專利名稱：超分辨率顯微鏡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及顯微鏡，更具體地，涉及一種用于通過以多個(gè)波長的光照射樣本從而 以高空間分辨率來觀察樣本的超分辨率顯微鏡。
背景技術(shù)：
本申請要求2009年12月11日提交的日本專利申請No. 2009-281179的優(yōu)先權(quán)， 此處以引證的方式并入其內(nèi)容。常規(guī)地，光學(xué)顯微鏡技術(shù)已經(jīng)得到長期的廣泛使用，而且已經(jīng)開發(fā)出各種類型的 顯微鏡。在近幾年中，隨著諸如激光技術(shù)和電子圖形技術(shù)的顯微鏡外圍技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)開 發(fā)出具有更高性能的顯微鏡系統(tǒng)。鑒于上述背景，提出了一種高性能顯微鏡，其不僅能夠控制將要獲得的圖像的對 比度，而且還能夠利用通過以多個(gè)波長的光照射樣本而導(dǎo)致的雙共振吸收過程來進(jìn)行化學(xué) 分析(例如，參見專利文獻(xiàn)1)。這種顯微鏡通過使用雙共振吸收來選擇特定分子，并且觀察由于特定的光躍遷而 導(dǎo)致的吸收和熒光發(fā)射。將參考圖14到圖17來描述這種理論。圖14示出了構(gòu)成樣本的 分子的價(jià)電子軌道的電子結(jié)構(gòu)。首先，使用波長為λ工的光將圖14中例示的處于基態(tài)(SO 狀態(tài)穩(wěn)定態(tài))中的分子所擁有的價(jià)電子軌道中的電子激勵(lì)為圖15中例示的第一受激態(tài) (Si狀態(tài))。然后，與之相似地，使用具有另一個(gè)波長λ 2的光來執(zhí)行到圖16中例示的第二 受激態(tài)(S2狀態(tài))的激勵(lì)。憑借這種受激態(tài)，分子在發(fā)出熒光或磷光的同時(shí)返回到如圖17 所例示的基態(tài)。在使用雙共振吸收過程的顯微鏡方法中，通過利用圖16中的吸收過程或圖17中 的熒光或磷光的發(fā)射，觀察到吸收圖像或發(fā)光圖像。使用這種顯微鏡方法，首先通過激光束 等利用具有共振波長λ工的光將構(gòu)成樣本的分子激勵(lì)為圖15中例示的Sl狀態(tài)，此時(shí)，單位 體積中的處于Sl狀態(tài)的分子的數(shù)量隨著照射光的強(qiáng)度增加而增加。給出了線性吸收系數(shù)作為每分子的吸收截面與每單位體積的分子數(shù)量的乘積，因 此，在圖16中例示的激勵(lì)過程中，隨后照射的共振波長λ 2的線性吸收系數(shù)強(qiáng)烈地取決于 首先施加的具有波長λ ,的光的強(qiáng)度。也就是說，可以使用波長λ工的光的強(qiáng)度來控制波長 λ 2的線性吸收系數(shù)。這表示，通過使用波長X1和波長λ 2的光照射樣本，可以使用波長 λ工的光完全控制發(fā)送圖像的對比度，以獲得波長λ 2的發(fā)送圖像。當(dāng)通過熒光或磷光而能夠執(zhí)行從圖16的受激態(tài)到圖17示出的基態(tài)的去激勵(lì)過程 時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度與處于Sl狀態(tài)中的分子的數(shù)量成比例。這使得即使將該顯微鏡用作熒光顯微 鏡時(shí)也能夠控制圖像對比度。此外，利用雙共振吸收過程的這種顯微鏡方法不僅能夠用于控制上述的圖像對比 度，而且還能夠用于進(jìn)行化學(xué)分析。也就是說，由于圖14中例示的最外層的價(jià)電子軌道具 有各個(gè)分子固有的能級，因此波長X1對于分子來說是不同的。同時(shí)，波長λ 2也為各個(gè)分 子所固有。
當(dāng)使用常規(guī)的單一波長照射樣本時(shí)，在某種程度上能夠觀察到特定分子的吸收圖 像或熒光圖像。但是，總體上，由于某些分子的吸收頻帶的波長范圍彼此交疊，因此在使用 單一波長照射樣本時(shí)不能準(zhǔn)確地識別該樣本的化學(xué)成分。另一方面，根據(jù)使用雙共振吸收過程的顯微鏡，通過使用波長X1和波長λ2這兩 種波長限定了吸收光或照射光的分子，使得能夠比常規(guī)方法更加準(zhǔn)確地識別出樣本的化學(xué) 成分。在價(jià)電子將被激勵(lì)的情況下，僅集中地吸收了相對于分子軸具有特定的電場矢量的 光。因而，能夠在獲得吸收圖像或熒光圖像時(shí)，即使針對同一分子也能夠識別出取向方向， 同時(shí)確定波長λ i和波長λ 2的偏光方向。近年來，已經(jīng)提出了熒光顯微鏡，通過使用雙共振吸收過程，該熒光顯微鏡具有超 過衍射極限的高空間分辨率(例如，參見專利文獻(xiàn)2)。圖18是例示了分子的雙共振吸收過程的概念圖，在該雙共振吸收過程中，使用波 長λ i的光將處于基態(tài)SO的分子激勵(lì)為第一受激態(tài)Si，并且使用波長λ 2的光將其進(jìn)一步 激勵(lì)為第二受激態(tài)S2。