一種靜電紡絲納米纖維-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種靜電紡絲納米纖維-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明的制備方法步驟簡(jiǎn)單易行，無(wú)需大型設(shè)備。制備得到的符合材料兼具有靜電紡絲納米纖維以及細(xì)胞外基質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)，與單純的靜電紡絲納米纖維材料或細(xì)胞外基質(zhì)材料相比，具有很好生物相容性的同時(shí)具有很好的機(jī)械力學(xué)性能，更易于細(xì)胞黏附增值，在醫(yī)學(xué)組織工程修復(fù)上有很高的應(yīng)用前景和實(shí)用價(jià)值，能有效促進(jìn)細(xì)胞的黏附生長(zhǎng)、增殖、遷移和分化，可大規(guī)模擴(kuò)增培養(yǎng)干細(xì)胞。此外，復(fù)合材料還具備低抗原性，經(jīng)過嚴(yán)格篩選，無(wú)疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)。
【專利說明】一種靜電紡絲納米纖維-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于高分子材料【技術(shù)領(lǐng)域】和組織工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種靜電紡絲納米纖維-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】[0002]細(xì)胞載體培養(yǎng)是一種可以大規(guī)模培養(yǎng)貼壁細(xì)胞的技術(shù)和方法，是當(dāng)前貼壁依賴型細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的主要方法。通過對(duì)細(xì)胞沒有毒副作用的載體介質(zhì)，細(xì)胞貼附于載體表面或內(nèi)部，可以大大提高細(xì)胞培養(yǎng)面積和效率，如微載體培養(yǎng)技術(shù)，具有均相培養(yǎng)兼具平板培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)，培養(yǎng)條件(溫度、PH值、二氧化碳濃度等)容易控制，并且培養(yǎng)過程系統(tǒng)化、自動(dòng)化，不易被污染。但是，目前市面上的細(xì)胞載體(例如Cytodex系列微載體)大多價(jià)格昂貴，不適于工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞。目前用于干細(xì)胞大規(guī)模擴(kuò)增的載體材料包括天然材料和人工合成材料兩種，人工合成的材料主要有聚乙交醋、聚丙交醋以及兩者的共聚物等。人工合成材料的缺點(diǎn)是疏水性，不利于細(xì)胞的粘附，并且降解產(chǎn)物呈酸性，對(duì)細(xì)胞。而天然材料來源于動(dòng)物或人體，其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、成分、生物力學(xué)環(huán)境適合種子細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育及新陳代謝，材料可降解，因此越來越受到研究者的重視。
[0003]經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，M.PohlSCheidt等人在《VaCCine》Volume26,SSuel2,17Mareh2008，PageS1552-1565 報(bào)道了使用 Cytodex-3 微載體進(jìn)行了 50L 牛腎細(xì)胞BKKL3A株反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)，并且對(duì)工業(yè)大規(guī)模工程放大做了基礎(chǔ)研究，而這種大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)和重復(fù)性的生產(chǎn)活動(dòng)需耗費(fèi)大量的微載體，目前常用的商品化微載體有Cytodex系列、biosilon系列、5010微載體等，這些微載體對(duì)用于細(xì)胞培養(yǎng)來說，價(jià)格往往過于昂貴，用于大規(guī)模生產(chǎn)成本大，不適合進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)；同時(shí)，作為成型商品，這些細(xì)胞載體的形狀和大小已經(jīng)固定，不易加以改動(dòng)，影響了相應(yīng)工藝的設(shè)計(jì)、改進(jìn)和優(yōu)化。
