專(zhuān)利名稱(chēng)：一種表達(dá)糖苷酶的微生物菌種和其用于生物酶法造紙的技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物酶法造紙技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種表達(dá)糖苷酶的微生物菌種及其用于造紙的技術(shù)。
背景技術(shù)：
由于生物科技的迅猛發(fā)展，其他行業(yè)受益于其發(fā)展成果的優(yōu)勢(shì)也越發(fā)明顯，并正在迅速蔓延。造紙行業(yè)是眾所周知的主要污染行業(yè)，尤其在制漿造紙的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的化學(xué)物污染。根據(jù)2008年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明:中國(guó)的制漿造紙產(chǎn)量達(dá)到7980萬(wàn)噸，成為全球產(chǎn)量第一的紙業(yè)大國(guó)，國(guó)家也花費(fèi)了大量的資金用于造紙行業(yè)的污水、廢氣、固體廢棄物的治理。將現(xiàn)代生物技術(shù)用于造紙行業(yè)的節(jié)能減排、污染治理是今后最有前景的解決方法。傳統(tǒng)造紙是以堿法、亞銨法、亞鈉法和半化學(xué)法等分解原料漿中的纖維素為生產(chǎn)工藝，該工藝在制漿技術(shù)在制漿蒸煮過(guò)程中有大量的黑色制漿廢液產(chǎn)生、排出，是我國(guó)江河、湖泊的主要污染源之一，給人們的生活帶來(lái)了極大的危害。而我們的酶解法是以可降解的生物酶降解纖維素作為主要生產(chǎn)工藝，以達(dá)到綠色環(huán)保。

原有的造紙?jiān)现饕獮槟静?，小麥等，造成?guó)家自然資源的極大消耗，已經(jīng)有報(bào)道應(yīng)用農(nóng)作物如玉米秸桿作為造紙的原料[專(zhuān)利00812212.1由羅伯特.W.赫特；小梅德威克.V.伯德申報(bào)專(zhuān)利:采用玉米秸桿和其他非木本纖維材料的制漿工藝]，經(jīng)查新國(guó)外也在近年出現(xiàn)利用香蕉葉進(jìn)行造紙[PL2005038265020050915、99118241.3和JP2002212888(A)]，但是結(jié)果發(fā)現(xiàn)很難產(chǎn)業(yè)化和應(yīng)用，因?yàn)閱我晦r(nóng)作物或者單一樹(shù)葉無(wú)法達(dá)到紙張的強(qiáng)度、透氣性和撕裂度等綜合指標(biāo)的要求。過(guò)去，纖維素酶被分為內(nèi)切型和外切型兩類(lèi).內(nèi)切型被認(rèn)為是不規(guī)則地切斷纖維素分子鏈；而外切型被認(rèn)為是從分子鏈的非還原末端開(kāi)始.以纖維二糖為單位將分子鏈依次分解。不過(guò)，如檢查一下內(nèi)切型纖維素酶(EG)和外切型纖維素酶(cBH)將纖維素分解產(chǎn)生的可溶性纖維低糖的分解結(jié)構(gòu)，則上述的分解方式就未必合適。如果只對(duì)纖維素分子鏈，就會(huì)在纖維素酶分類(lèi)為內(nèi)切型和外切型上產(chǎn)生疑問(wèn)。有文獻(xiàn)[5]還報(bào)導(dǎo)了在大麥用CBH處理產(chǎn)生的B — 1，3、1，4 一葡聚糖、以及末葡聚糖水解方式上，也是切斷纖維素分子鏈內(nèi)部的0-1，4鍵。此外，在纖維低糖的類(lèi)似基質(zhì)上.也確認(rèn)有同樣的情況。因此，如僅檢查纖維素分子鏈的水解方式.剛在所有纖維素酶中，很多都有內(nèi)切型的性質(zhì)，在實(shí)際意義上，很難說(shuō)有外切型纖維素酶。金炳鉉使用的試劑級(jí)酶(SIGMA)，纖維素酶調(diào)查有關(guān)的表面的纖維和紙張的物理性能的影響。他的調(diào)查為內(nèi)切-β_1，4葡聚糖酶和外切-β-1，4葡聚糖酶。第一內(nèi)切-β-1，4葡聚糖酶的表面上的原纖化的纖維出現(xiàn)剝離現(xiàn)象。