一種用于抗菌鎮(zhèn)痛的中藥組合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種具有抗菌鎮(zhèn)痛作用的中藥組合物。該藥物組合由地骨皮純化活性部位及桑白皮純化活性部位按生藥量1∶1配比組成。該組合物所含活性成分為甜菜堿、東莨菪內(nèi)酯及桑根白皮素。采用HPLC法測(cè)定活性成分的含量，三者總含量大于80％。該中藥組合物的抗菌鎮(zhèn)痛效果顯著，明顯高于單味藥的作用。該組合物可用于防治細(xì)菌感染、各類疼痛及炎癥的藥物制劑中，也包括在牙膏、漱口水及口香糖等保健品中的使用。
【專利說(shuō)明】一種用于抗菌鎮(zhèn)痛的中藥組合物及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥組合物領(lǐng)域，涉及一種具有抗菌、鎮(zhèn)痛作用的中藥組合物，特別涉 及該組合物是由地骨皮純化活性部位與桑白皮純化活性部位配合而成。該組合物的活性成 分明確，成分總含量HPLC法測(cè)定大于80% ;抗菌鎮(zhèn)痛作用效果顯著高于單味藥。

【背景技術(shù)】
[0002] 地骨皮為爺科植物枸杞Lycium chinense Mill.或?qū)幭蔫坭絃ycium barbarum L.的干燥根皮。其性寒，味甘。歸肺、肝、腎經(jīng)。具有涼血除蒸，清肺降火的功效。用于治療 陰虛潮熱，骨蒸盜汗，肺熱咳嗽，咯血，衄血，內(nèi)熱消渴等癥。
[0003] 桑白皮為?？浦参锷orus alba L.的干燥根皮。其性平，味甘。歸肝經(jīng)。具有 祛風(fēng)濕，利關(guān)節(jié)的功效。用于治療風(fēng)濕痹病，肩臂、關(guān)節(jié)酸痛麻木等癥。
[0004] 文獻(xiàn)中對(duì)單味地骨皮及單味桑白皮的抗炎鎮(zhèn)痛作用有一些報(bào)道，但沒(méi)有兩者配合 用于此功效方面的研究，更無(wú)以兩者純化活性部位組合使用的記載。目前文獻(xiàn)報(bào)道的實(shí)驗(yàn) 內(nèi)容存在以下明顯缺陷：（1)均為簡(jiǎn)單粗糙提取物，例如水提取物或醇提取物等，技術(shù)含量 低；(2)所述提取物中的活性成分不明確，無(wú)準(zhǔn)確的指標(biāo)成分作為含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)：（3)療 效不顯著。這些不確定因素直接影響地骨皮及桑白皮提取物作為藥物的療效以及在制劑中 的應(yīng)用。
[0005] 鑒于以上原因，研制出一種療效顯著，活性成分明確，有效成分含量高的抗菌鎮(zhèn)痛 中藥組合物，在中藥新藥開(kāi)發(fā)中顯得尤其重要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于通過(guò)對(duì)地骨皮、桑白皮中化學(xué)成分的理 化性質(zhì)進(jìn)行研究，采用先進(jìn)的分離技術(shù)分別制備了地骨皮及桑白皮的純化活性部位，并將2 個(gè)活性部位按比例配伍形成一種中藥組合物。該組合物中主要活性成分為甜菜堿、東莨菪 內(nèi)酯及桑根白皮素，三者總含量達(dá)到80%。此中藥組合物的抗菌鎮(zhèn)痛作用顯著，可制成針對(duì) 各種適應(yīng)癥的藥物制劑，例如外用或內(nèi)服治療細(xì)菌感染、疼痛及相應(yīng)炎癥等，亦包括各類防 治口腔疾病的制劑和用品。
[0007] 為了達(dá)到本發(fā)明的目的，發(fā)明人進(jìn)行了大量試驗(yàn)研究，確定了如下技術(shù)方案：
[0008] 抗菌鎮(zhèn)痛中藥組合物的制備工藝，步驟為：1.地骨皮活性部位的制備：（1)取地骨 皮藥材適量，先用水提法提取得提取物；（2)將上述提取物采用HPD400型大孔樹(shù)脂分離，分 別收集水洗脫液及50%乙醇洗脫液，合并回收乙醇后得分離物；（3)分離物再通過(guò)超濾膜 純化，濃縮，干燥得地骨皮活性部位。
[0009] 2.桑白皮活性部位的制備：（1)取桑白皮藥材（不去棕色栓皮）適量，用70 %乙 醇提取2次；（2)將乙醇提取物經(jīng)過(guò)AB-8大孔樹(shù)脂、聚酰胺色譜柱分離，得純化物，干燥，得 到桑白皮活性部位。
