專利名稱：具有瞬逝照明的電子光柵顯微鏡的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種電子光柵顯微鏡。
在電子光柵顯微鏡中，樣品利用光射線被照明，以便觀察從樣品發(fā)出的作為反射光或熒光的探測光。照明光射束的焦點借助于可控的射線偏轉裝置、一般是通過翻轉兩個反射鏡而在樣品平面上移動，其中偏轉軸大多是相互垂直的，使得一個反射鏡在x方向上偏轉，另一在y方向上偏轉。反射鏡的翻轉例如借助于電流計-調節(jié)元件來實現(xiàn)。來自于物體的探測光的功率根據(jù)掃描射線的位置被測量。通常，所述的調節(jié)元件裝有用于測定當前反射鏡位置的傳感器。特別在共焦的電子光柵顯微鏡中，物體利用光射線的焦點被三維地掃描。
共焦的電子光柵顯微鏡通常包括一個光源、一個聚焦鏡組、一個射線分配器、一個用于射線控制的射線偏轉裝置、一個顯微鏡鏡組、一個探測光闌、以及多個用于檢測探測光或熒光的探測器，其中所述聚焦鏡組被用來把光源的光聚焦到一個孔眼光闌(所謂的激勵光闌)上。照明光通過一個射線分配器被耦合輸入。來自于物體的熒光或反射光通過射線偏轉裝置返回到射線分配器，并經(jīng)過該射線分配器，以便隨后聚焦到后面設有探測器的探測光闌上。該探測裝置被稱為Descan(解掃描)裝置。非直接來源于焦點區(qū)的探測光采取另一條光路徑并且不經(jīng)過該探測光闌，這樣便獲得一種點信息，該點信息通過利用照明光射束的焦點順序地掃描物體而導致一個三維圖形。大多通過逐層的圖像數(shù)據(jù)處理來獲得三維圖像。
US 2002/0097489A1公開了一種瞬逝地照明樣品的顯微鏡。該顯微鏡包括一個白光源，其光線通過孔隙光闌穿越顯微鏡物鏡而被耦合輸入到支撐樣品的載物臺中以進行瞬逝照明。照明光在載物臺中通過全內反射被傳播，其中樣品的照明僅僅在從載物臺伸出來的瞬逝區(qū)的范圍內進行。這種顯微鏡以概念TIRFM(全內反射熒光顯微鏡)而公知。
TIRF顯微鏡的z分辨率因為只有約100nm被伸入到樣品中的瞬逝區(qū)而非常良好。
本發(fā)明的任務在于，提供一種電子光柵顯微鏡，用它既可以利用瞬逝照明的優(yōu)點也可以利用電子光柵顯微鏡的優(yōu)點。
該任務通過以下的電子光柵顯微鏡來解決，其具有瞬逝地照明被布置在載物臺上的樣品的光源，具有接收從所述樣品的像素發(fā)出的探測光的點探測器，以及具有被布置在所述探測光的光程中的用于移動樣品內的像素位置的射線偏轉裝置。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點既可以兩維地或三維地掃描樣品，也可以在z方向上實現(xiàn)明顯提高的分辨率。
借助于被布置在探測光的光程中的射線偏轉裝置來實現(xiàn)在橫向(xy方向)上掃描樣品。為了在軸向(z方向)掃描樣品，可以調整樣品和物鏡的相對間距。為此，可以把樣品布置在高度可調的臺子上，或者采用在z方向可調的物鏡。
所述照明光優(yōu)選地可以通過所述電子光柵顯微鏡的物鏡被耦合輸入到所述樣品的蓋玻片中。在另一變型方案中，所述照明光通過所述電子光柵顯微鏡的聚光器被耦合輸入到所述載物臺中。在一完全不同的變型方案中，所述的耦合輸入既不通過物鏡也不通過聚光器實現(xiàn)，而是直接地例如通過棱鏡被耦合輸入到載物臺中。