注意，圖18例示了來自該第二受激態(tài)S2的熒光對于某些類型的分 子十分微弱。圖18所例示的具有這種光學(xué)特性的分子經(jīng)歷了非常有趣的現(xiàn)象。圖19是例示了 與圖18相似的雙共振吸收過程的概念圖，其中，橫坐標(biāo)的X軸表示空間距離的延伸，并且示 出了以波長λ 2的光照射的空間區(qū)域Al和未以波長λ 2的光照射的空間區(qū)域AO。在圖19中，通過以波長X1W光進(jìn)行激勵(lì)，在該空間區(qū)域AO產(chǎn)生了大量處于Sl狀 態(tài)的分子，此時(shí)，可以觀察到從空間區(qū)域AO發(fā)射出的具有波長入3的熒光。但是，在空間區(qū) 域Al中，照射波長為λ 2的光在較高的水平上將處于Sl狀態(tài)的大多數(shù)分子立即激勵(lì)為S2 狀態(tài)，使得處于Sl狀態(tài)的分子消失。在若干分子中確認(rèn)了上述現(xiàn)象。結(jié)果，波長λ3的熒 光在空間區(qū)域Al中完全消失，此外，來自S2狀態(tài)的熒光本來并不存在，因此在空間區(qū)域Al 中完全地抑制了熒光本身(熒光抑制效果)。因此，熒光僅存在于空間區(qū)域AO中。從該顯微鏡的應(yīng)用領(lǐng)域方面來考慮，該結(jié)果具有非常重要的意義。也就是說，在常 規(guī)的掃描型激光顯微鏡中，使用聚光透鏡來會聚激光束以產(chǎn)生微光束。在這種情況下，微光 束的大小由衍射極限確定，而衍射極限由聚光透鏡的數(shù)值孔徑和波長來確定。結(jié)果，原則上 不能預(yù)期較高的空間分辨率。但是，在圖19的情況下，通過在空間中使兩種類型的光(波長為X1的光和波長 為λ2的光)部分地交疊，抑制了熒光區(qū)域，因此，通過例如注意波長X1的光的照射區(qū)域， 能夠使熒光區(qū)域比由聚光鏡的數(shù)值孔徑和波長確定的衍射極限更窄，這使得能夠充分提高 空間分辨率。此后，將把波長X1的光稱為泵浦光，并且將把波長λ2的光稱為消除光。因 此，通過采用這種原理，能夠?qū)崿F(xiàn)超過衍射極限且利用雙共振吸收過程的超分辨率顯微鏡， 如超分辨率熒光顯微鏡。例如，在采用Iihodamine 6G色素的情況下，通過照射波長為532nm的光(泵浦 光)，將lihodamine 6G的分子從SO狀態(tài)激勵(lì)為Sl狀態(tài)，從而發(fā)射出在波長560nm處具 有峰值的熒光。這時(shí)，當(dāng)照射波長為599nm的光(消除光)時(shí)，發(fā)生雙共振吸收過程，并 且Rhodamine 6G的分子躍遷到不太可能發(fā)射熒光的S2狀態(tài)。也就是說，通過同時(shí)向 Rhodamine 6G照射泵浦光和消除光，抑制了熒光發(fā)射。圖20是例示了常規(guī)地提出的超分辨率顯微鏡的主要部分的配置圖。這種超分辨率顯微鏡基于普通的激光掃描型熒光顯微鏡，并且主要由三個(gè)獨(dú)立的單元形成，即，光源單 元210、掃描單元230和顯微鏡單元250。光源單元210具有用于泵浦光的光源211和用于消除光的光源212。從泵浦光的光 源211發(fā)出的泵浦光被輸入到二向色棱鏡213，由二向色棱鏡213反射，然后被發(fā)出。從消 除光的光源212發(fā)出的消除光被偏振元件214偏振；由此偏振的光的相位被相位板215調(diào) 制；調(diào)制后的光被輸入并穿過二向色棱鏡213 ；并且，穿過的光與相同軸上的泵浦光組合， 由此被發(fā)出。在觀察被以Iihodamine 6G色素染色的樣本的情況下，泵浦光的光源211被這樣配 置，即，采用Nd: YAG激光器，并且發(fā)射波長為532nm的光(來自激光器的光的二次諧波)作 為泵浦光。此外，消除光的光源212被這樣配置，即，采用Nd:YAG激光器和拉曼頻移器，由 拉曼頻移器將Nd:YAG激光器的二次諧波轉(zhuǎn)換成波長為599nm的光，并且發(fā)射經(jīng)過轉(zhuǎn)換的光 作為消除光。相位板215被配置成使得消除光的相位差圍繞光軸做出2 π旋轉(zhuǎn)。例如，如圖21 所示，相位板215圍繞光軸具有八個(gè)獨(dú)立的區(qū)域，并且相位板215是通過蝕刻玻璃板而形成 的，使得各個(gè)相位被移位了消除光的波長的1/8。通過將穿過相位板215的光會聚，可以產(chǎn) 生其中電場在光軸處被抵消的中空形的消除光。在掃描單元230中，使相同的軸上從光源單元210發(fā)射出的泵浦光和消除光穿過 半棱鏡231，并且，光被兩個(gè)電流鏡232和233在二維方向上以擺動(dòng)的方式掃描，并且被輸 出到將稍后描述的顯微鏡單元250。此外，掃描單元230被這樣配置，即，從顯微鏡單元250 到達(dá)的熒光沿著與當(dāng)前路徑相反的路徑行進(jìn)，并且被半棱鏡231分離；分離出的熒光穿過 投影透鏡234、小孔235、以及陷波濾波器236和237 ；并且，由光電倍增器238接收到光。在圖20中，出于將附圖簡化的目的，將電流鏡232、233示為可在同一平面中擺動(dòng)。 注意，陷波濾波器236和237用于消除包含在熒光中的泵浦光和消除光。