[0010] 3.將地骨皮活性部位與桑白皮活性部位按生藥量（1 : 1)的比例配合組抗菌鎮(zhèn)痛 中藥組合物。 toon] 本發(fā)明得到的一種抗菌鎮(zhèn)痛中藥組合物，所含主要活性成分為甜菜堿、東茛菪內(nèi) 酯和桑根白皮素。采用HPLC法測(cè)定三者的含量，總含量大于80%。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明涉及的一種抗菌鎮(zhèn)痛中藥組合物具有如下優(yōu)點(diǎn)和顯著的 進(jìn)步：（1)該組合物由純化的地骨皮活性部位和桑白皮活性部位配比組成，非單一、粗糙的 提取物；（2)此組合物活性成分明確，主要為甜菜堿、東莨菪內(nèi)酯及桑根白皮素；（3)HPLC法 測(cè)定三種活性成分的含量，總含量達(dá)到80%以上，純度較高；（4)該組合物的抗菌鎮(zhèn)痛效果 顯著提高，均明顯高于單一地骨皮或桑白皮的作用。

【具體實(shí)施方式】
[0013] 以下為本發(fā)明涉及的抗菌鎮(zhèn)痛中藥組合物的具體制備實(shí)例，旨在對(duì)本發(fā)明的技術(shù) 方案作進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于這些實(shí)施例。凡與本發(fā)明思路類同的 改變或替代方法均包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0014] 實(shí)施例1抗菌鎮(zhèn)痛中藥組合物的制備
[0015] 1.取地骨皮l〇〇g，先用8倍量水煎煮提取1小時(shí)，過(guò)濾。藥渣再加6倍量水煎煮 提取0. 5小時(shí)，過(guò)濾，合并2次濾液，濃縮至100ml。
[0016] 2.將上述藥渣加6倍量80%乙醇回流提取1小時(shí)，過(guò)濾。藥渣再加4倍量80%乙 醇回流提取〇. 5小時(shí)，過(guò)濾。合并2次濾液，回收溶劑，濃縮至100ml。
[0017] 3.將上述水提及醇提液合并，上樣于HPD400型大孔樹(shù)脂上，先用6倍量水洗脫，收 集洗脫液；再依次用6倍量10%乙醇、30 %乙醇、50 %乙醇洗脫，收集50 %乙醇洗脫液，回收 乙醇，與水洗脫液合并，濃縮至l〇〇ml。
[0018] 4.把上述提取液經(jīng)過(guò)超濾膜（10000)純化，分離液濃縮干燥，得地骨皮活性部位。
[0019] 5.取桑白皮（未去栓皮）100g，用6倍量70%乙醇回流提取1小時(shí)，藥渣再加4倍 量70%乙醇回流提取1. 5小時(shí)。合并2次濾液，濃縮至100ml。
[0020] 6.將上述醇提物經(jīng)AB-8大孔樹(shù)脂分離，收集50%、70%乙醇洗脫部位，回收乙醇， 濃縮至l〇〇ml。
[0021] 7.將上述濃縮液上于聚酰胺（300g)色譜柱，收集6倍量70%乙醇洗脫液，回收濃 縮，干燥，得桑白皮活性部位。
[0022] 8.將上述地骨皮活性部位及桑白皮活性部位混合均勻，即得抗菌鎮(zhèn)痛中藥組合 物。用HPLC法測(cè)定組合物中活性成分甜菜堿、東莨菪內(nèi)酯和桑根白皮素含量，總含量大于 80%。
[0023] 實(shí)施例2抗菌鎮(zhèn)痛中藥組合物的制備
[0024] 1.取地骨皮500g，先用8倍量水煎煮提取1小時(shí)，過(guò)濾。藥渣再加6倍量水煎煮 提取0. 5小時(shí)，過(guò)濾，合并2次濾液，濃縮至500ml。
[0025] 2.將上述藥渣加6倍量80%乙醇回流提取1小時(shí)，過(guò)濾。藥渣再加4倍量80%乙 醇回流提取〇. 5小時(shí)，過(guò)濾。合并2次濾液，回收溶劑，濃縮至500ml。
[0026] 3.將上述水提及醇提液合并，上樣于HPD400型大孔樹(shù)脂上，先用6倍量水洗脫，收 集洗脫液；再依次用6倍量10%乙醇、30 %乙醇、50 %乙醇洗脫，收集50 %乙醇洗脫液，回收 乙醇，與水洗脫液合并，濃縮至500ml。