[0004]靜電紡絲技術(shù)，因其操作簡(jiǎn)便、可紡材料廣泛，在過去二十年中得到了飛速發(fā)展，正成為超細(xì)纖維制備工藝中最常用的技術(shù)之一。電紡纖維的直徑多為納米或亞微米級(jí)，具有極高的比表面積和孔隙率，在組織工程領(lǐng)域具備一定應(yīng)用潛力。有資料表明，納米纖維支架紡織狀的形貌結(jié)構(gòu)以及納米級(jí)別的纖維直徑與動(dòng)物體內(nèi)的天然蛋白纖維非常類似，該種結(jié)構(gòu)可極大地促進(jìn)種子細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)以及繁殖。但是靜電紡絲材料的缺點(diǎn)是疏水性強(qiáng)，不利于細(xì)胞的粘附，并且降解產(chǎn)物呈酸性，在體內(nèi)容易引起炎癥反應(yīng)。
[0005]存在于細(xì)胞間的纖維狀和球形蛋白質(zhì)的網(wǎng)狀系統(tǒng)稱之為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，ECM是細(xì)胞環(huán)境的一種重要組成部分，細(xì)胞分泌的各種ECM成分形成基質(zhì)間質(zhì)和基質(zhì)膜，在體內(nèi)細(xì)胞錨定在該構(gòu)架上。這些結(jié)構(gòu)提供了組織特異性組織學(xué)的機(jī)體形成和發(fā)展所需要的空間定位和穩(wěn)定性。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)包括膠原、非膠原糖蛋白、氨基聚糖與蛋白聚糖、以及彈性蛋白，通過維持細(xì)胞存活、決定細(xì)胞形狀、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、控制細(xì)胞分化并參與細(xì)胞遷移來保持組織功能正常，維持新陳代謝旺盛。脫細(xì)胞基質(zhì)由于去除了細(xì)胞和可溶性蛋白等引起免疫反應(yīng)的物質(zhì)，并且保留了原先的天然結(jié)構(gòu)，已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。但是單純使用細(xì)胞外基質(zhì)作為組織工程修復(fù)材料具有機(jī)械力學(xué)性能差，不能有效的抵抗軟組織的壓力等缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有細(xì)胞外基質(zhì)材料作為細(xì)胞載體的不足，公開一種靜電紡絲納米纖維-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料的制備方法，該方法工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，操作簡(jiǎn)便，有利于降低日后工業(yè)化大規(guī)模貼壁細(xì)胞載體培養(yǎng)的成本。
[0007]本發(fā)明另一個(gè)目的在于公開一種靜電紡絲納米纖維-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料。
[0008]本發(fā)明還有一個(gè)目的在于公開一種靜電紡絲納米纖維-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的上述目的通過如下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
一種靜電紡絲納米纖維-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料的制備方法，包括如下步驟:
51.制備生物降解材料的靜電紡絲纖維膜，所述生物降解材料為聚己內(nèi)酯(PCL)、左旋聚乳酸(PLLA)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)；
52.將步驟SI制得的靜電紡絲纖維膜平鋪在細(xì)胞培養(yǎng)容器中，用培養(yǎng)基浸泡，然后接種干細(xì)胞，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5~10天，每隔2~3天更換培養(yǎng)基，接著進(jìn)行脫細(xì)胞處理，最后干燥即可得到靜電紡絲納米纖維-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料。
[0010]本發(fā)明選用特定種類的生物降解材料作為靜電紡絲原料，制得三維靜電紡絲纖維支架，再于ECM結(jié)合制得生物相容性好、機(jī)械力學(xué)性能和降解性能優(yōu)異、易于細(xì)胞黏附增殖的復(fù)合材料，所述生物降解 材料為聚己內(nèi)酯(PCL)、左旋聚乳酸(PLLA)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)(共混比例9: f 3:1)，所述生物降解材料的重均分子量為10萬(wàn)~20萬(wàn)。
[0011]本發(fā)明所述靜電紡絲纖維膜采用常規(guī)靜電紡絲技術(shù)制備即可，作為一種實(shí)施方案，步驟Si的具體步驟為先將生物降解材料溶解制得紡絲溶液，接著紡絲溶液通過常規(guī)靜電紡絲裝置進(jìn)行紡絲，最后分離紡絲纖維即得靜電紡絲纖維膜。