小孔235是用作 共焦光學(xué)系統(tǒng)的重要光學(xué)元件，其只允許在存在于目標(biāo)樣本中的特定的斷層面處發(fā)射的熒 光穿過。顯微鏡單元250是所謂的普通熒光顯微鏡，其中從掃描單元230到達(dá)的泵浦光和 消除光由半棱鏡251反射，并且由顯微鏡物鏡252會聚在包含有處于至少包括基態(tài)的三種 電子狀態(tài)的分子的目標(biāo)樣本253上。此外，從目標(biāo)樣本253發(fā)射的熒光由顯微鏡物鏡252 再次校直，由半棱鏡251反射，并且再次返回到掃描單元230，熒光的穿過了半棱鏡251的部 分被引導(dǎo)到目鏡透鏡254以使視覺觀察能夠成為熒光圖像。根據(jù)上述的超分辨率顯微鏡，能夠在目標(biāo)樣本253的聚光點(diǎn)處抑制除了消除光的 強(qiáng)度為零的光軸附近的光以外的熒光，結(jié)果，僅測量在比泵浦光的范圍窄的區(qū)域中存在的 熒光標(biāo)記物分子。因此，通過利用計(jì)算機(jī)以二維方式來不知各個(gè)測量點(diǎn)的熒光信號，能夠形 成具有比衍射極限的空間分辨率更高的分辨率的顯微鏡圖像。另外，利用上述的具有兩色照明的光學(xué)響應(yīng)的超分辨率顯微鏡強(qiáng)烈地依賴于偏 振，并且在不滿足預(yù)定的偏振條件時(shí)不能獲得預(yù)期的光學(xué)特性。例如，已經(jīng)知道，上述熒光 抑制效果很大程度上在兩色照明光的偏光方向相同時(shí)出現(xiàn)，并且該效果在偏光方向彼此正 交時(shí)減弱(例如，參見非專利文獻(xiàn)1)。此外，偏光狀態(tài)極大地影響了消除光的光束形狀。也就是說，在采用圖21中示出的相位板215的情況下，光束形狀根據(jù)偏光狀態(tài)而變化。例如，已經(jīng)知道，在通過偏振元件 214將消除光轉(zhuǎn)換成圓偏振光并且隨后使用具有高數(shù)值孔徑的透鏡將其會聚的情況下，光 軸方向上的偏光成分根據(jù)圓偏振光中的電場的旋轉(zhuǎn)方向而出現(xiàn)，并且中心處的強(qiáng)度并不變 成零，因此不能獲得具有中空結(jié)構(gòu)的光束形狀(例如，參見非專利文獻(xiàn)2)。這是由于，在 會聚在平面中具有正交電場矢量的光時(shí)，相互獨(dú)立地產(chǎn)生了與光軸方向平行的電場矢量成 分；并且，盡管中心處的強(qiáng)度在這些成分反平行時(shí)變?yōu)榱?，但是在這些成分平行時(shí)則接連地 增加這些成分。如上所述，當(dāng)消除光在焦平面上不具有中空形狀的光束時(shí)，泵浦光的熒光在中心 部分被抑制，導(dǎo)致空間分辨率的惡化。因此，需要優(yōu)化泵浦光和消除光的偏光狀態(tài)以獲得期 望的超分辨率效果。此外，為了獲得足夠的超分辨率效果，已經(jīng)知道，消除光的中空部分與泵浦光的峰 值點(diǎn)需要在焦平面上以大約30nm的精度彼此重合(例如，參見非專利文獻(xiàn)3)。另外，在采用圖21中示出的相位板215的情況下，在相位板215的中心部分與消 除光的中心部分不完全匹配時(shí)，即，在消除光的相位在關(guān)于光軸對稱的位置處不完全反轉(zhuǎn) 時(shí)，在焦平面上不能取消光軸上的電場，并且不能獲得理想的中空點(diǎn)。結(jié)果，不能獲得超分 辨率效果。因此，常規(guī)地，偏振元件214與相位板215被配置成可以獨(dú)立地調(diào)整，以便于獲得 超分辨率效果。常規(guī)技術(shù)參考專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 日本專利申請?zhí)亻_No. 8-184552。專利文獻(xiàn)2 日本專利申請?zhí)亻_No. 2001-100102。非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn) 1 :N. Bokor> Y. Iketaki、Τ. Watanabe> K. Daigoku、N. Davidson 禾口 Μ. Fujii，Opt. Comm.，272(1)，(2007)263-269。非專利文獻(xiàn)2 :Y. Iketaki, Τ. Watanabe, N. Bokor 和 Μ. Fujii, Opt Lett.， 32(2007)2357-2359ο非專利文獻(xiàn)3 :Υ. Iketaki、Τ. Watanabe、N. Bokor 禾Π Μ. Fujii，e-Journal of SurfaceScience and Nanotechnology,6(2008)175-179。

發(fā)明內(nèi)容
