本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種含有磷酸根的棉花修飾材料以及該材料被固載上金屬離子后作為固相萃取吸附劑的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

纖維素是由β-D-葡萄糖單元組成的線性聚合物，含有大量的羥基基團(tuán)（每個(gè)葡萄糖單元含有三個(gè)羥基）。作為最豐富的天然聚合物材料，纖維素環(huán)境友好、廉價(jià)、生物相容性好而且孔隙度高。纖維素在很多領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用，例如作為催化劑材料、過濾膜材料和吸附劑材料。作為一種纖維素材料，棉花擁有纖維素以上的優(yōu)點(diǎn)，近年來得到極大的關(guān)注。

在我們之前的工作中，多種棉花相關(guān)的功能化材料被開發(fā)，并用于復(fù)雜生物樣品中目標(biāo)分析物的選擇性富集，均表現(xiàn)出很好的效果。然而，之前的修飾方法普遍存在功能團(tuán)的修飾量較低的問題，這對(duì)吸附劑的吸附容量會(huì)有一定的影響。

接枝共聚（Grafting copolymerization），是一種通用的賦予聚合物材料功能性的方法，同時(shí)也被廣泛用于制備纖維素接枝共聚物。纖維素接枝共聚修飾主要基于三種方式：(a)嫁接支鏈（grafting onto）;(b)長(zhǎng)出支鏈（grafting from）;(c)大單體共聚接枝(grafting through)。其中，“長(zhǎng)出支鏈”是最普遍采用的方法，歸功于它的高接枝密度和可控性?！伴L(zhǎng)出支鏈”是指在纖維素骨架上長(zhǎng)聚合物刷子，可以有很多方式，包括自由基聚合、開環(huán)聚合和可控/活性自由基聚合。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有制備技術(shù)的不足，利用纖維素接枝共聚修飾中“長(zhǎng)出支鏈”方式的普遍實(shí)用性和高接枝密度，開發(fā)一種新型的含有磷酸根的棉花修飾材料，CF-NH₂-AZO-p(VPA-x)，隨后，該材料被固載上金屬離子，CF-NH₂-AZO-p(VPA-x)-Mⁿ⁺被作為固定金屬親和色譜的材料用于多種生物樣品中磷酸化多肽的選擇性富集。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種含有磷酸根的棉花修飾材料，其結(jié)構(gòu)特征如下式I，

CF-NH₂-AZO-p(VPA-x)（I），式中CF為棉花纖維（Cotton fiber,CF），AZO為自由基引發(fā)劑，VPA為乙烯基膦酸，x=0,0.5,1,2，3,4。

優(yōu)選的，式I中的x=2。

一種制備上述含有磷酸根的棉花修飾材料的方法，包括如下步驟：

（1）制備氨基修飾的棉花CF-NH_2：稱取0.5g乙二胺四乙酸二酐（EDTAD）于500mL圓底燒瓶中，加入300mL無水N’N-二甲基酰胺（DMF），再加入1.0g脫脂棉。充分混合之后，磁力攪拌條件下130℃反應(yīng)6h。反應(yīng)完成后，冷卻一段時(shí)間，將反應(yīng)液倒掉，重新加入300mL DMF，再加入0.5mL乙二胺，磁力攪拌條件下70℃反應(yīng)4h。產(chǎn)物依次用二次水和丙酮清洗，60℃真空干燥4h。

（2）制備CF-NH₂-AZO：稱取0.4g CF-NH₂于50mL離心管中，加入40mL無水二氯甲烷，再加入0.2g 4,4’-偶氮二（4-氰戊酰氯）（ACVC）和0.1mL三乙胺，25℃反應(yīng)5h。產(chǎn)物依次用二氯甲烷、乙醇、二次水和丙酮清洗，室溫干燥過夜。