[0027] 4.把上述提取液經(jīng)過(guò)超濾膜（10000)純化，分離液濃縮干燥，得地骨皮活性部位。
[0028] 5.取桑白皮（未去栓皮）500g，用6倍量70%乙醇回流提取1小時(shí)，藥渣再加4倍 量70%乙醇回流提取1. 5小時(shí)。合并2次濾液，濃縮至500ml。
[0029] 6.將上述醇提物經(jīng)AB-8大孔樹(shù)脂分離，收集50%、70%乙醇洗脫部位，回收乙醇， 濃縮至500ml。
[0030] 7.將上述濃縮液上于聚酰胺（1500g)色譜柱，收集6倍量70%乙醇洗脫液，回收 濃縮，干燥，得桑白皮活性部位。
[0031] 8.將上述地骨皮活性部位及桑白皮活性部位混合均勻，即得抗菌鎮(zhèn)痛中藥組合 物。用HPLC法測(cè)定組合物中活性成分甜菜堿、東莨菪內(nèi)酯和桑根白皮素含量，總含量大于 80%。
[0032] 實(shí)驗(yàn)研究1.HPLC法測(cè)定中甜菜堿含量的含量
[0033] (1)色譜條件色譜柱Hypersil BDS C18柱（4· 6X 250mm，5 μ m)。流動(dòng)相為甲 醇-50mmolNaH2P04 (2 : 98, ρΗ4· 45)，柱溫 30°C，流速 0· 6ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng) 192nm，進(jìn)樣量 10 μ 1。
[0034] (2)對(duì)照品對(duì)照品溶液的配制稱取10. 79mg甜菜堿對(duì)照品，以水定容至10ml得 1. 079mg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液。取0. 1、0. 2、0. 4、0. 8、1. 6ml儲(chǔ)備液分別以水定容至2ml。得 濃度分別為 〇· 〇5395、0· 1079、0· 2158、0· 4316、0· 8632mg/ml。得回歸方程為：y = 4X 106x(r =0. 9994) 〇
[0035] (3)樣品溶液的制備取組合物約10mg，以水定溶于100ml容量瓶中，搖勻，過(guò) 0. 45 μ m微孔濾膜，進(jìn)樣10 μ 1測(cè)定。結(jié)果組合物中甜菜堿的含量為63. 28%。
[0036] 2. HPLC法測(cè)定地骨皮有效部位中東莨菪內(nèi)酯的含量
[0037] (1)色譜條件 DIKMA Spursil C18 色譜柱（4· 6Χ 250_，5 μ m),流動(dòng)相為甲 醇-0.2%磷酸水（1 : 1)，流速0.8ml/min，柱溫25°C，檢測(cè)波長(zhǎng)345nm，進(jìn)樣量10μ1。
[0038] (2)對(duì)照品溶液的制備精密稱取東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品2. 26mg，用甲醇溶解定容至 10ml，制成對(duì)照品儲(chǔ)備液，濃度為0. 226mg/ml。
[0039] (3)供試品溶液的制備精密稱取組合物適量，用甲醇溶解定容至4mg/ml，超聲溶 解，0. 45 μ m微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。
[0040] (4)線性關(guān)系考察精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液0· 05,0· 2,0· l，2ml置于10ml容量瓶 中，加甲醇至刻度，得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0. 45 μ m微孔濾膜過(guò)濾，分別進(jìn)樣10 μ 1。以標(biāo)準(zhǔn)溶 液濃度⑴為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（Υ)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得東莨菪內(nèi)酯回歸方程Υ = 52018X(r = 0. 9999) 〇
[0041] (5)樣品測(cè)定結(jié)果組合物中東莨菪內(nèi)酯的含量為8. 35%，而地骨皮藥材中東莨 菪內(nèi)酯含量?jī)H為〇. 0021%，含量得到大幅度提高。
