煤矸石中耐重金屬青霉菌的分離鑒定及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從礦區(qū)煤矸石中篩選出的耐重金屬鎘的青霉菌BJKD4(Penicillium?sp.)，該菌保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號CGMCC?NO.6620。本發(fā)明青霉菌BJKD4菌株對鎘鹽及多種重金屬復(fù)合污染有強耐性，在煤矸石山的復(fù)墾和土壤重金屬污染的生態(tài)修復(fù)中起著重要作用。
【專利說明】煤矸石中耐重金屬青霉菌的分離鑒定及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及治理重金屬污染的生物修復(fù)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種耐重金屬鎘青霉菌的分離及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】:
[0002]高硫煤矸石經(jīng)風(fēng)化淋溶作用可產(chǎn)生強酸性的淋溶液，導(dǎo)致其中的重金屬被淋溶出來，這些含重金屬的酸性廢水沿矸石堆徑流，向周邊土壤和水體遷移，導(dǎo)致矸石山及周邊土壤和水體受到嚴重酸化和重金屬污染，如鎘、銅、鉛、鋅等。有些金屬是有機體生命活動不可缺少的元素，但過量的重金屬都存在潛在的毒性效應(yīng)，Berny P等報道了重金屬對人類、動物、植物和微生物造成的一系列嚴重危害。廣泛用于重金屬污染修復(fù)的物理或化學(xué)等方法，存在許多缺點，費用昂貴，處理過程中向土壤中加入的試劑等又給周邊環(huán)境造成二次污染，另外Wang and chen等研究表明當(dāng)重金屬污染物含量低于100mg/L時,這些方法都不能有效降低重金屬毒性。而生物修復(fù)被認為是一種清潔、無污染且效率高的方法，越來越受到廣大學(xué)者關(guān)注，其中微生物修復(fù)是主要的修復(fù)技術(shù)。
[0003]用于修復(fù)重金屬污染的微生物主要是土著真菌和細菌，不同微生物種類對重金屬污染的耐性也不同，通常為真菌 > 細菌 > 放線菌，又由于真菌在自然界中分布很廣，對環(huán)境適應(yīng)能力強，且許多具有重金屬抗性和富集能力，在生物處理技術(shù)中得到廣泛關(guān)注。污染土壤中的微生物往往具有較高的重金屬抗性，從污染區(qū)分離篩選的土著微生物適應(yīng)了當(dāng)?shù)氐淖匀画h(huán)境，所以能有效修復(fù)重金屬污染。杜愛雪等從銅礦尾礦土壤中分離出一株高抗Cu2+、Zn2+和Cd2+等的青霉菌。在銅礦冶煉廢水中篩選出高抗銅的惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida strain S4) 能在提供營養(yǎng)液條件下有效去除水體中的Cu2+和Zn2+。白腐真菌對鉛有較強的去除作用，其最大吸附量可達108.4mg/g，吸附率可達95%。從鎘污染土壤中篩選出2株酵母菌，對Cd2+吸附率可分別達到79.85%和89.04%。盡管多種耐重金屬真菌已被分離，但由于高硫煤矸石經(jīng)風(fēng)化淋溶作用產(chǎn)生含較高濃度重金屬的強酸性廢水，致使多數(shù)微生物無法繁衍，另外，用于治理煤矸石污染的微生物和修復(fù)菌劑未見報道。因此，在酸性矸石山中篩選耐重金屬真菌，研究其重金屬的耐性和富集機理，對煤矸石山重金屬污染的修復(fù)具有十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004]本發(fā)明的目的是提供一種能夠耐受重金屬鎘的菌種——青霉菌BJKD4 (Penicillium sp.)。
[0005]本發(fā)明所提供的菌株為青霉菌BJKD4菌株，該菌株于2012年09月25日保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院，中國科學(xué)院微生物研究所，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號CGMCC N0.6620。
[0006]本發(fā)明所述耐重金屬鎘的青霉菌具有以下有益效果:耐受重金屬鎘的能力強，可以耐受3.2g/L鎘離子濃度，且對多種重金屬鹽具有較強的耐性，在對生物修復(fù)由酸性煤矸石淋溶引起的重金屬污染中起著重要作用。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0007]圖1:BJKD4菌株在固體查氏培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)
[0008]圖2:顯微鏡下BJKD4菌株的分生孢子梗
[0009]圖3:BJKD4菌株的系統(tǒng)進化發(fā)育分析樹
[0010]圖4:不同濃度CdCl2脅迫對BJKD4菌株生長的影響
[0011]圖5:不同重金屬對BJKD4菌株生長的影響
[0012]圖6:不同濃度煤矸石浸出液對BJKD4生長的影響
【具體實施方式】
[0013]以下通過具體實施例來詳細說明本發(fā)明