[0012]優(yōu)選地，所述靜電紡絲裝置的參數(shù)設(shè)置為:微量推進(jìn)泵的推進(jìn)速度為0.Π.0毫升/小時(shí)，高壓電源電壓值為10-20千伏，制得的靜電紡絲纖維膜結(jié)構(gòu)和性能更優(yōu)，纖維粗細(xì)均勻，大小適中，有利于后續(xù)與ECM的結(jié)合。
[0013]優(yōu)選地，所述紡絲溶液中生物降解材料的濃度為6(T100 mg/mL，溶液的粘度適中，利于后續(xù)的靜電紡絲。
[0014]優(yōu)選地，所述紡絲溶液的溶劑為二氯甲烷與N，N-二甲基甲酰胺的混合溶劑，二氯甲烷與N，N- 二甲基甲酰胺的體積比為6: f 9:1，采用特定配比的混合溶劑更有利于分散生物降解材料，有利于后續(xù)的靜電紡絲。
[0015]優(yōu)選地，步驟S2中所述培養(yǎng)基中含有濃度為2(T30mM的抗壞血酸，抗壞血酸能夠刺激誘導(dǎo)干細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)。
[0016]步驟S2中接種干細(xì)胞的密度為100(T3000/Cm2，所述干細(xì)胞為人源P3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞或滑膜干細(xì)胞。
[0017]步驟S2中所述脫細(xì)胞的步驟為:將細(xì)胞培養(yǎng)容器放入_80°C冰箱冷凍5~10min，接著取出室溫解凍，用去離子水沖洗細(xì)胞培養(yǎng)容器表面，循環(huán)操作21次。
[0018]優(yōu)選地，步驟S2中所述干燥為冷凍干燥，冷凍干燥的時(shí)間為12~72小時(shí)，目的是除去復(fù)合材料表面殘余的水且不破壞復(fù)合材料的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。
[0019]一種根據(jù)本發(fā)明靜電紡絲納米纖維-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料的制備方法制備得到的靜電紡絲納米纖維-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料。
[0020]本發(fā)明制備得到的靜電紡絲納米纖維-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料在組織工程領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[0021]本發(fā)明制備得到的靜電紡絲納米纖維-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料在間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)中的應(yīng)用。[0022]本發(fā)明所述體外培養(yǎng)為細(xì)胞增殖、分化或遷移。
[0023]本發(fā)明制備得到的靜電紡絲納米纖維-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料中，靜電紡絲納米纖維既可以增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)的強(qiáng)度、提高機(jī)械力學(xué)性能，同時(shí)靜電紡絲納米纖維特有的表面結(jié)構(gòu)能增強(qiáng)細(xì)胞的粘附，與常規(guī)的平面培養(yǎng)相比更有利于細(xì)胞的遷移和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。此外，本發(fā)明選用的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)含有大量的膠原蛋白以及生長(zhǎng)因子，這些都能促進(jìn)細(xì)胞的粘附和增殖。
[0024]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
本發(fā)明公開一種靜電紡絲納米纖維-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明的制備方法步驟簡(jiǎn)單易行，無(wú)需大型設(shè)備。制備得到的符合材料兼具有靜電紡絲納米纖維以及細(xì)胞外基質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)，與單純的靜電紡絲納米纖維材料或細(xì)胞外基質(zhì)材料相比，具有很好生物相容性的同時(shí)具有很好的機(jī)械力學(xué)性能，更易于細(xì)胞黏附增值，在醫(yī)學(xué)組織工程修復(fù)上有很高的應(yīng)用前景和實(shí)用價(jià)值，能有效促進(jìn)細(xì)胞的黏附生長(zhǎng)、增殖、遷移和分化，可大規(guī)模擴(kuò)增培養(yǎng)干細(xì)胞。此外，復(fù)合材料還具備低抗原性，經(jīng)過嚴(yán)格篩選，無(wú)疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為靜電紡絲納米纖維-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料電鏡圖；