所述照明光優(yōu)選地經(jīng)過物鏡光瞳的外邊緣區(qū)，以確保在蓋玻中達到全反射的臨界角。優(yōu)選地，所述照明光被成形為照明光射束，所述照明光射束在所述物鏡光瞳的平面上具有一個焦點。該照明光射束可以在樣品的檢查期間保持位置固定。在一特別優(yōu)選的變型方案中，所述照明光射束可利用另一射線偏轉裝置而回轉地通過物鏡光瞳的外部區(qū)。由此以非常有利的方式實現(xiàn)非常均勻和等同的照明。
所述物鏡優(yōu)選地具有大于1.3、尤其優(yōu)選為1.35與1.42之間的數(shù)值孔徑。
在一優(yōu)選擴展形式中，在所述照明光的光程中，優(yōu)選在所述物鏡光瞳的平面內布置一色選弓形光闌。所述色選弓形光闌在外邊緣區(qū)具有不同于內部區(qū)的光特性。優(yōu)選地，所述色選弓形光闌在外邊緣區(qū)對所述照明光的波長是透明的，而其在內部區(qū)只對大于所述照明光的波長的光是透明的。這種擴展變型方案尤其對于以下熒光應用是非常優(yōu)選的探測光的波長根據(jù)特性位于照明光波長之上。
在另一變型方案中，所述色選弓形光闌在內部區(qū)只對小于所述照明光的波長的光是透明的。該變型方案尤其適用于樣品的多光子激發(fā)。在此，所述照明光優(yōu)選地是脈沖式的紅外光。
借助于色選弓形光闌避免了位于外邊緣區(qū)之外的照明光通過物鏡到達樣品并直接照射該樣品。
在一種非常特別優(yōu)選的擴展變型方案中，所述照明光具有多個波長。在該變型方案中，例如多個不同的樣品色料可以同時被激發(fā)。
所述點探測器優(yōu)選地在對應于物鏡焦平面的平面上包括一探測孔眼光闌。通過該孔眼光闌的位置和通過所述射線偏轉裝置的位置，確定了點探測器能從其接收探測光的像素的空間位置。
在一優(yōu)選變型方案中，所述點探測器包括一多波段探測器和一分光計。由此能夠從樣品中獲得光譜點信息。尤其在結合多色照明的情況下，該實施方案變型是非常有利的。
本發(fā)明的電子光柵顯微鏡另外還可以被構造為共焦的電子光柵顯微鏡，其中既可以通過色選弓形光闌的內部區(qū)對樣品進行共焦檢查，同時又可以通過色選弓形光闌的外部區(qū)進行TIRF照明。
為了在物鏡光瞳的平面上產(chǎn)生照明光射束的焦點，照明光的光程中布置了一成像鏡組、優(yōu)選地是Bertrandt透鏡。
在一種非常特別優(yōu)選的擴展方案中，所述探測光的光路包括多個探測通道，其中在每個探測通道中可以設立一個帶通濾光器。
在附圖中示意地示出了本發(fā)明的主題，下面借助于該圖來講述它，其中作用相同的元件設有相同的附圖標記。在此

圖1示出了本發(fā)明的一種子光柵顯微鏡，圖2示出了色選的弓形光闌，圖3示出了本發(fā)明的另一電子光柵顯微鏡，以及圖4示出了本發(fā)明的又一電子光柵顯微鏡。
圖1示出了本發(fā)明的一種電子光柵顯微鏡，其具有被構造為氬離子激光器3的光源1。光源1產(chǎn)生一個照明光射束5，該照明光射束由射線分配器7反射到物鏡9。照明光射束5經(jīng)過物鏡光瞳11的外邊緣區(qū)(通過雙箭頭24表示)，并被耦合輸入到樣品15的蓋玻片13中以用于瞬逝照明。在照明光射束5的光程中有一個被構造為Bertrandt透鏡17的成像鏡組19，該成像鏡組在物鏡光瞳11的平面上產(chǎn)生一個焦點。此外，在照明光射束5的光程中還有另一射線偏轉裝置21，其包含一個沒有被示出的萬向懸掛掃描鏡。借助于該另一射線偏轉裝置，照明光射束的焦點連續(xù)回轉地移動通過物鏡光瞳11的外邊緣區(qū)，由此實現(xiàn)一個特別均勻的瞬逝照明。