xué)掃描。預(yù)定義掃描坐標(biāo)值能夠是通過近似而確定的掃描坐標(biāo)值，球面掃描坐標(biāo)值Φη、θη，或者通過近似而確定的、借助于球面掃描坐標(biāo)值Φη、θ η校正的掃描坐標(biāo)值，也即，校正掃描坐標(biāo)值ΦΛ、
9 nk。在步驟S14中，測出對應(yīng)于掃描單元28的定位元件的真實位置的掃描坐標(biāo)值。優(yōu)選的是，為此目的而提供測出定位元件的位置的傳感器。如果掃描單元28是借助于閉環(huán)控制系統(tǒng)而操作的，那么也能夠?qū)y出的掃描坐標(biāo)值稱為“實際”掃描坐標(biāo)值。在步驟S16中，對測出的掃描坐標(biāo)值進行校正。最好，測出的掃描坐標(biāo)值(如果它們是通過近似所確定的掃描坐標(biāo)值)借助于球面掃描坐標(biāo)值Φη、Θ n和/或借助于圖6中方法所示的校正來進行校正。在步驟S18中，根據(jù)校正掃描坐標(biāo)值測出檢測光。在步驟S20中，基于測出的檢測光將樣本的圖像匯總，對應(yīng)于圖6所示方法的步驟S6中的創(chuàng)建參考樣本32的圖像。圖8示出用于操作共聚焦掃描顯微鏡20的方法，作為圖7所示的用于操作掃描顯微鏡20的方法的一種替代。用于操作掃描顯微鏡20的第二程序的步驟S22到S30對應(yīng)于用于操作掃描顯微鏡的第一方法的步驟S12到S20，步驟S26和S28與步驟S16和S18相比在次序上是相反的。特別地，首先執(zhí)行步驟S26，在該步驟中，根據(jù)測出的掃描坐標(biāo)值，特別是根據(jù)還未校正的測出的掃描坐標(biāo)值、或者還未校正的實際掃描坐標(biāo)值，來測出檢測光。然后，在步驟S28中，隨之對測出的掃描坐標(biāo)值或者實際掃描坐標(biāo)值進行校正。
換句話說，在圖7所示的方法中，實際值的校正是在圖像的獲取期間或者檢測光的檢測期間產(chǎn)生；與此相反，圖8中的方法還能夠在以后實施，在檢測光的檢測已經(jīng)結(jié)束之后。對于例如現(xiàn)有的和已知的產(chǎn)生較不精確的樣本圖像的掃描顯微鏡，借助于圖8中所示的方法，其仍然可以在后面的時間創(chuàng)建沒有失真的精確的圖像。圖I中所示的共聚焦掃描顯微鏡20僅僅是示意性地繪出。特別地，這種顯微鏡一一其在相關(guān)的技術(shù)資料中廣為人知——包括非常多的鏡子、孔徑和光學(xué)元件諸如聚焦透鏡和準(zhǔn)直透鏡。此外，不是熒光顯微的顯微方法也能夠利用共聚焦掃描顯微鏡來實施。本發(fā)明的方法可以應(yīng)用于所有的掃描方法。部件列表20掃描顯微鏡22激光源24照明光束26主分束器28掃描單元30 物鏡32參考樣本34檢測光束36檢測針孔38檢測器40X 軸42Y 軸44Z 軸50轉(zhuǎn)換箭頭52中間像平面54樣本平面60參考樣本的圖像Xn，In樣本坐標(biāo)值Xn, Yn 笛卡爾圖像坐標(biāo)值Φη、θη掃描坐標(biāo)值Φ κ、ΘΛ校正掃描坐標(biāo)值Φη > Θ nL 校正項F1-F6公式一到六S2-S20 步驟二到二十
權(quán)利要求
1.一種用于確定用于操作共聚焦掃描顯微鏡(20)的掃描單兀(28)的掃描坐標(biāo)值(Φη，θη)的方法，其中 借助于笛卡爾圖像坐標(biāo)值(Χη，Υη)到球面坐標(biāo)系統(tǒng)的坐標(biāo)轉(zhuǎn)換，根據(jù)樣本(32)的要創(chuàng)建的圖像(60)的像點的笛卡爾圖像坐標(biāo)(Χη，Υη)確定球面掃描坐標(biāo)值(Φη，θη)，以及根據(jù)該球面掃描坐標(biāo)值(Φη，θη)來操作該掃描單元(28)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中當(dāng)確定該球面掃描坐標(biāo)值(Φη，θη)時考慮該掃描顯微鏡(20)的不同的可能變焦步進。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中該不同的變焦步進是通過將該像點彼此之間的間隔預(yù)定義為與該變焦步進相關(guān)來考慮的。
4.根據(jù)在先權(quán)利要求之一的方法，其中借助于該坐標(biāo)轉(zhuǎn)換來確定第一球面掃描坐標(biāo)值(Φη，θ η)，并且通過對該第一掃描坐標(biāo)值(Φη，θ η)進行插值來確定第二球面掃描坐標(biāo)值(Φ η，θ J。
5.根據(jù)在先權(quán)利要求之一的方法，其中預(yù)定義掃描坐標(biāo)值是基于該球面掃描坐標(biāo)值(Φη，θη)來校正的。