但是，根據(jù)其中如上所述地對偏振元件和相位板進(jìn)行獨(dú)立調(diào)整的常規(guī)設(shè)備，已知 獨(dú)立地執(zhí)行偏振元件的旋轉(zhuǎn)調(diào)整和相位板的定中心，因此，光軸例如由于棱鏡效果的出現(xiàn) 而傾斜或偏移。因此，為了使消除光的中空部分與泵浦光的峰值點(diǎn)以大約30nm的精度在焦 平面上相互重合，需要復(fù)雜且耗時(shí)的操作，這引起了加重用戶負(fù)擔(dān)的顧慮。鑒于上述情形，本發(fā)明的目的是提供一種超分辨率顯微鏡，該超分辨率顯微鏡無 需復(fù)雜的調(diào)整操作就能夠很容易地實(shí)現(xiàn)超分辨率效果。本發(fā)明的用于實(shí)現(xiàn)上述目的的第一方面是一種用于觀察包含具有至少兩種或更 多種量子態(tài)的物質(zhì)的樣本的超分辨率顯微鏡，該超分辨率顯微鏡包括光源部，其輸出用于將所述物質(zhì)從穩(wěn)定態(tài)激勵(lì)為第一量子態(tài)的第一照明光、和用于進(jìn)一步使所述物質(zhì)轉(zhuǎn)變到另 一量子態(tài)的第二照明光；光學(xué)系統(tǒng)，其包括顯微鏡物鏡并以使分別從所述光源部輸出的所 述第一照明光和所述第二照明光彼此部分交疊的方式將這些光會聚到所述樣本上；檢測 部，其檢測響應(yīng)于所述第一照明光和所述第二照明光的會聚而從所述樣本發(fā)射的光學(xué)響應(yīng) 信號；以及偏光控制元件，其設(shè)置有轉(zhuǎn)變所述第一照明光或所述第二照明光的偏光狀態(tài)的 偏光部件以及與所述偏光部件一體形成并對所述第二照明光的相位進(jìn)行空間調(diào)制的相位 調(diào)制部。本發(fā)明的第二方面存在于根據(jù)第一方面的所述超分辨率顯微鏡中，其中，所述偏 光控制元件被配置成使得所述第二照明光在所述樣本上的所述第二照明光與所述第一照 明光部分交疊的區(qū)域中具有最小值的光強(qiáng)。本發(fā)明的第三方面存在于根據(jù)第二方面的所述超分辨率顯微鏡中，其中，所述偏 光控制元件不對所述第一照明光的相位進(jìn)行空間調(diào)制，并且所述第一照明光在所述樣本上 的所述區(qū)域中的光軸上具有最大值的光強(qiáng)。本發(fā)明的第四方面存在于根據(jù)第一方面的所述超分辨率顯微鏡中，其中，所述相 位調(diào)制部包括通過光學(xué)介質(zhì)膜的層疊或通過蝕刻處理而被形成為具有臺階的多個(gè)區(qū)域，使 得所述第二照明光的相位在關(guān)于光軸對稱的位置處反轉(zhuǎn)。本發(fā)明的第五方面存在于根據(jù)第一方面的所述超分辨率顯微鏡中，其中，所述偏 光控制元件包括所述相位調(diào)制部和在軸向方向上觀察時(shí)同心地劃分的、圍繞所述相位調(diào)制 部的所述相位調(diào)制部以外的區(qū)域，并且其中，穿過所述相位調(diào)制部的所述第二照明光和穿 過所述相位調(diào)制部以外的所述區(qū)域的所述第二照明光在電場幅值方面具有相反的符號。本發(fā)明的第六方面存在于根據(jù)第一方面的所述超分辨率顯微鏡中，其中，所述相 位調(diào)制部由對所述第一照明光具有反射效果或透射型相位調(diào)制效果并對所述第二照明光 具有透射型相位調(diào)制效果的多層膜形成。本發(fā)明的第七方面存在于根據(jù)第一方面的所述超分辨率顯微鏡中，其中，所述物 質(zhì)是熒光物質(zhì)，并且所述第二照明光具有抑制所述熒光物質(zhì)的熒光發(fā)射的波長。本發(fā)明的第八方面存在于根據(jù)第一方面的所述超分辨率顯微鏡中，其中，所述物 質(zhì)是熒光物質(zhì)，并且所述第二照明光具有改變所述熒光物質(zhì)的熒光的光譜的波長，并且所 述檢測部設(shè)置有波段選擇部，所述波段選擇部透射響應(yīng)于所述第一照明光的照射而從所述 熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光的光譜，并且阻斷響應(yīng)于所述第二照明光的照射而從所述熒光物質(zhì)發(fā) 射的熒光的光譜。本發(fā)明的第九方面存在于根據(jù)第一方面的所述超分辨率顯微鏡中，其中，所述偏 光控制元件能夠繞所述第二照明光的光軸旋轉(zhuǎn)。本發(fā)明的第十方面存在于根據(jù)第一方面的所述超分辨率顯微鏡中，其中，所述偏 光部件針對所述第二照明光用作二分之一波長板，并且分別被會聚到所述樣本上的所述第 一照明光和所述第二照明光的偏光方向平行。本發(fā)明的第十一方面存在于根據(jù)第一方面的所述超分辨率顯微鏡中，其中，所述 偏光部件針對所述第二照明光用作四分之一波長板，并且分別被會聚到所述樣本上的所述 第一照明光和所述第二照明光中的至少一方的偏光方向是圓偏振光。本發(fā)明的第十二方面存在于根據(jù)第十一方面的所述超分辨率顯微鏡中，其中，分別被會聚到所述樣本上的所述第一照明光和所述第二照明光是偏光旋轉(zhuǎn)方向彼此相反的 圓偏振光。本發(fā)明的第十三方面存在于根據(jù)第一方面的所述超分辨率顯微鏡中，其中，所述 偏光控制元件是使所述第一照明光或所述第二照明光偏轉(zhuǎn)的反射型。本發(fā)明的第十四方面存在于根據(jù)第一方面的所述超分辨率顯微鏡中，其中，所述 偏光控制元件包含液晶或光子晶體作為所述偏光部件。