（3）制備CF-NH₂-AZO-p(VPA-x)：稱取0.25g CF-NH₂-AZO于50mL反應(yīng)釜中，加入25mL甲醇和0.5g乙烯基膦酸(VPA)。密封，65℃反應(yīng)20h。產(chǎn)物依次用甲醇、水和丙酮清洗，60℃真空干燥，得到的產(chǎn)物作為CF-NH₂-AZO-p(VPA-2)(x=2)。此外，其它五種CF-NH₂-AZO-p(VPA-x)(x=0,0.5,1,3,4)的制備方法與CF-NH₂-AZO-p(VPA-2)類似，只是改變乙烯基膦酸的投料量（x=0,VPA=0;x=0.5,VPA=0.125g;x=1,VPA=0.25g;x=3,VPA=0.75g;x=4,VPA=1g）。

優(yōu)選的，上述制備方法的步驟（3）中，x=2。

一種以棉花纖維為基底的固相萃取吸附劑，其結(jié)構(gòu)特征如下式II，

CF-NH₂-AZO-p(VPA-x)-Mⁿ⁺（II），式中CF為棉花纖維（Cotton fiber,CF），AZO為自由基引發(fā)劑，VPA為乙烯基膦酸，x=0,0.5,1,2，3,4，Mⁿ⁺為金屬離子。

優(yōu)選的，式II中的x=2。

優(yōu)選的，Mⁿ⁺為Ti⁴⁺，Zr⁴⁺,Fe³⁺中的任意一種。

一種制備以棉花纖維為基底的固相萃取吸附劑的方法：

分別配制含有不同金屬離子的水溶液（0.1M）各20mL，往這種溶液里加入0.2g CF-NH₂-AZO-p(VPA-x)，室溫震蕩5h。產(chǎn)物依次用乙醇、水和丙酮清洗，60℃真空干燥，得到CF-NH₂-AZO-p(VPA-x)-Mⁿ⁺。

優(yōu)選的，上述制備方法的CF-NH₂-AZO-p(VPA-x)中，x=2。

進(jìn)一步地，上述制備方法中含金屬離子的鹽為硫酸鈦、氧氯化鋯、氯化鐵中的任意一種。

本發(fā)明還公開了上述方法制備的以棉花纖維為基底的固相萃取吸附劑在選擇性富集生物樣品中磷酸化肽的用途。

本發(fā)明以天然的棉花纖維為基底，采用纖維素接枝共聚修飾中“長(zhǎng)出支鏈”方式在氨基化棉花表面修飾磷酸根基團(tuán)，繼而在磷酸根基團(tuán)上修飾金屬離子,這一系列的修飾不會(huì)破壞棉花纖維的機(jī)械性能，仍保持棉花本身特有的滲透性和生物相容性，其表面的磷酸根修飾量較大，通過改變單體乙烯基膦酸的投料量，可以控制磷酸根的修飾量。因此，該修飾對(duì)棉花進(jìn)行功能化，增加了棉花纖維的實(shí)用性。取3-5mg上述制備的纖維材料裝入注射器針頭上，再套上針管，即得到簡(jiǎn)易的注射器固相萃取裝置。萃取過程中，采用手動(dòng)推拉的方式進(jìn)行反復(fù)萃取，由于纖維材料的滲透性極好，該萃取方式背壓小、阻力小。該方法操作簡(jiǎn)單、溶劑消耗少、快速，完成一次萃取流程僅需3分鐘。

附圖說明

圖1為CF-NH₂-AZO-p(VPA-x)制備的流程圖。

圖2為β-酪蛋白酶解液的質(zhì)譜圖：

(a)直接分析；(b)經(jīng)過CF-NH₂-AZO-p(VPA-2)-Ti⁴⁺萃取后；(c)經(jīng)過CF-NH₂-AZO-p(VPA-2)-Zr⁴⁺萃取后；(d)經(jīng)過CF-NH₂-AZO-p(VPA-2)-Fe³⁺萃取后；磷酸化多肽被標(biāo)記成‘αn’和‘βn’。