外切-β -1，4葡聚糖酶的纖維，在結(jié)束分解纖維素前形成是細(xì)胞核開(kāi)始耗盡，外切-β-1，4葡聚糖酶與破裂的濃度的增加，拉伸強(qiáng)度變大，表示該信息的度分別為78，34，17。然而，內(nèi)切-β_1，4葡聚糖酶的出現(xiàn)從0.3到最大的效果，顯示出兩個(gè)以上的聚合酶，將在有不利影響時(shí)出現(xiàn)互補(bǔ)作用。但是韓國(guó)的專(zhuān)利[KR20010028982(A)]顯示盡管他們也使用糖苷酶進(jìn)行降解紙漿，但還是采用加入糖苷酶試劑的方法，成本較高，而且加入的酶的穩(wěn)定性不強(qiáng)，保持時(shí)間有限，使目前無(wú)法真正轉(zhuǎn)化到產(chǎn)業(yè)化中使用。實(shí)際上糖苷酶(Glycosidase,EC3.2.1)即糖苷水解酶(glycoside hydrolases,GH)，又稱(chēng)為糖基水解酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物中。它不僅來(lái)源廣泛同時(shí)也是酶法合成糖苷類(lèi)化合物的一類(lèi)重要工具酶，常見(jiàn)的類(lèi)型如β_半乳糖苷酶、β_葡萄糖苷酶、α—甘露糖苷酶等。到目前為止，已被報(bào)道的大多數(shù)糖苷酶屬常溫酶類(lèi)，由于其熱穩(wěn)定性較差，對(duì)有機(jī)溶劑不穩(wěn)定等缺點(diǎn)而不適合用于酶法合成糖苷類(lèi)化合物，所以，尋找新型穩(wěn)定的、耐高溫的酶源逐漸成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。嗜熱糖苷酶，因具有良好的熱穩(wěn)定性，較長(zhǎng)的半衰期，水解速度快，可采用熱處理方法，可以純化，操作相對(duì)方便，污染危險(xiǎn)較小等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明利用該酶的特點(diǎn)，將該酶通過(guò)基因工程方法在微生物中進(jìn)行表達(dá)，以利用微生物在擴(kuò)增和不斷增長(zhǎng)期，不斷生長(zhǎng)和分泌表達(dá)該酶，從而直接連續(xù)降解農(nóng)作物和樹(shù)葉中主要需要降解的纖維素，替代傳統(tǒng)工藝的強(qiáng)堿降解方法，成本低，有長(zhǎng)久性應(yīng)用價(jià)值，即環(huán)保又降低了紙產(chǎn)品的有害性，真正將生物技術(shù)應(yīng)用到造紙工藝中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種直接利用分泌嗜熱糖苷酶的工程菌分解造紙漿的方法，包括以下步驟:
I)以農(nóng)作物秸桿為原料，粉碎，浸泡20-30小時(shí)形成原料漿；2)構(gòu)建并擴(kuò)增分泌嗜熱糖苷酶的工程菌種子并經(jīng)一級(jí)和二級(jí)菌種培養(yǎng)，當(dāng)?shù)诙N的OD值為0.4-0.8時(shí)，于25°C _37°C下用0.2-0.7mM的IPTG誘導(dǎo)嗜熱糖苷酶的表達(dá)；3)將步驟2)所獲得的二級(jí)菌種液按體積比1:20_40加入到步驟I)的原料漿中，于室溫下處理漿液過(guò)夜；4)撈出漿料、煮沸、清洗、破碎，抄紙并烘烤成型。進(jìn)一步地，所述分泌嗜熱糖苷酶的工程菌是轉(zhuǎn)染了表達(dá)質(zhì)粒pET-28b_0602的大腸桿菌，所述表達(dá)質(zhì)粒pET-28b-0602具有如圖2B所示的結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步地，所述農(nóng)作物秸桿選自配比為1:1_10:1的玉米:小麥秸桿、4:1-9:1的香蕉葉:魚(yú)骨樹(shù)葉，1:1-5:1的香蕉葉:玉米稻桿、I:1-5:1的香蕉葉:小麥稻桿。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了所述分泌嗜熱糖苷酶的工程菌在分解造紙漿中的應(yīng)用。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種分泌嗜熱糖苷酶的工程菌，所述工程菌是轉(zhuǎn)染了表達(dá)質(zhì)粒pET-28b-0602的大腸桿菌，所述表達(dá)質(zhì)粒pET-28b_0602具有如圖2B所示的結(jié)構(gòu)。