圖2為靜電紡絲納米纖維-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料免疫熒光染色圖，其中A為III型膠原，B為層粘連蛋白，C為I型膠原，D為纖連蛋白；
圖3為靜電紡絲納米纖維-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料的細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞活力(CCK-8)檢測(cè)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的解釋說明，但具體實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明作任何限定。除非特別說明，實(shí)施例中所涉及的試劑、方法均為本領(lǐng)域常用的試劑和方法。
[0027]實(shí)施例1
1、制備生物降解材料的靜電紡絲纖維膜:
(I)稱取160mg的PCL (分子量10萬(wàn))，溶于2ml 二氯甲烷與N，N-二甲基甲酰胺的混合溶劑中(8:1，CH2C12/DMF, v/v)，制得濃度為80 mg/mL的PCL溶液，用封口膜封口，磁力攪拌3小時(shí)，待用。
[0028](2)將步驟(1)制得的PCL溶液置于靜電紡絲裝置的注射器中，調(diào)節(jié)微量推進(jìn)泵參數(shù)，容量0.2毫升，推進(jìn)速度1.0毫升/小時(shí)，運(yùn)行。打開旋轉(zhuǎn)裝置，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速使轉(zhuǎn)動(dòng)穩(wěn)定。打開高壓電源，調(diào)節(jié)電壓值為20千伏，開始紡絲，沿著錫箔紙接收器的方向接收紡絲。[0029](3)紡絲結(jié)束后(約十分鐘)，取下錫箔紙，用玻璃棒沿著收集紡絲的錫箔紙表面方向?qū)⒅苽涞玫降募徑z纖維膜取下。
[0030]2、復(fù)合材料的制備:
將上一步制得的靜電紡絲纖維膜剪成直徑為5cm的圓片狀，分別放入含有培養(yǎng)基的6孔板中浸泡3小時(shí)后，每孔接種密度為30000/cm2的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，放入95%，37°C的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天，每2~3天換一次液。然后采用循環(huán)冷凍的方法脫細(xì)胞處理，使用濃度為0.25%戊二醛溶液固定12小時(shí)，放入凍干機(jī)凍干處理24小時(shí)即得目標(biāo)復(fù)合材料。
[0031]3、SEM 檢測(cè)
將靜電紡絲納米纖維-細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)載體材料固定于樣品臺(tái)上，噴金處理，置于熱場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡的真空室內(nèi)，20kV電壓下觀察，得到SEM觀察圖。產(chǎn)品如圖1所示。從圖1可以看出，細(xì)胞外基質(zhì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)很好的附著在靜電紡絲納米纖維表面。
[0032]實(shí)施例2
1、制備生物降解材料的靜電紡絲纖維膜:
(I)稱取200mg的PLGA (分子量15萬(wàn)，乳酸和羥基乙酸的比例為9:1)，溶于2ml 二氯甲烷與N，N- 二甲基甲酰胺的混合溶劑中(6:1，CH2C12/DMF, v/v),制得濃度為100 mg/mL的PLGA溶液，用封口膜封口，磁力攪拌3小時(shí)，待用。
[0033](2)將步驟(1)制得的PLGA溶液置于靜電紡絲裝置的注射器中，調(diào)節(jié)微量推進(jìn)泵參數(shù)，容量0.2毫升，推進(jìn)速度0.4毫升/小時(shí)，運(yùn)行。打開旋轉(zhuǎn)裝置，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速使轉(zhuǎn)動(dòng)穩(wěn)定。打開高壓電源，調(diào)節(jié)電壓值為10千伏，開始紡絲，沿著錫箔紙接收器的方向接收紡絲。
[0034](3)紡絲結(jié)束后(約十分鐘)，取下錫箔紙，用玻璃棒沿著收集紡絲的錫箔紙表面方向?qū)⒅苽涞玫降募徑z纖維膜取下。
[0035]2、復(fù)合材料的制備:
將上一步制得的靜電紡絲纖維膜剪成直徑為5cm的圓片狀，分別放入含有培養(yǎng)基的6孔板中浸泡3小時(shí)后，每孔接種密度為30000/cm2的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，放入95%，37°C的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天，每2~3天換一次液。然后采用循環(huán)冷凍的方法脫細(xì)胞處理，使用濃度為0.25%戊二醛溶液固定12小時(shí)，放入凍干機(jī)凍干處理24小時(shí)即得目標(biāo)復(fù)合材料。