圖3為β-酪蛋白和牛血清蛋白（BSA）酶解混合液(1:100)經(jīng)過CF-NH₂-AZO-p(VPA-x)-Ti⁴⁺處理之后的質(zhì)譜圖:

x表示VPA與CF-NH₂-AZO的質(zhì)量比：(a)0,(b)0.5,(c)1.0,(d)2.0,(e)3.0和(f)4.0；磷酸化多肽被標(biāo)記成‘αn’和‘βn’。

圖4為β-酪蛋白和BSA酶解混合液（1:1000）的質(zhì)譜圖：

(a)直接分析；(b)經(jīng)過CF-NH₂-AZO-p(VPA-2)-Ti⁴⁺萃取后；磷酸化多肽被標(biāo)記成‘αn’和‘βn’。

圖5脫脂牛奶酶解液的質(zhì)譜圖：

(a)直接分析；(b)經(jīng)過CF-NH₂-AZO-p(VPA-2)-Ti⁴⁺萃取后；血清的質(zhì)譜圖：(c)直接分析；(d)經(jīng)過CF-NH₂-AZO-p(VPA-2)-Ti⁴⁺萃取后。

圖6鼠腦裂解液中磷酸化多肽的分析情況。

具體實(shí)施方式

通過以下詳細(xì)說明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所提供的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。

【實(shí)施例1】CF-NH₂-AZO-p(VPA-x)的制備

首先制備氨基修飾的棉花，得到CF-NH₂；再將自由基引發(fā)劑接到CF-NH₂上，得到CF-NH₂-AZO；然后采用表面引發(fā)聚合法在CF-NH₂-AZO表面修飾磷酸根，得到CF-NH₂-AZO-p(VPA-x)，如附圖1所示。

其中CF-NH₂的制備方法如下：稱取0.5g乙二胺四乙酸二酐（EDTAD）于500mL圓底燒瓶中，加入300mL無水N’N-二甲基酰胺（DMF），再加入1.0g脫脂棉。充分混合之后，磁力攪拌條件下130℃反應(yīng)6h。反應(yīng)完成后，冷卻一段時(shí)間，將反應(yīng)液倒掉，重新加入300mL DMF，再加入0.5mL乙二胺，磁力攪拌條件下70℃反應(yīng)4h。產(chǎn)物依次用二次水和丙酮清洗，60℃真空干燥4h。

CF-NH₂-AZO的制備方法如下：稱取0.4g CF-NH₂于50mL離心管中，加入40mL無水二氯甲烷，再加入0.2g 4,4’-偶氮二（4-氰戊酰氯）（ACVC）和0.1mL三乙胺，25℃反應(yīng)5h。產(chǎn)物依次用二氯甲烷、乙醇、二次水和丙酮清洗，室溫干燥過夜。

CF-NH₂-AZO-p(VPA-x)的制備方法如下：稱取0.25g CF-NH₂-AZO于50mL反應(yīng)釜中，加入25mL甲醇和0.5g乙烯基膦酸(VPA)。密封，65℃反應(yīng)20h。產(chǎn)物依次用甲醇、水和丙酮清洗，60℃真空干燥，得到的產(chǎn)物作為CF-NH₂-AZO-p(VPA-2)(x=2)。此外，其它五種CF-NH₂-AZO-p(VPA-x)(x=0,0.5,1,3,4)的制備方法與CF-NH₂-AZO-p(VPA-2)類似，只是改變乙烯基膦酸的投料量（x=0,VPA=0;x=0.5,VPA=0.125g;x=1,VPA=0.25g;x=3,VPA=0.75g;x=4,VPA=1g）。

【實(shí)施例2】CF-NH₂-AZO-p(VPA-x)-Mⁿ⁺的制備

配制硫酸鈦水溶液（0.1M），氧氯化鋯水溶液（0.1M），氯化鐵水溶液（0.1M）各20mL，分別往這三份溶液里加入0.2g CF-NH₂-AZO-p(VPA-2)，室溫震蕩5h。產(chǎn)物依次用乙醇、水和丙酮清洗，60℃真空干燥。