本發(fā)明的第十五方面存在于根據(jù)第一方面的所述超分辨率顯微鏡中，其中，所述 光學(xué)系統(tǒng)具有棒狀鏡頭，所述棒狀鏡頭具有與所述顯微鏡物鏡的物側(cè)連接的內(nèi)窺鏡光學(xué)系 統(tǒng)。本發(fā)明的第十六方面存在于根據(jù)第一方面的所述超分辨率顯微鏡中，其中，所述 顯微鏡物鏡被配置成能夠?qū)λ鰳颖具M(jìn)行所述第一照明光和所述第二照明光的空間掃描。根據(jù)本發(fā)明的超分辨率顯微鏡，由于提供了其中一體形成了轉(zhuǎn)變第一照明光或第 二照明光的偏光狀態(tài)的偏光部件和空間調(diào)制第二照明光的相位的相位調(diào)制部的偏光控制 元件，因此無需復(fù)雜的調(diào)整操作就能夠容易地實(shí)現(xiàn)超分辨率效果。


圖IA和圖IB分別是示意性地例示了能夠用于根據(jù)本發(fā)明的超分辨率顯微鏡的偏 光控制元件的第一示例的配置的截面圖和平面圖；圖2A和圖2B分別是示意性地例示了能夠用于根據(jù)本發(fā)明的超分辨率顯微鏡的偏 光控制元件的第二示例的配置的截面圖和平面圖；圖3是例示了圖2A和圖2B中的偏光控制元件的光學(xué)特性的圖；圖4是例示了能夠用于根據(jù)本發(fā)明的超分辨率顯微鏡的偏光控制元件的第三示 例的光學(xué)特性的圖；圖5A和圖5B分別是例示了關(guān)于能夠用于根據(jù)本發(fā)明的超分辨率顯微鏡的偏光控 制元件的第四示例的示意性配置的截面圖和光學(xué)特性的圖；圖6是例示了能夠用于根據(jù)本發(fā)明的超分辨率顯微鏡的偏光控制元件的第五示 例的示意性配置的截面圖；圖7是例示了根據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施方式的超分辨率顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的主要部 分的示意性配置的圖；圖8是例示了根據(jù)本發(fā)明第二實(shí)施方式的超分辨率顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的主要部 分的示意性配置的圖；圖9是例示了根據(jù)本發(fā)明第三實(shí)施方式的超分辨率顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的主要部 分的示意性配置的圖；圖IOA和圖IOB是分別例示了紫外光照射前后熒光蛋白質(zhì)色素“Kaede”的色散光 譜的圖；圖11是例示了根據(jù)本發(fā)明第五實(shí)施方式的超分辨率顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的主要部 分的示意性配置的圖；圖12是例示了根據(jù)本發(fā)明第六實(shí)施方式的超分辨率顯微鏡的主要部分的示意性 配置的圖13是例示了根據(jù)本發(fā)明第七實(shí)施方式的超分辨率顯微鏡的主要部分的示意性 配置的圖；圖14是例示了構(gòu)成樣本的分子的價(jià)電子軌道的電子結(jié)構(gòu)的示意圖；圖15是例示了圖14中示出的分子的第一受激態(tài)的概念圖；圖16是例示了圖14中示出的分子的第二受激態(tài)的概念圖；圖17是例示了圖14所示的分子從第二受激態(tài)返回到基態(tài)的情況的概念圖；圖18是闡釋分子的雙共振吸收過程的概念圖；圖19是闡釋分子的雙共振吸收過程的概念圖；圖20是例示了常規(guī)的超分辨率顯微鏡的主要部分的配置圖；以及圖21是例示了圖20所示的相位板的配置的放大平面圖。
具體實(shí)施例方式首先，將描述能夠用于根據(jù)本發(fā)明的超分辨率顯微鏡的偏光控制元件的概述。圖IA和圖IB分別是示意性地例示了偏光控制元件的第一示例的配置的截面圖和 平面圖。偏光控制元件11設(shè)置在刺激光的獨(dú)立光路上，并且包括透射型偏光部件12和在 偏光部件12的發(fā)射側(cè)上形成的相位調(diào)制部13。偏光部件12由雙折射材料制成。在采用例 如晶體的情況下，將晶體切割成關(guān)于晶軸具有相位差和角度，并且將晶體的表面拋光。相對于入射光的波長具有1/2波長的相位差的偏光部件12例如能夠?qū)⑷肷涔獾?線偏振光轉(zhuǎn)變成被旋轉(zhuǎn)了給定角度的線偏振光，并且發(fā)射該線偏振光。此外，相對于入射光 的波長具有1/4波長的相位差的偏光部件12例如能夠?qū)⑷肷涔獾木€偏振光轉(zhuǎn)變成圓偏振 光，并且發(fā)射該圓偏振光。此外，通過關(guān)于入射光的偏振面來恰當(dāng)?shù)卦O(shè)置晶軸的方向，能夠 轉(zhuǎn)變成介于前者和后者之間的橢圓偏振光。注意，偏光部件12并不局限于晶體，而且能夠 使用諸如液晶或光子晶體的其它雙折射材料來制作偏光部件12。此外，還能夠采用Gran棱 鏡等作為偏光控制元件，當(dāng)然，能夠采用電光晶體，電光晶體能夠通過法拉第效應(yīng)對偏光方 向進(jìn)行電控。