[0014]實施例1:本發(fā)明青霉菌的分離。
[0015]從淮南謝家集煤礦區(qū)隨機取12個樣點混合組成代表樣，進行富集篩選。將5g矸石樣加入到45mL馬丁氏液體培養(yǎng)基中，28°C、180r/min富集培養(yǎng)48h，然后，取2mL富集菌液接種于含100mg/L Cd2+的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，渾濁后取ImL富集培養(yǎng)液接種于含200mg/L Cd2+的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，依此類推，逐級提高Cd2+濃度，在300-5000mg/L Cd2+的培養(yǎng)基中進行馴化培養(yǎng)。取0.2mL1000mg/L Cd2+的菌液涂布在5000mg/L Cd2+的固體培養(yǎng)基上，倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120h，分離耐Cd菌株。根據(jù)菌落形態(tài)初步觀察BJKD4單克隆菌株為霉菌，將其接種到500~3500mg/L Cd2+查氏培養(yǎng)基中馴化培養(yǎng)，進行菌種鑒定和耐重金屬特性研究。
[0016]馬丁氏培養(yǎng)基:葡萄糖IOg,磷酸二氫鉀Ig,蛋白胨5g,硫酸鎂0.5g, 1/3000孟加拉紅IOOmL,加蒸餾水800mL，pH自然。121°C滅菌30min，臨用前加入0.03%鏈霉素稀釋液IOOmL,使每毫升培養(yǎng)基中含鏈霉素30 μ g。固體培養(yǎng)基是在此培養(yǎng)基中加入15~20g瓊脂。
[0017]查氏培養(yǎng)基:硝酸鈉2g，磷酸氫二鉀lg，氯化鉀0.5g，硫酸鎂0.5g，硫酸亞鐵0.018，蔗糖308，瓊脂18-208，去離子水10001^，？!1自然。重金屬篩選培養(yǎng)基是在此培養(yǎng)基中加入不同濃度的重金屬鹽。
[0018]菌落形態(tài)特征:BJKD4菌株在固體查氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)14d后(圖1)，菌落為氈狀，表面有滲出液，有規(guī)則的放射狀褶裂，中心有臍狀突起并有幾道同心紋，顯微鏡觀察到菌絲有隔膜(圖2)，從氣生菌絲生出單生的分生孢子梗，分生孢子梗有橫隔膜，頂端生排列成帚狀的間枝，分支I次或多次，分生孢子串成不分支的鏈狀，分生孢子呈球形。
[0019]實施例2:本發(fā)明青霉菌BJKD4菌株的18S rDNA序列測定
[0020] 菌株的18S rDNA序列分析:采用CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)法提取基因組。使用擴增引物:SSU817TTA GCA TGG AAT AAT RRAATA GGA 和 SSU1536AAT GCAATG CYC TATCCC CA進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增DNA。50 μ L反應(yīng)體系含有:10*PCR緩沖液5 μ L、IOmmoI/L Dntp0.25L、45pmol/ μ L 引物 0.5 μ L、2.5U/ μ L Taq 酶 0.5 μ L、DNA 模板 I μ L 和滅菌的去離子水42.25 μ L0 PCR反應(yīng)條件:94°C變性lmin，50°C退火30s、72°C延伸90s、40個循環(huán)，72°C最終延伸5min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物2 μ L于I %的瓊脂凝膠電泳。DNA序列由北京華大基因公司測定，用BLAST (http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST)程序進行DNA序列比對。
[0021]BLAST比對分析表明:BJKD4的18S rDNA序列(基因序列注冊號:HM439093)與青霉屬(Penicilliumsp.)、正青霉屬(Eupenicillium sp.)和子囊菌綱(Ascomycetesp.)的同源性均為99%，用MEGA5.0軟件構(gòu)建18S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)合形態(tài)觀察和分子分析，我們認為BJKD4屬于青霉屬(Penicilliumsp.)。
[0022]實施例3:本發(fā)明所述青霉菌耐重金屬的能力測定
[0023]1、BJKD4菌株對重金屬鎘的耐性:將活化2天的菌株接種到含0、1、3、9、18或36mmol/LCd2+的固體查氏培養(yǎng)基中，28°C下培養(yǎng)16d，第3d時開始測量菌落直徑。[0024]測試結(jié)果表明:BJKD4菌株在含0-36mmol/L Cd2+的查氏固體培養(yǎng)基中生長16d，其菌落直徑隨著培養(yǎng)天數(shù)的延長而增加，隨著Cd2+濃度的增加而降低(圖4)。在無Cd2+培養(yǎng)基(對照)中，菌落生長的延滯期為0-4d，對數(shù)生長期為4-15d，16d時進入穩(wěn)定期；而添加重金屬Cd2+(l-36mm0l/L)后，延滯期延長到第6d，然后進入對數(shù)期，14_15d時達到穩(wěn)定期。與對照相比，BJKD4菌株在l-36mmol/L Cd2+平板上生長5_16d時，其菌落直徑顯著低于對照，而不同濃度Cd2+處理對菌落直徑大小無明顯影響，說明BJKD4為耐鎘菌。