【實(shí)施例3】三種CF-NH₂-AZO-p(VPA-2)-Mⁿ⁺（Mⁿ⁺=Ti⁴⁺，Zr⁴⁺,Fe³⁺）分別應(yīng)用于β-酪蛋白酶解液中磷酸化多肽的選擇性富集

將β-酪蛋白用100mM Tris-HCl(pH 8.5)配制成1mg/mL的溶液。在上述溶液中按照酶與底物比為1:50(w/w)的比例加入胰蛋白酶，并在37℃反應(yīng)16h。酶解后的多肽產(chǎn)物經(jīng)真空離心濃縮儀抽干后存放在-20℃的冰箱中備用。

準(zhǔn)確稱取5mg CF-NH2-AZO-p(VPA-2)-Mⁿ⁺于1-mL一次性注射器針頭中進(jìn)行萃取。用已經(jīng)平衡好的CF-NH₂-AZO-p(VPA-2)-Mⁿ⁺反復(fù)萃取100μL含有多肽的混合液(3%TFA-50%ACN(v/v))。經(jīng)過上樣液清洗兩遍之后，材料上的分析物用100μL解吸液（2.5%NH₃·H₂O）解吸到離心管中。解吸液經(jīng)真空離心濃縮儀抽干后，加入1.2μL基質(zhì)溶液（20mg/mL 2,5-DHB于50%ACN，1%H₃PO₄的水溶液中）溶解多肽，全部樣品點(diǎn)在MALDI靶上用于MALDI-TOF MS分析。所有的質(zhì)譜分析都采用日本Shimadzu公司的AximaTOF²型基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF MS）。MALDI MS分析時(shí)采用波長(zhǎng)為337nm的氮?dú)饧す馄?，其脈沖寬度為3ns；采用20kV的加速電壓，在正離子反射模式下進(jìn)行檢測(cè)。每張譜圖是200次激光掃描的平均結(jié)果。

檢測(cè)結(jié)果如附圖2所示：當(dāng)β-酪蛋白酶解物未經(jīng)富集直接經(jīng)MALDI MS分析時(shí)，雖然可以檢測(cè)到3個(gè)磷酸化多肽的信號(hào)峰，但是譜圖中存在大量非磷酸化多肽的峰，并且所能檢測(cè)到的磷酸化多肽的峰很弱（圖2a）。經(jīng)過三種CF-NH₂-AZO-p(VPA-2)-Mⁿ⁺分別處理之后，解吸液中均可以檢測(cè)到7個(gè)磷酸化多肽的信號(hào)峰（圖2b,2c,2d），而絕大多數(shù)非磷酸化多肽的信號(hào)被有效地消除，表明這三種CF-NH₂-AZO-p(VPA-2)-Mⁿ⁺對(duì)磷酸化多肽都具有很好的萃取選擇性。其中，所能檢測(cè)到的磷酸化多肽的信息如附表1所示。

【實(shí)施例4】比較CF-NH₂-AZO-p(VPA-x)-Ti⁴⁺在β-酪蛋白和BSA酶解混合液中對(duì)磷酸化多肽的萃取效果

為了比較6種不同磷含量的CF-NH2-AZO-p(VPA-x)-Ti⁴⁺（x=0,0.5,1,2,3,4）對(duì)磷酸化肽段的富集能力，將磷酸化蛋白(β-酪蛋白)與非磷酸蛋白(BSA)酶解產(chǎn)物的混合物作為分析物（β-酪蛋白：BSA=1:100）。

稱取1mg BSA溶于100μL含8M尿素及100mM Tris-HCl的變性緩沖液（pH 8.5）中。在上述溶液中加入5μL 100mM三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽（三羧甲基磷酸，TCEP），并在室溫下反應(yīng)20min以還原蛋白質(zhì)中的二硫鍵。繼續(xù)往上述溶液中加入5μL 100mM碘乙酰胺（IAA），并在避光條件下，室溫下反應(yīng)30min使被還原的巰基烷基化。經(jīng)還原及烷基化的蛋白質(zhì)用300μL 100mM Tris-HCl(pH 8.5)稀釋后，按照酶與底物比為1:50(w/w)的比例加入胰蛋白酶，并在37℃反應(yīng)16h。酶解后的多肽產(chǎn)物抽干后存放在-20℃的冰箱中備用。