在物鏡光瞳11的平面內，布置了如圖2所示的色選弓形光闌23。該色選弓形光闌23具有一個對照明光透明的外邊緣區(qū)25。另外，該色選弓形光闌23還具有一個內部區(qū)27，其對大于照明光波長的光是透明的。從樣品出來的探測光51穿過物鏡和該色選弓形光闌的內部區(qū)到達射線分配器7，穿過該射線分配器，并經(jīng)含有萬向懸掛掃描鏡31的射線偏轉裝置29到達點探測器33。所述點探測器33包括一個探測孔眼光闌35，其空間位置與所述萬向懸掛掃描鏡31的位置尤其確定了在樣品中的像素(Rasterpunkt)的位置，其中點探測器33從該像素接收探測光51。點探測器33包括一個多波段探測器36，它可以同時地接收多個可調的波長帶內的探測光51。氬離子激光器3的照明光射束包含有多個波長的照明光，由此可以實現(xiàn)樣品的多色激發(fā)。
圖3示出了本發(fā)明的另一種電子光柵顯微鏡，其中在樣品的TIRF檢查的同時可以實現(xiàn)樣品的共焦檢查。該電子光柵顯微鏡包括另一光源37，該光源被構造為脈沖式的鈦-藍寶石激光器(Titan-Saphirlaser)39，并且發(fā)出另一照明光射束41。該另一照明光射束41通過第二射線分配器43和途經(jīng)射線偏轉裝置29、以及通過射線分配器7和第三射線分配器45到達物鏡9，并通過弓形光闌23的內部區(qū)27直接照穿樣品15。在樣品15內，與利用照明光射束5的TIRF照明無關地通過所述另一照明光射束41引起樣品的雙光子激發(fā)。通過樣品的雙光子激發(fā)所產(chǎn)生的另一探測光53借助于一個被構造為CCD元件49的非-解掃描-探測器47被檢測。該另一探測光53經(jīng)過物鏡的內部區(qū)、通過第三射線分配器45上的反射到達所述的非-解掃描-探測器47。在該電子光柵顯微鏡中，在物鏡光瞳內裝有另一色選弓形光闌，其在外邊緣區(qū)對光源1的照明光射束5是透明的，并且在內部區(qū)被構造成對該光進行反射。由此確保了沒有照明光被直接入射到樣品上。射線分配器7、45和43被構造使得照明光射束5和鈦-藍寶石激光器39兩者的光不會都到達點探測器33或非-解掃描-探測器47。
在圖4中示出了本發(fā)明的電子光柵顯微鏡的又一種可以想見的變型方案。在該情形下，光源1由一個發(fā)出照明光射束5的鈦-藍寶石激光器55構成，所述照明光射束5作為TIRF照明被引到通過色選弓形光闌23的外邊緣區(qū)25。瞬逝照明在樣品15內引起多光子激發(fā)。由此產(chǎn)生的熒光通過整個弓形光闌23經(jīng)第三射線分配器45到達被構造為CCD元件49的非-解掃描-探測器47。緊接著通過用光源37進行共焦照明和用點探測器33進行探測來拍攝樣品的一幅三維圖像，其中所述光源37由氬離子激光器57組成，所述點探測器33被構造為多波段探測器36。
參照特殊實施方案講述了本發(fā)明。但顯然可以進行變化或變換，而不會脫離以下權利要求書的保護范圍。
附圖標記清單1 光源3 氬離子激光器5 照明光射束7 射線分配器9 物鏡11 物鏡光瞳13 蓋玻片15 樣品17 Bertrandt透鏡19 成像鏡組21 射線偏轉裝置23 弓形光闌24 雙箭頭25 外邊緣區(qū)27 內部區(qū)29 射線偏轉裝置31 掃描鏡33 點探測器35 探測孔眼光闌36 多波段探測器37 光源39 鈦-藍寶石激光器41 照明光射束43 第二射線分配器45 第三射線分配器47 非-解掃描-探測器49 CCD元件51 探測光53 探測光55 鈦-藍寶石激光器57 氬離子激光器