[0036]3、靜電紡絲納米纖維-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料免疫熒光染色
將制備得到的靜電紡絲納米纖維-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料放入戊二醛溶液中室溫固定30min。然后使用磷酸緩沖液沖洗3遍，每次5min。加入濃度為5%的BSA溶液封閉處理一個(gè)小時(shí)，然后用磷酸緩沖液清洗I次，加入層粘連蛋白，玻連蛋白，I型膠原，III型膠原一抗，孵育12小時(shí)，用磷酸緩沖液清洗三次，加入PE染料連接的二抗，孵育30min，磷酸緩沖液清洗三次。然后將樣品置于激光共聚焦顯微鏡拍照。實(shí)施例結(jié)果如圖2所示，其中A為III型膠原，B為層粘連蛋白，C為I型膠原，D為纖連蛋白。
[0037]從圖2可以看出，脫細(xì)胞處理后，細(xì)胞外基質(zhì)上對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)起關(guān)鍵性作用的層粘連蛋白，玻連蛋白，I型膠原，III型膠原均在靜電紡絲納米纖維-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料上保
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[0038]實(shí)施例3
1、制備生物降解材料的靜電紡絲纖維膜:
(I)稱取120mg的PLLA (分 子量20萬(wàn))，溶于2ml 二氯甲烷與N，N- 二甲基甲酰胺的混合溶劑中(9:1，CH2C12/DMF, v/v)，制得濃度為60 mg/mL的PLLA溶液，用封口膜封口，磁力攪拌3小時(shí)，待用。
[0039](2)將步驟(1)制得的PLLA溶液置于靜電紡絲裝置的注射器中，調(diào)節(jié)微量推進(jìn)泵參數(shù)，容量0.2毫升，推進(jìn)速度0.5毫升/小時(shí)，運(yùn)行。打開旋轉(zhuǎn)裝置，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速使轉(zhuǎn)動(dòng)穩(wěn)定。打開高壓電源，調(diào)節(jié)電壓值為14千伏，開始紡絲，沿著錫箔紙接收器的方向接收紡絲。
[0040](3)紡絲結(jié)束后(約十分鐘)，取下錫箔紙，用玻璃棒沿著收集紡絲的錫箔紙表面方向?qū)⒅苽涞玫降募徑z纖維膜取下。
[0041]2、復(fù)合材料的制備:
將上一步制得的靜電紡絲纖維膜剪成直徑為5cm的圓片狀，分別放入含有培養(yǎng)基的6孔板中浸泡3小時(shí)后，每孔接種密度為30000/cm2的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，放入95%，37°C的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天，每2~3天換一次液。然后采用循環(huán)冷凍的方法脫細(xì)胞處理，使用濃度為0.25%戊二醛溶液固定12小時(shí)，放入凍干機(jī)凍干處理24小時(shí)即得目標(biāo)復(fù)合材料。
[0042]3、細(xì)胞 Cell Counting Kit-8 活力(CCK-8)檢測(cè)
將制備得到的靜電紡絲納米纖維-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料剪成底面積為0.32cm2的圓片形放入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，完全培養(yǎng)基浸泡24小時(shí)后，接種密度為3000/cm2的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，分別的培養(yǎng)的第1、3、5、7天使用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖活力，具體檢測(cè)步驟為:
(I)在96孔板中接種細(xì)胞懸液(100 μ L/孔)。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)(37°C，5%CO2) ο
[0043](2)向每孔加入10 μ L CCK溶液。
[0044](3)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4小時(shí)。
[0045](4 )用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。