準(zhǔn)確稱取5mg CF-NH₂-AZO-p(VPA-x)-Ti⁴⁺于1-mL一次性注射器針頭中進(jìn)行萃取。用已經(jīng)平衡好的CF-NH₂-AZO-p(VPA-2)-Ti⁴⁺反復(fù)萃取100μL含有多肽的混合液(3%TFA-50%ACN(v/v))。經(jīng)過上樣液清洗兩遍之后，材料上的分析物用100μL解吸液（2.5%NH₃·H₂O）解吸到離心管中。解吸液經(jīng)真空離心濃縮儀旋干后，加入1.2μL基質(zhì)溶液（20mg/mL 2,5-DHB于50%ACN，1%H₃PO₄的水溶液中）溶解多肽，全部樣品點(diǎn)在MALDI靶上用于MALDI-TOF MS分析。檢測(cè)結(jié)果如附圖3所示：所有這六種材料對(duì)磷酸化多肽均表現(xiàn)出一定的選擇性，從質(zhì)譜圖中磷酸化多肽個(gè)數(shù)和雜峰情況來看，CF-NH₂-AZO-p(VPA-2)-Ti⁴⁺表現(xiàn)得最好（圖3）。推測(cè)的原因是，當(dāng)磷酸根配體含量太少時(shí)，材料固載金屬離子的能力有限，從而限制其對(duì)磷酸化多肽的萃取能力；當(dāng)磷酸根配體數(shù)量太多時(shí)，過多的磷酸根配體占據(jù)著金屬離子的空軌道，從而削弱了金屬離子對(duì)磷酸化多肽的萃取能力。

【實(shí)施例5】CF-NH₂-AZO-p(VPA-2)-Ti⁴⁺應(yīng)用于更復(fù)雜的β-酪蛋白和BSA酶解混合液中磷酸化多肽的萃取

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)CF-NH2-AZO-p(VPA-2)-Ti⁴⁺對(duì)磷酸化多肽的萃取能力，我們繼續(xù)提高磷酸化蛋白(β-酪蛋白)與非磷酸蛋白(BSA)酶解產(chǎn)物的混合物中BSA的比例。

準(zhǔn)確稱取5mg CF-NH2-AZO-p(VPA-x)-Ti⁴⁺于1-mL一次性注射器針頭中進(jìn)行萃取。用已經(jīng)平衡好的CF-NH2-AZO-p(VPA-2)-Ti⁴⁺反復(fù)萃取100μL含有多肽的混合液(3%TFA-50%ACN(v/v))。經(jīng)過上樣液清洗兩遍之后，材料上的分析物用100μL解吸液（2.5%NH₃·H₂O）解吸到離心管中。解吸液經(jīng)真空離心濃縮儀旋干，加入1.2μL基質(zhì)溶液（20mg/mL 2,5-DHB于50%ACN，1%H₃PO₄的水溶液中）溶解多肽，全部樣品點(diǎn)在MALDI靶上用于MALDI-TOF MS分析。

檢測(cè)結(jié)果如附圖4所示：當(dāng)β-酪蛋白酶解物和BSA酶解物的比例為1:1000時(shí)，在未經(jīng)過前處理的譜圖中只能看到大量的非磷酸化肽信號(hào)（圖4a）；經(jīng)過CF-NH₂-AZO-p(VPA-2)-Ti⁴⁺處理之后，譜圖中可以看到6個(gè)磷酸化肽的峰，而且大量的非磷酸化肽信號(hào)被去除（圖4b），說明CF-NH₂-AZO-p(VPA-2)-Ti⁴⁺對(duì)磷酸化肽有極好的選擇性。