按照如下方式將相位調(diào)制部13形成為具有臺階將上述的偏光部件12的發(fā)射側(cè) 上的表面劃分為例如類似于圖21的圍繞光軸對稱的八個(gè)區(qū)域；并且，通過涂敷厚度階梯式 改變的光學(xué)薄膜或通過以階梯方式進(jìn)行蝕刻以具有不同的深度，各個(gè)軸對稱區(qū)域的相位相 差刺激光的波長入2的1/8。當(dāng)如上所述地將線偏振刺激光輸入到偏光控制元件11中時(shí)，偏光部件12轉(zhuǎn)變刺 激光的偏光狀態(tài)；相位調(diào)制部13對其波前進(jìn)行空間調(diào)制以使其具有軸對稱的相位分布；并 且進(jìn)行發(fā)射。例如，在將線偏振刺激光透過具有由四分之一波長板形成的偏光部件12的偏 光控制元件11時(shí)，偏光狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閳A偏振光，同時(shí)，其波前具有軸對稱的相位分布。因此，通過以如在非專利文獻(xiàn)2中公開的具有高數(shù)值孔徑的顯微鏡物鏡來會聚透 過偏光控制元件11的刺激光，能夠在電場強(qiáng)度被完全抵消的中心處形成理想的環(huán)帶光束 (ring-zone beam)。此外，在通過旋轉(zhuǎn)偏光控制元件11以使用偏光部件12調(diào)整偏光狀態(tài) 時(shí)，相位調(diào)制部13 —體地旋轉(zhuǎn)，因此，刺激光的軸并不偏移，并且總是穿過軸對稱的相位調(diào) 制部13的中心。這使得能夠會聚環(huán)帶刺激光以具有對于超分辨率顯微鏡來說理想的軸對 稱的強(qiáng)度分布。
圖2A和圖2B分別是示意性地例示了偏光控制元件的第二示例的配置的截面圖和 平面圖。偏光控制元件21設(shè)置在激勵(lì)光(excited light)和刺激光(stimulus light)所 共有的光路上，并且包括透射型偏光部件22和形成在偏光部件22的入射表面?zhèn)鹊谋砻嫔?的相位調(diào)制部23。例如與圖1中的偏光部件12相類似地形成偏光部件22，以轉(zhuǎn)變刺激光的 偏光狀態(tài)。相位調(diào)制部23被形成為使得在激勵(lì)光和刺激光的圓形光瞳面中將偏光部件22 的入射側(cè)上的表面例如以同心圓的方式劃分成兩個(gè)區(qū)域；與該圓形光瞳面的中心部分相對 應(yīng)的區(qū)域是調(diào)制區(qū)域23a;并且，在調(diào)制區(qū)域23a上涂敷了多層膜M。在該實(shí)施方式中，多 層膜M用作對激勵(lì)光具有反射功能的光學(xué)反射膜。如圖2A所示，多層膜M被這樣配置，即，在偏光部件22上經(jīng)由緩沖層27通過沉積 而交替地層疊對激勵(lì)光具有不同反射率的第一物質(zhì)25 (折射率na ( λ ))和第二物質(zhì)沈(折 射率nb( λ ))。已知第一物質(zhì)25與第二物質(zhì)沈分別具有膜厚度da和db，為了使這些物質(zhì) 用作激勵(lì)光的光學(xué)反射膜，光路的長度是例如激勵(lì)光的長度X1的四分之一，而且該長度只 需要滿足以下的表達(dá)式(1)。dana ( λ J = λ ,/4, dbnb (A1) = A1^ (1)在上述條件下設(shè)計(jì)出的多層膜M并不與波長與激勵(lì)光的波長不同的刺激光的干 涉條件相匹配，因此，刺激光沒有被反射而是被透射。此時(shí)，刺激光經(jīng)受了相位延遲。也就 是說，多層膜M具有對刺激光的相位進(jìn)行空間調(diào)制的操作，并且用作相位板。因此，在此情 況下，當(dāng)對穿過多層膜M的刺激光與不穿過多層膜M的刺激光進(jìn)行比較時(shí)，在同一光瞳面 中出現(xiàn)了由以下表達(dá)式(2)表示的相位差δ。注意，在表達(dá)式O)中，λ 2表示刺激光的波 長，并且m表示由第一物質(zhì)25與第二物質(zhì)沈形成的各對的對數(shù)量。 δ =m {dana ( λ 2) +dbnb ( λ 2)} _m (da+db) (2)在相位差δ滿足以下表達(dá)式(3)的情況下，在對穿過多層膜M的刺激光的波前 與穿過其它區(qū)域的刺激光的波前進(jìn)行比較時(shí)，電場幅值方面的幅值完全相同，但是符號相 反，如圖3所示。注意，在表達(dá)式(3)中，L代表整數(shù)。δ = (2L+1) λ J2 (3)因此，在光瞳面中，在不穿過多層膜M的刺激光和穿過多層膜M的刺激光的光強(qiáng) 相同的情況下，通過會聚穿過光瞳面的刺激光，在焦點(diǎn)處完全抵消了電場強(qiáng)度。也就是說， 在焦平面處，能夠獲得面包圈形狀的會聚光束，其由于干涉而不具有任何光強(qiáng)(即，具有光 強(qiáng)的最小值)。例如，這意味著能夠獲得與日本專利No. 3993553中公開的環(huán)形相位板相等 的功能。另一方面，激勵(lì)光被具有多層膜M的區(qū)域反射，并且穿過除了多層薄M以外的區(qū) 域。在該情況下，例如能夠如在Opt. Lett.