圖1是以超嗜熱古細(xì)菌的基因組為模板擴(kuò)增嗜熱糖苷酶0602的PCR擴(kuò)增圖；其中，箭頭指明目的基因的位置。圖2是重組質(zhì)粒pET-28b_0602的構(gòu)建過(guò)程圖；其中，2A是重組質(zhì)粒pET-28b-0602的構(gòu)建過(guò)程圖，2B是質(zhì)粒pET-28b_0602的結(jié)構(gòu)圖。圖3是重組質(zhì)粒pET-28b_0602PCR鑒定結(jié)果圖；其中，泳道1、2、3、4分別為I至4號(hào)克隆；M:DL 2K Plus。圖4是鑒定TN0602表達(dá)的SDS-PAGE分析圖；其中，泳道1-2是TN0602表達(dá)產(chǎn)物的上清液；泳道3是pET_28b表達(dá)產(chǎn)物的上清液；泳道4-5是TN0602表達(dá)產(chǎn)物的沉淀物；泳道6是pET_28b表達(dá)產(chǎn)物的沉淀物；泳道7_8是TN0602全表達(dá)產(chǎn)物；泳道9是pET-28b的全表達(dá)產(chǎn)物；箭頭指明目的蛋白的位置。圖5是不同誘導(dǎo)溫度下目的蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果；其中，泳道1-3分別是誘導(dǎo)溫度為25°C、30°C、37°C下的TN0602表達(dá)產(chǎn)物的上清液；泳道4-6分別是誘導(dǎo)溫度為25°C、30°C、37°C下的TN0602表達(dá)產(chǎn)物的沉淀物；泳道7_9分別是誘導(dǎo)溫度為25°C、30°C、37°C下的TN0602全表達(dá)產(chǎn)物；箭頭指明目的蛋白的位置。圖6是不同濃度IPTG誘導(dǎo)的目的蛋白的SDS-PAGE分析圖；其中，泳道1-5分別是IPTG濃度為0mM、0.2mM、0.4mM、0.7mM、l.0mM誘導(dǎo)下的TN0602表達(dá)產(chǎn)物的上清液；泳道6-9分別是IPTG濃度為0mM、0.2mM、0.4mM、0.7mM、l.0mM誘導(dǎo)下的TN0602表達(dá)產(chǎn)物的沉淀物；泳道10-15分別是是IPTG濃度為0mM、0.2mM、0.4mM、
0.7mM、l.0mM誘導(dǎo)下的TN0602全表達(dá)產(chǎn)物；箭頭指明目的蛋白的位置。圖7是目的粗菌液不同熱處理時(shí)間的SDS-PAGE分析圖；其中，泳道1、3、5、7、9 分別是熱處理時(shí)間為 2min、5min、10min、20min 的 TN0602表達(dá)產(chǎn)物的上清液；泳道2、4、6、8、10分別是熱處理時(shí)間為2min、5min、10min、20min的TN0602粗菌液沉淀物；箭頭指明目的蛋白的位置。圖8是純化的TN0602的SDS-PAGE分析圖；其中，泳道I是含有目的蛋白的粗溶菌液；泳道2是熱處理的粗溶菌液的上清液；泳道3是穿透液；泳道4、5、6、7、8、9、10是咪唑濃度分別為0、20mM、50mM、75mM、100mM、150mM、200mM的目的蛋白洗脫液；箭頭指明目的蛋白的位置。圖9是最適反應(yīng)溫度測(cè)定圖。圖10是最適PH測(cè)定圖；其中，圖1OA是對(duì)oNPG最適反應(yīng)PH的測(cè)定結(jié)果；圖1OB是對(duì)乳糖最適反應(yīng)PH的測(cè)定結(jié)果。圖11是TN0602在不同溫度下的熱穩(wěn)定性分析圖。圖12是TN0602的PH穩(wěn)定性分析圖。圖13 是 TN0602 的 Lineweaker-Burk 圖。圖14是以玉米桿為原料使用生物酶試劑法制造紙漿的工藝流程圖。圖15是以玉米桿為原料使用微生物發(fā)酵產(chǎn)生的生物本酶試劑制造紙漿的工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)，不應(yīng)理解為是對(duì)本發(fā)明的限制，所使用的實(shí)驗(yàn)設(shè)備和材料如無(wú)特殊說(shuō)明，均為普通市售。實(shí)施例1以農(nóng)作物和 樹(shù)葉作為造紙?jiān)蠞{的配比篩選