【實(shí)施例6】CF-NH₂-AZO-p(VPA-2)-Ti⁴⁺應(yīng)用于脫脂牛奶酶解物中磷酸化多肽的選擇性富集

脫脂牛奶購(gòu)買自武漢大學(xué)某超市。牛奶的酶解過程如下：取100μL低脂牛奶經(jīng)真空離心濃縮儀抽干后復(fù)溶于100μL含8M尿素及100mM Tirs-HCl的變性緩沖液（pH 8.5）中。上述溶液經(jīng)10mM二硫蘇糖醇（DTT）于37℃下反應(yīng)30min以還原蛋白質(zhì)中的二硫鍵，之后在20mM碘乙酰胺（IAA）中于避光條件下，室溫下反應(yīng)30min使被還原的巰基烷基化。經(jīng)還原及烷基化的蛋白質(zhì)用300μL 100mM Tris-HCl(pH 8.5)稀釋后，按照酶與底物比為1:50(w/w)的比例加入胰蛋白酶，并在37℃反應(yīng)16h。所有的酶解物保存在-20℃冰箱中備用。酶解后的多肽樣品稀釋500倍后用于材料的選擇性評(píng)價(jià)。

稱取5mg CF-NH₂-AZO-p(VPA-x)-Ti⁴⁺于1-mL一次性注射器針頭中進(jìn)行萃取。萃取磷酸化多肽時(shí)，牛奶酶解物用上樣液稀釋500倍再進(jìn)行萃取。上樣液和解吸液分別為100μL 3%TFA-50%ACN(v/v)和2.5%氨水水溶液。萃取完成之后，解吸液進(jìn)行冷凍旋干，1.2μL基質(zhì)溶液(20mg/mL 2,5-DHB in 50%(v/v)ACN,1%(v/v)H₃PO₄)溶解多肽，全部樣品點(diǎn)在MALDI靶上用于MALDI-TOF MS分析。

檢測(cè)結(jié)果如附圖5所示：牛奶酶解物未經(jīng)過材料處理直接進(jìn)樣時(shí)，質(zhì)譜圖中只能看到6個(gè)磷酸化多肽以及大量的非磷酸化肽（圖5a）；經(jīng)過材料處理之后，質(zhì)譜圖中清晰的呈現(xiàn)著25個(gè)磷酸化多肽（圖5b，附表2），表明材料可用于實(shí)際樣品分析。

【實(shí)施例7】CF-NH₂-AZO-p(VPA-2)-Ti⁴⁺應(yīng)用于血清中內(nèi)源性磷酸化多肽的富集

正常人的血清樣品通過標(biāo)準(zhǔn)的臨床渠道從武漢大學(xué)校醫(yī)院獲得，采集到的血清保存在-20℃冰箱中。

準(zhǔn)確稱取5mg CF-NH₂-AZO-p(VPA-x)-Ti⁴⁺于1-mL一次性注射器針頭中進(jìn)行萃取。萃取磷酸化多肽時(shí)，血清（2μL）需要用上樣液稀釋50倍再進(jìn)行萃取。上樣液和解吸液分別為100μL 3%TFA-50%ACN(v/v)和2.5%氨水水溶液。萃取完成之后，解吸液進(jìn)行冷凍旋干，1.2μL基質(zhì)溶液(20mg/mL 2,5-DHB in 50%(v/v)ACN,1%(v/v)H₃PO₄)溶解多肽，全部樣品點(diǎn)在MALDI靶上用于MALDI-TOF MS分析。

檢測(cè)結(jié)果如附圖5所示：血清未經(jīng)過材料處理直接進(jìn)樣時(shí)，質(zhì)譜圖中只能非磷酸多肽的信號(hào)（圖5c）；經(jīng)過材料處理之后，質(zhì)譜圖中清晰的呈現(xiàn)著4個(gè)磷酸化多肽，而且?guī)缀蹩床坏椒橇姿峄牡男盘?hào)（圖5d，附表3），表明材料適用于高蛋白生物樣品的分析。