，19 (1994) 1804-1806 (Y. Iketaki等人)中公開 的那樣獲得具有光強(qiáng)的最大值的普通會聚光束。因此，通過向圖2中示出的偏光控制元件21輸入在相同的軸上具有相同光瞳直徑 的激勵(lì)光和刺激光、并且會聚穿過的光，能夠?qū)⒋碳す鈺鄢蔀橹辽僭诎ň酃恻c(diǎn)的相鄰 區(qū)域中在光軸方向上具有中空部分的中空圖案形狀(面包圈形狀)的光束，更具體地說，膠 囊形狀(三維黑洞形狀)或管形(通心粉形狀)。此外，可以將激勵(lì)光會聚在普通形狀的會 聚光束中。此外，由于將激勵(lì)光和刺激光會聚在同一空間點(diǎn)處，因此能夠略去對激勵(lì)光和刺 激光的光學(xué)調(diào)整，對激勵(lì)光和刺激光的光學(xué)調(diào)整是超分辨率顯微鏡的最大問題。
應(yīng)當(dāng)注意，為了將激勵(lì)光和刺激光輸入到偏光控制元件21中，優(yōu)選地這樣來配置 照明光學(xué)系統(tǒng)，即，從同一單模式光纖得到激勵(lì)光和刺激光，并且由不具有色像差的透鏡進(jìn) 行校直，并由此使得激勵(lì)光和刺激光被輸入。通過如上所述地配置照明光學(xué)系統(tǒng)，可以預(yù)期 以下效果。(1)由于激勵(lì)光和刺激光是從單模式光纖得到的，因而能夠使這些光具有完美的 球面波。因此，通過以不具有色像差的透鏡來對光進(jìn)行校直，可以得到不具有波像差的完美 的平面波，從而能夠更加可靠地進(jìn)行偏光控制元件21的相位調(diào)制。(2)由于激勵(lì)光和刺激光是從單模式光纖中得到且被不具有色像差的透鏡校直， 因而即使在以稍稍傾斜的方式設(shè)置偏光控制元件21時(shí)，也能夠利用無色像差的光學(xué)系統(tǒng) 來校直光，否則偏光控制元件21中的偏光部件22的平行安放程度下降。因此，能夠使圖像 形成在樣本上的同一空間點(diǎn)處并解決光束的偏移。(3)由于單模式光纖的發(fā)射端口被以機(jī)械方式固定，因此能夠建立在機(jī)械方面非 常穩(wěn)定的照明光學(xué)系統(tǒng)，其中，激勵(lì)光和刺激光的聚光點(diǎn)在空間上沒有變化。注意，相位調(diào)制部23并不限于其中多層膜M同心地形成在兩個(gè)區(qū)域中的中心部 分處的配置，并且能夠形成具有多層膜M的調(diào)制區(qū)域23a以具有更加環(huán)形的區(qū)域，即，如使 用相位型菲涅耳波帶片情況下那樣的兩個(gè)或更多個(gè)區(qū)域。另外，如上所述，當(dāng)穿過偏光控制元件21的多層膜M的刺激光和穿過多層膜M 以外的區(qū)域的刺激光具有在電場幅值方面完全相同但符號相反的幅值時(shí)，為了在焦平面處 獲得面包圈形狀的會聚光，不穿過多層膜M的刺激光和穿過多層膜M的刺激光具有相同 的光強(qiáng)是必要的條件。更具體地說，在入射到光瞳面的刺激光的強(qiáng)度均勻時(shí)，需要滿足以下 表達(dá)式，其中，Sa是多層膜M的面積，并且&是整個(gè)光瞳面的面積。
權(quán)利要求
1.一種用于觀察包含具有至少兩種或更多種量子態(tài)的物質(zhì)的樣本的超分辨率顯微鏡， 該超分辨率顯微鏡包括光源部，其輸出用于將所述物質(zhì)從穩(wěn)定態(tài)激勵(lì)為第一量子態(tài)的第一照明光、和用于進(jìn) 一步使所述物質(zhì)轉(zhuǎn)變到另一量子態(tài)的第二照明光；光學(xué)系統(tǒng)，其包括顯微鏡物鏡并以使分別從所述光源部輸出的所述第一照明光和所述 第二照明光彼此部分交疊的方式將這些光會聚到所述樣本上；檢測部，其檢測響應(yīng)于所述第一照明光和所述第二照明光的會聚而從所述樣本發(fā)射的 光學(xué)響應(yīng)信號；以及偏光控制元件，其設(shè)置有轉(zhuǎn)變所述第一照明光或所述第二照明光的偏光狀態(tài)的偏光部 件以及與所述偏光部件一體形成并對所述第二照明光的相位進(jìn)行空間調(diào)制的相位調(diào)制部。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超分辨率顯微鏡，其中，所述偏光控制元件被配置成使得所述第二照明光在所述樣本上的所述第二照明光與 所述第一照明光部分交疊的區(qū)域中具有最小值的光強(qiáng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的超分辨率顯微鏡，其中，所述偏光控制元件不對所述第一照明光的相位進(jìn)行空間調(diào)制，并且所述第一照明光在 所述樣本上的所述區(qū)域中的光軸上具有最大值的光強(qiáng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超分辨率顯微鏡，其中，所述相位調(diào)制部包括通過光學(xué)介質(zhì)膜的層疊或通過蝕刻處理而被形成為具有臺階的 多個(gè)區(qū)域，使得所述第二照明光的相位在關(guān)于光軸對稱的位置處反轉(zhuǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超分辨率顯微鏡，其中，所述偏光控制元件包括所述相位調(diào)制部和在軸向方向上觀察時(shí)同心地劃分的、圍繞所 述相位調(diào)制部的所述相位調(diào)制部以外的區(qū)域，并且其中，穿過所述相位調(diào)制部的所述第二 照明光和穿過所述相位調(diào)制部以外的所述區(qū)域的所述第二照明光在電場幅值方面具有相 反的符號。