本實(shí)施例采用生物堿乙醇鈉，原料為玉米秸桿、小麥秸桿、香蕉樹(shù)葉，并進(jìn)行不同原料的配比實(shí)驗(yàn)。原料漿配比篩選的目的是為后續(xù)的酶法造紙進(jìn)行探索，減少造紙污染。具體配比方案分別如下表I至表4所示。玉米秸桿:小麥的配比從1:1到10:1 ;香蕉葉:魚(yú)骨樹(shù)葉從4:1到9:1 ;香蕉葉:玉米稻桿從1:1到5:1，香蕉葉:小麥從1:1到5:1o表1:兩種農(nóng)作物配比進(jìn)行生物酶法造紙實(shí)驗(yàn)
權(quán)利要求
1.一種直接利用分泌嗜熱糖苷酶的工程菌分解造紙漿的方法，包括以下步驟: O以農(nóng)作物秸桿為原料，粉碎，浸泡20-30小時(shí)形成原料漿； 2)構(gòu)建并擴(kuò)增分泌嗜熱糖苷酶的工程菌種子并經(jīng)一級(jí)和二級(jí)菌種培養(yǎng)，當(dāng)二級(jí)菌種液的OD值為0.4-0.8時(shí)，于25°C _37°C下用0.2-0.7mM的IPTG誘導(dǎo)嗜熱糖苷酶的表達(dá)； 3)將步驟2)所獲得的二級(jí)菌種液按體積比1:20-40加入到步驟I)的原料漿中，于室溫下處理漿液過(guò)夜； 4 )撈出漿料、煮沸、清洗、破碎，抄紙并烘烤成型。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分泌嗜熱糖苷酶的工程菌是轉(zhuǎn)染了表達(dá)質(zhì)粒pET-28b-0602的大腸桿菌，所述表達(dá)質(zhì)粒pET-28b_0602具有如圖2B所示的結(jié)構(gòu)。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述農(nóng)作物秸桿選自配比為1:1_10:1的玉米:小麥稻桿、4:1-9:1的香蕉葉:魚(yú)骨樹(shù)葉，I:1-5:1的香蕉葉:玉米稻桿、I:1-5:1的香蕉葉:小麥稻桿。
4.如權(quán)利要2所述的方法，其中所述分泌嗜熱糖苷酶的工程菌在分解造紙漿中的應(yīng)用。
5.一種分泌嗜熱糖苷酶的工程菌，所述工程菌是轉(zhuǎn)染了表達(dá)質(zhì)粒pET-28b-0602的大腸桿菌，所述表達(dá)質(zhì)粒p ET-28b-0602具有如圖2B所示的結(jié)構(gòu)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用分泌嗜熱糖苷酶的工程菌分解造紙漿的方法，包括以下步驟1)以農(nóng)作物秸稈為原料，粉碎，浸泡20-30小時(shí)形成原料漿；2)擴(kuò)增分泌嗜熱糖苷酶的工程菌種子并經(jīng)一級(jí)和二級(jí)菌種培養(yǎng)，當(dāng)?shù)诙N的OD值為0.4-0.8時(shí)，于25℃-37℃下用0.2-0.7mM的IPTG誘導(dǎo)嗜熱糖苷酶的表達(dá)；3)將步驟2)所獲得的二級(jí)菌種液按體積比120-40加入到步驟1)的原料漿中，于室溫下處理漿液過(guò)夜；4)撈出漿料、煮沸、清洗、破碎，抄紙并烘烤成型。本發(fā)明的分泌糖苷酶微生物分解造紙?jiān)蠞{的效果與常用的酶試劑相當(dāng)，而且成本大大降低。
文檔編號(hào)D21C5/00GK103215836SQ20131008422
公開(kāi)日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月15日
發(fā)明者王妍, 吳澤旋, 陳莫, 喇文軍, 李云, 高仁鈞, 解桂秋, 孔繁思, 程金 申請(qǐng)人:深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 深圳市孚沃德生物技術(shù)有限公司