【實(shí)施例8】CF-NH2-AZO-p(VPA-2)-Ti⁴⁺應(yīng)用于鼠腦裂解液中磷酸化多肽的富集

斯普拉格（SD）雌性大鼠由湖北省疾控中心提供，年齡3～4個(gè)月，體重250～300g。鼠腦被取下后，清洗干凈，切碎。取0.5g鼠腦組織，用勻漿管研碎，加入1mL RIPA裂解液（含磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑）。在冰浴中裂解30分鐘后，于4℃下12000rpm離心30min，收集上清液。利用BCA方法對(duì)上述上清液中的蛋白進(jìn)行定量。往上述上清液中加入3體積的丙酮/乙醇/乙酸混合液（50/50/0.1,v/v/v）進(jìn)行蛋白沉淀。之后4℃下4000rpm離心30min；去除上清液后，得到蛋白質(zhì)，在空氣中晾干。蛋白質(zhì)用含8M尿素和0.2M Tris，4mM CaCl2的溶液復(fù)溶后同上述步驟進(jìn)行酶解。酶解后的多肽產(chǎn)物經(jīng)C18脫鹽并抽干后存放在-20℃的冰箱中備用。

準(zhǔn)確稱取10mg CF-NH2-AZO-p(VPA-x)-Ti⁴⁺于1-mL一次性注射器針頭中進(jìn)行萃取。萃取鼠腦裂解液樣品時(shí)，鼠腦蛋白的用量為0.5mg。上樣液和解吸液分別為100μL 3%TFA-50%ACN(v/v)和2.5%氨水水溶液。解吸液經(jīng)真空離心濃縮儀抽干后，用C18SPE脫鹽，然后用反相液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（LC-ESI-MS/MS）分析。

經(jīng)富集后的細(xì)胞裂解物酶解產(chǎn)物采用nanoRPLC-ESI-MS/MS（TripleTOF 5600+，ABSciex）進(jìn)行質(zhì)譜分析。多肽首先被結(jié)合到CapTrap柱（5μm,5×0.3mm,Agilent Technologies）上，然后被洗脫到反相C18分析柱（75μm×150mm,3μmparticle size,poresize,Eksigent）上。液相色譜的流動(dòng)相分別為溶液A（3%DMSO,97%H₂O,0.1%甲酸）和溶液B（3%DMSO,97%ACN,0.1%甲酸），其梯度設(shè)置如表3-1所示，流速為300nL/min。一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍從400到1800amu，250ms累積時(shí)間。每個(gè)完整的一級(jí)質(zhì)譜掃描包括40次二級(jí)質(zhì)譜分析，掃描范圍從350到1500amu，離子的帶電量為+2到+5價(jià)。二級(jí)質(zhì)譜分析閥值設(shè)為120，18秒內(nèi)排除相同質(zhì)荷比離子。

檢測(cè)結(jié)果如圖6所示：該方法在0.5mg鼠腦裂解液中共檢測(cè)到3241個(gè)磷酸化多肽，其中單磷酸化多肽有2975個(gè)，多磷酸化多肽有266個(gè)，對(duì)磷酸化多肽的特異性為86.6%（圖6）。此外，該方法共鑒定到3760個(gè)磷酸化位點(diǎn)。結(jié)果表明該材料在復(fù)雜生物樣品的分析中表現(xiàn)良好，有望用于磷酸化蛋白組的全分析。

表1β-酪蛋白酶解液中鑒定到的磷酸化多肽的詳情

“_”表示磷酸化位點(diǎn)

表2脫脂牛奶酶解液中鑒定到的磷酸化多肽的詳情

“_”表示磷酸化位點(diǎn);[Mo]表示蛋氨酸的氧化位點(diǎn)。

表3人類血清中鑒定到的磷酸化多肽的詳情

“_”表示磷酸化位點(diǎn)。