[0046]其中使用在PLLA膜表面(采用本領(lǐng)域常規(guī)方法制備，將4mgPLLA溶于二氧環(huán)烷溶液，然后將4mg/ml的PLLA溶液平鋪至培養(yǎng)皿，放到真空干燥箱60°C 24小時(shí)制得PLLA膜)以及PLLA靜電紡絲微米纖維膜(采用本領(lǐng)域常規(guī)方法制備，通過紡絲溶液的濃度控制紡絲的粒徑大小，微米纖維膜的紡絲溶液濃度為6mg/ml，其他條件同納米靜電紡絲的制備工藝)，亞微米纖維膜表面(采用本領(lǐng)域常規(guī)方法制備，亞微米纖維膜的紡絲溶液濃度為10mg/ml，其他條件同納米靜電紡絲的制備工藝)以及TCPS表面構(gòu)建的ECM載體材料孔作為對(duì)照組，對(duì)照組分別命名為PLLA膜-ECM組、PLLA微米纖維膜-ECM組、PLLA亞微米纖維膜-ECM組、TCPS-ECM組。測(cè)試結(jié)果如圖3所示。
[0047]圖3的結(jié)果表明，在靜電紡絲納米纖維-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料上細(xì)胞活力較強(qiáng)，在第3、5天均明顯高于各個(gè)對(duì)照組，說明本發(fā)明制得的復(fù)合材料生物相容性及促進(jìn)干細(xì)胞體外增殖的性能最優(yōu)。由于96孔板中細(xì)胞生長(zhǎng)空間有限，細(xì)胞密度較大會(huì)產(chǎn)生接觸抑制，細(xì)胞增殖能力下降，因而導(dǎo)致 第7天靜電紡絲納米纖維-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料的增殖活力率略低于TCPS-ECM組。
【權(quán)利要求】
1.一種靜電紡絲納米纖維-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 51.制備生物降解材料的靜電紡絲纖維膜，所述生物降解材料為聚己內(nèi)酯、左旋聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物； 52.將步驟SI制得的靜電紡絲纖維膜平鋪在細(xì)胞培養(yǎng)容器中，用培養(yǎng)基浸泡，然后接種干細(xì)胞，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5~10天，每隔2~3天更換培養(yǎng)基，接著進(jìn)行脫細(xì)胞處理，最后干燥即可得到靜電紡絲納米纖維-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟SI的具體步驟為先將生物降解材料溶解制得紡絲溶液，接著紡絲溶液通過常規(guī)靜電紡絲裝置進(jìn)行紡絲，最后分離紡絲纖維即得靜電紡絲纖維膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于，所述紡絲溶液中生物降解材料的濃度為 60~100 mg/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述制備方法，其特征在于，所述紡絲溶液的溶劑為二氧環(huán)烷、二氯甲烷、三氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶劑，二氯甲烷與N，N-二甲基甲酰胺的體積比為6: f 9:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于，所述靜電紡絲裝置的參數(shù)設(shè)置為:微量推進(jìn)泵的推進(jìn)速度為0.Π.0毫升/小時(shí)，高壓電源電壓值為10-20千伏。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟S2中接種干細(xì)胞的密度為100(T3000/Cm2，所述干細(xì)胞為人源P3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞或滑膜干細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，所述脫細(xì)胞的步驟為:將細(xì)胞培養(yǎng)容器放入_80°C冰箱冷凍5~lOmin，接著取出室溫解凍，用去離子水沖洗細(xì)胞培養(yǎng)容器表面，循環(huán)操作2~6次。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟S2中所述干燥為冷凍干燥，冷凍干燥的時(shí)間為12~72小時(shí)。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述制備方法制備得到的靜電紡絲納米纖維-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料。
10.權(quán)利要求9所述靜電紡 絲納米纖維-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料在間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】D04H1/728GK103877622SQ201410116021
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年3月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月26日
【發(fā)明者】龔逸鴻, 徐勇, 張栩杰, 何帆, 李燕, 蔣慶 申請(qǐng)人:中山大學(xué)