權利要求
1.電子光柵顯微鏡，具有瞬逝地照明被布置在載物臺上的樣品的光源，具有接收從所述樣品的像素發(fā)出的探測光的點探測器，以及具有被布置在所述探測光的光程中的用于移動樣品內的像素位置的射線偏轉裝置。
2.如權利要求1所述的電子光柵顯微鏡，其特征在于，所述照明光可以被耦合輸入到所述載物臺中或所述樣品的蓋玻片中。
3.如權利要求2所述的電子光柵顯微鏡，其特征在于，所述電子光柵顯微鏡具有一聚光器，所述照明光通過該聚光器可被耦合輸入到所述載物臺中。
4.如權利要求2所述的電子光柵顯微鏡，其特征在于，所述電子光柵顯微鏡具有一物鏡，所述照明光通過該物鏡可被耦合輸入到所述蓋玻片中。
5.如權利要求4所述的電子光柵顯微鏡，其特征在于，所述物鏡具有一物鏡光瞳，所述照明光經(jīng)過該物鏡光瞳的外邊緣區(qū)。
6.如權利要求5所述的電子光柵顯微鏡，其特征在于，所述照明光以照明光射束經(jīng)過。
7.如權利要求5所述的電子光柵顯微鏡，其特征在于，所述照明光射束在所述物鏡光瞳的平面上具有一個焦點。
8.如權利要求6或7之一所述的電子光柵顯微鏡，其特征在于，在所述照明光的光程中設有另一射線偏轉裝置，利用該另一射線偏轉裝置可改變所述照明光射束的空間位置。
9.如權利要求8所述的電子光柵顯微鏡，其特征在于，所述另一射線偏轉裝置回轉地通過所述物鏡光瞳的所述外邊緣區(qū)偏轉所述照明光射束。
10.如權利要求4-9之一所述的電子光柵顯微鏡，其特征在于，所述物鏡具有大于1.3、優(yōu)選為1.35與1.42之間的數(shù)值孔徑。
11.如權利要求1-10之一所述的電子光柵顯微鏡，其特征在于，在所述照明光的光程中，優(yōu)選在所述物鏡光瞳的平面內布置一色選弓形光闌。
12.如權利要求11所述的電子光柵顯微鏡，其特征在于，所述色選弓形光闌在外邊緣區(qū)對所述照明光的波長是透明的。
13.如權利要求12所述的電子光柵顯微鏡，其特征在于，所述色選弓形光闌在內部區(qū)只對大于所述照明光的波長的光是透明的。
14.如權利要求12所述的電子光柵顯微鏡，其特征在于，所述色選弓形光闌在內部區(qū)只對小于所述照明光的波長的光是透明的。
15.如權利要求14所述的電子光柵顯微鏡，其特征在于，所述照明光優(yōu)選地是脈沖式的紅外光。
16.如權利要求1-15之一所述的電子光柵顯微鏡，其特征在于，所述照明光具有多個波長。
17.如權利要求1-16之一所述的電子光柵顯微鏡，其特征在于，所述點探測器包括一多波段探測器和一分光計。
18.如權利要求1-16之一所述的電子光柵顯微鏡，其特征在于，所述點探測器包括一探測孔眼光闌。
19.如權利要求1-18之一所述的電子光柵顯微鏡，其特征在于，所述電子光柵顯微鏡被構造為共焦的電子光柵顯微鏡。
全文摘要
一種電子光柵顯微鏡，具有瞬逝地照明被布置在載物臺(13)上的樣品(15)的光源(1)。點探測器(35，36)接收從所述樣品(15)的像素發(fā)出的探測光(51)，其中在所述探測光的光程中布置一射線偏轉裝置(29)，利用它可以移動樣品內的像素位置。
文檔編號G02B21/06GK1856725SQ200480027804
公開日2006年11月1日 申請日期2004年9月23日 優(yōu)先權日2003年9月25日
發(fā)明者H·烏爾里希, W·克內貝爾, K·莫爾曼 申請人:萊卡微系統(tǒng)Cms有限責任公司