6.一種用于確定用于操作共聚焦掃描顯微鏡(20)的掃描單兀(28)的校正掃描坐標(biāo)值(ΦΛ，0J的方法，其中 將照明光束(24)經(jīng)由該掃描顯微鏡(20)的掃描單元(28)引導(dǎo)到參考樣本(32)上，根據(jù)預(yù)定義掃描坐標(biāo)值(Φη，θη)來驅(qū)動該掃描單元(28)，使得該照明光束(24)光學(xué)掃描該參考樣本(32)， 根據(jù)預(yù)定義掃描坐標(biāo)值(Φη，θη)來測出來自該參考樣本(32)的檢測光， 將該預(yù)定義掃描坐標(biāo)值(Φη，θη)與該參考樣本(32)的要確定的圖像(60)的像點的圖像坐標(biāo)值(Xn，Yn)關(guān)聯(lián)起來， 基于在對應(yīng)的預(yù)定義掃描坐標(biāo)值(Φη，θη)處測出的該檢測光(34)確定在該圖像坐標(biāo)值(Xn，Yn)處的像點， 基于該確定的像點創(chuàng)建該參考樣本(32)的圖像， 將該參考樣本(32)的該圖像￠0)與該參考樣本(32)進行比較，并且 根據(jù)比較校正該預(yù)定義掃描坐標(biāo)值(Φη，θη)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中該參考樣本(32)的該圖像￠0)以該掃描顯微鏡(20)的不同的變焦步進來獲取，并且其中根據(jù)對應(yīng)的變焦步進將該預(yù)定義掃描坐標(biāo)值(Φη，θη)進行校正。
8.一種借助于共聚焦掃描顯微鏡(20)來創(chuàng)建樣本(32)的圖像(60)的方法，其中 將照明光束(24)經(jīng)由該掃描顯微鏡(20)的掃描單元(28)引導(dǎo)到樣本(32)上， 根據(jù)預(yù)定義掃描坐標(biāo)值(Φη，θη)來驅(qū)動該掃描單元(28)，使得該照明光束(24)光學(xué)掃描該樣本(32)， 確定用以表示該掃描單元(28)的真實位置的該掃描單元(28)的掃描坐標(biāo)值， 校正該確定的掃描坐標(biāo)值， 根據(jù)校正掃描坐標(biāo)值(ΦΛ，QJ來測出來自該樣本(32)的檢測光(34)， 將該校正掃描坐標(biāo)值(Φηκ，0J與要確定的該樣本(32)的圖像(60)的像點的圖像坐標(biāo)值(Xn，Yn)關(guān)聯(lián)起來，基于在對應(yīng)的校正掃描坐標(biāo)值(ΦΛ，9J處測出的該檢測光(34)來確定在該圖像坐標(biāo)值(Χη，Υη)處的像點，并且 基于該確定的像點來創(chuàng)建該樣本(32)的圖像(60)。
9.一種借助于共聚焦掃描顯微鏡(20)來創(chuàng)建樣本(32)的圖像的方法，其中 將照明光束(24)經(jīng)由該掃描顯微鏡(20)的掃描單元(28)引導(dǎo)到樣本(32)上， 根據(jù)預(yù)定義掃描坐標(biāo)值(Φη，θη)來驅(qū)動該掃描單元(28)，使得該照明光束(24)光學(xué)掃描該樣本(32)， 確定用以表示該掃描單元(28)的真實位置的該掃描單元(28)的掃描坐標(biāo)值， 根據(jù)該確定的掃描坐標(biāo)值來測出來自該樣本(32)的檢測光(34)， 校正該確定的掃描坐標(biāo)值， 將該校正掃描坐標(biāo)值(Φηχ，0J與要確定的該樣本(32)的圖像(60)的像點的圖像坐標(biāo)值(Xn，Yn)關(guān)聯(lián)起來， 基于在對應(yīng)的校正掃描坐標(biāo)值(ΦΛ，9J處測出的該檢測光(34)來確定在該圖像坐標(biāo)值(Χη，Υη)處的像點，并且 基于該確定的像點來創(chuàng)建該樣本(32)的圖像(60)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或者9的方法，其中該預(yù)定義的掃描坐標(biāo)值是根據(jù)權(quán)利要求I到5之一的該球面掃描坐標(biāo)值(Φη，θ η)。
11.根據(jù)權(quán)利要求8-10之一的方法,其中該確定的掃描坐標(biāo)值是根據(jù)權(quán)利要求6或者7之一來校正的。
全文摘要
為了確定用于操作共聚焦掃描顯微鏡(20)的掃描單元(28)的掃描坐標(biāo)值(φn，θn)，借助于笛卡爾圖像坐標(biāo)值(Xn，Yn)到球面坐標(biāo)系統(tǒng)的坐標(biāo)轉(zhuǎn)換，根據(jù)樣本(32)的要創(chuàng)建的圖像(60)的像點的笛卡爾圖像坐標(biāo)(Xn，Yn)確定球面掃描坐標(biāo)值(φn，θn)。根據(jù)該球面掃描坐標(biāo)值(φn，θn)來操作該掃描單元(28)。
文檔編號G02B21/00GK102654638SQ20111044986
公開日2012年9月5日 申請日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月29日
發(fā)明者H·比爾克 申請人:徠卡顯微系統(tǒng)復(fù)合顯微鏡有限公司