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超分辨率顯微鏡，其中，所述相位調(diào)制部由對所述第一照明光具有反射效果或透射型相位調(diào)制效果并對所述 第二照明光具有透射型相位調(diào)制效果的多層膜形成。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超分辨率顯微鏡，其中，所述物質(zhì)是熒光物質(zhì)，并且所述第二照明光具有抑制所述熒光物質(zhì)的熒光發(fā)射的波長。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超分辨率顯微鏡，其中，所述物質(zhì)是熒光物質(zhì)，并且所述第二照明光具有改變所述熒光物質(zhì)的熒光的光譜的波長，并且所述檢測部設(shè)置有波段選擇部，所述波段選擇部透射響應(yīng)于所述第一照明光的照射而 從所述熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光的光譜，并且阻斷響應(yīng)于所述第二照明光的照射而從所述熒光 物質(zhì)發(fā)射的熒光的光譜。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超分辨率顯微鏡，其中，所述偏光控制元件能夠繞所述第二照明光的光軸旋轉(zhuǎn)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超分辨率顯微鏡，其中，所述偏光部件針對所述第二照明光用作二分之一波長板，并且分別被會聚到所述樣本上的所述第一照明光和所述第二照明光的偏光方向平行。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超分辨率顯微鏡，其中，所述偏光部件針對所述第二照明光用作四分之一波長板，并且 分別被會聚到所述樣本上的所述第一照明光和所述第二照明光中的至少一方的偏光 方向是圓偏振光。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的超分辨率顯微鏡，其中，分別被會聚到所述樣本上的所述第一照明光和所述第二照明光是偏光旋轉(zhuǎn)方向彼此 相反的圓偏振光。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超分辨率顯微鏡，其中，所述偏光控制元件是使所述第一照明光或所述第二照明光偏轉(zhuǎn)的反射型。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超分辨率顯微鏡，其中，所述偏光控制元件包含液晶或光子晶體作為所述偏光部件。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超分辨率顯微鏡，其中，所述光學(xué)系統(tǒng)具有棒狀鏡頭，所述棒狀鏡頭具有與所述顯微鏡物鏡的物側(cè)連接的內(nèi)窺 鏡光學(xué)系統(tǒng)。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超分辨率顯微鏡，其中，所述顯微鏡物鏡被配置成能夠?qū)λ鰳颖具M(jìn)行所述第一照明光和所述第二照明光的 空間掃描。
全文摘要
本發(fā)明涉及超分辨率顯微鏡。提供了一種用于觀察包含具有至少兩種或更多種量子態(tài)的物質(zhì)的樣本的超分辨率顯微鏡，該超分辨率顯微鏡包括光源部，其輸出用于將物質(zhì)從穩(wěn)定態(tài)激勵(lì)為第一量子態(tài)的第一照明光、和用于進(jìn)一步使物質(zhì)轉(zhuǎn)變到另一量子態(tài)的第二照明光；光學(xué)系統(tǒng)，其包括顯微鏡物鏡并以使分別從光源部輸出的第一照明光和第二照明光彼此部分交疊的方式將這些光會聚到樣本上；檢測部，其檢測響應(yīng)于第一照明光和第二照明光的會聚而從樣本發(fā)射的光學(xué)響應(yīng)信號；以及偏光控制元件，其設(shè)置有轉(zhuǎn)變第一照明光或第二照明光的偏光狀態(tài)的偏光部件以及與偏光部件一體形成并對第二照明光的相位進(jìn)行空間調(diào)制的相位調(diào)制部。
文檔編號G02B21/00GK102096180SQ20101058074
公開日2011年6月15日 申請日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月11日
發(fā)明者池瀧慶記 申請人:奧林巴斯株式會社