[0025]2、BJKD4菌株對不同重金屬的耐性:菌株在液體查氏培養(yǎng)基中活化2d，取2 μ L菌液接種到含有單一不同濃度重金屬 Cd2+(0、1、3、9、18 和 36mmol/L)、Cu2+(0,0.05,0.1、0.2、
0.3 和 0.4mmol/L) ,Ni2+ (0,0.9、1.8、2.7、3.6 和 4.5mmol/L)、Pb2+(0、1、2、4、6 和 8mmol/L)、Zn2+(0、14、28、42、56 和 70mmol/L)、或 Mn2+(0、20、40、60、80 和 IOOmmoI/L)的固體查氏培養(yǎng)基中，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中，28°C培養(yǎng)8d時測量菌落直徑。
[0026]測試結(jié)果表明:不同重金屬對BJKD4菌株生長的抑制效果不同(圖5)，其菌落直徑隨著重金屬濃度的升高逐漸減小。BJKD4菌落直徑在含有0.05mmol/L Cu2+培養(yǎng)基中迅速下降，0.2mmol/L Cu2+時菌株不能生長；Cd2+濃度為lmmol/L時,菌落直徑顯著降低,之后隨著 Cd 濃度(l-36mmol/L)的增加緩慢減小；隨著 Ni2+(0_4.5mmol/L)、Pb2+(0-8mmol/L)和Zn2+(0-70mmol/L)濃度的升高，菌落直徑直線下降，且重金屬濃度相同時，Pb2+和Zn2+脅迫時菌斑直徑大于Ni2+脅迫時的直徑；在小于20mmol/LMn2+(低濃度)時可以促進BJKD4菌株生長，而在大于20mmol/L Mn2+(高濃度)時其直徑隨Mn2+濃度升高而迅速減小。在y軸最大生長速率的50%處作水平線，其與生長率曲線相交點處所對應(yīng)X軸上的濃度則為EC50。比較EC50得知不同重金屬對BJKD4的毒性大小依次為:Cu2+ > Ni2+ > Cd2+ > Pb2+或Zn2+ >Mn2+。
[0027]3、BJKD4菌株對復(fù)合重金屬污染的耐性:根據(jù)單一重金屬(Cd2+、Ni2+、Zn2+、Mn2+)對菌株生長的影響，設(shè)計L25 (54)正交試驗，配制不同重金屬復(fù)合污染的固體培養(yǎng)基，接種2yL菌液，28°C培養(yǎng)8d，測定菌落直徑。實驗重復(fù)三次，用SPSS軟件分析。
[0028]測試結(jié)果表明:BJKD4菌株在重金屬復(fù)合污染培養(yǎng)基生長8d的菌落直徑見表1。BJKD4菌落直徑在4種重金屬復(fù)合污染條件下均增加；從直觀分析表中極差(R)的大小(表I)看出不同重金屬對BJKD4生長影響的大小依次為:Mn2+ > Cd2+ > Zn2+ > Ni2+。從K值分析可知Cd2+和Mn2+抑制菌株生長，而Zn2+表現(xiàn)為低濃度促進作用，Ni2+在5水平下的K值相近。方差分析(表2)表明:Cd2+、Zn2+和Mn2+顯著影響B(tài)JKD4的生長，Ni2+沒有顯著作用。此外，濃度為 2.2Smmol/T, Cd2+, 1 Smmol/I, Zn2+,0-2.4mmo1 /T-Ni2+ 和 80mmol/L Mn2+等復(fù)合重金屬對BJKD4生長的抑制作用小于其他組合，表明BJKD4菌株可耐多種重金屬復(fù)合污染。
[0029]表1正交試驗BJKD4的直徑及直觀分析
[0030]
【權(quán)利要求】
1.一株耐重金屬鎘的青霉菌,其特征在于,該菌株屬于青霉菌屬Penicillium sp.,命名為BJKD4 ;該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號 CGMCC N0.6620。
2.如權(quán)利要求書I所述的耐重金屬鎘的青霉菌BJKD4，其形態(tài)和生理生化特征: a、BJKD4菌落為氈狀，表面有滲出液，有規(guī)則的放射狀褶裂，中心有臍狀突起并有幾道同心紋，在液體培養(yǎng)基中有菌絲也有菌絲球，培養(yǎng)液較透明。 b、菌絲有隔膜，從氣生菌絲生出誕生的分生孢子梗，分生孢子梗有橫隔膜，頂端生排列成帚狀的間枝，分支I次或多次，分生孢子串成不分支的鏈狀，分生孢子呈球形。
3.如權(quán)利要求書I所述的耐重金屬鎘的青霉菌BJKD4，其特征在于，所述菌株的18SrDNA序列如SEQID N0.1所示。
4.如權(quán)利要求書1-3所述的耐重金屬鎘的青霉菌BJKD4，能用于煤矸石山復(fù)墾和土壤重金屬污染的生態(tài) 修復(fù)。
【文檔編號】A62D101/43GK103923839SQ201310015361
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2013年1月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月16日
【發(fā)明者】張玉秀, 柴團耀, 李霞 申請人:中國礦業(yè)大學(xué)(北京)