[0042] 3. HPLC法測(cè)定組合物中桑根白皮素的含量
[0043] (1)色譜條件色譜柱Angelent C18(4. 6mmX 250mm，5 μ m)。流動(dòng)相為乙腈-水 (60 : 40)，柱溫 30°C，流速 l.Oml/min，檢測(cè)波長(zhǎng) 270nm，進(jìn)樣量 10μ1。
[0044] (2)對(duì)照品對(duì)照品溶液的配制取桑根白皮素對(duì)照品適量，用甲醇配制成0.5mg/ ml的對(duì)照品溶液。分別以甲醇制成含桑根白皮素0. 05,0. 1，0. 15,0. 2,0. 25,0. 5mg/ml的對(duì) 照品溶液按色譜條件測(cè)定，得回歸方程為y = 21. 5+2. 7X 103x(r = 0. 9997)。
[0045] (3)樣品溶液的制備取組合物約10mg，以水定溶于25ml容量瓶中，搖勻，過(guò) 0. 45 μ m微孔濾膜，進(jìn)樣10 μ 1測(cè)定。結(jié)果組合物中桑根白皮素的含量為11. 74%。
[0046] 3.組合物體外抗菌試驗(yàn)
[0047] 1.材料與方法
[0048] 1. 1實(shí)驗(yàn)細(xì)菌：選擇3種常見(jiàn)致病菌：變形鏈球菌（25175)、牙齦卟啉單胞菌 (33277)、金黃色葡萄球菌（25923)，中國(guó)藥品生物制品檢定所。
[0049] 1. 2采用經(jīng)典的瓊脂二倍稀釋法，測(cè)定檢測(cè)樣品對(duì)細(xì)菌的MIC5(I和MIC9(I。除金黃色 葡萄球菌選用MH瓊脂培養(yǎng)基、在有氧條件的普通孵育箱進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)18h外，另2種厭氧 菌選用BHI-S瓊脂培養(yǎng)基，在37°C、80% N2、20% C02厭氧孵育箱中培養(yǎng)48h。
[0050] 1.3樣品液的配制稱取組合物干粉10mg，用50%乙醇定容于10ml容量瓶中，即 為地骨皮樣品原液。將樣品原液用BHI-S液體培養(yǎng)基進(jìn)行二倍系列稀釋，稀釋倍數(shù)分別為 1 : 2、1 : 4、1 : 8、1 : 16、1 : 32、1 : 64、1 : 128,藥物濃度依次為 0.5、0.25、0.125、 0.0625、0.0313、0. 0156、0. 0078mg/mL。
[0051] 1. 4最低抑菌濃度MIC值的測(cè)定采用經(jīng)典的瓊脂稀釋法，按抗微生物藥物敏感性 試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程測(cè)定各試驗(yàn)藥物對(duì)試驗(yàn)菌株的最低抑菌濃度（MIC)。受試樣品稀釋至 所需最高濃度，保留2mL藥液，于無(wú)菌平皿內(nèi)加入lmL藥液，剩下的lmL藥液中加入lmL無(wú) 菌雙蒸水進(jìn)行對(duì)倍稀釋，如此方法可將藥液進(jìn)行系列二倍稀釋。無(wú)菌平皿中再加入融化的 50°C MH培養(yǎng)基14mL，混勻，待冷卻晾干后備用。用多點(diǎn)接種儀接種細(xì)菌，需氧菌的接種菌量 約為106CFU/mL，厭氧菌的接種菌量約為10 8CFU/mL，蓋上皿蓋。需氧菌置于37°C培養(yǎng)箱內(nèi) 培養(yǎng)24h，觀察記錄結(jié)果：厭氧菌置于20% C02環(huán)境，于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h，觀察記錄結(jié) 果。以平皿內(nèi)未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物最低濃度判為最低抑菌濃度（MIC值）。
[0052] 1. 5最低殺菌濃度（MBC)的測(cè)定經(jīng)體外抑菌試驗(yàn)得出藥物對(duì)各個(gè)菌株相應(yīng)MIC值 后，將MIC值以上濃度的藥液與試驗(yàn)菌株用上述相同方法再次進(jìn)行試驗(yàn)，培養(yǎng)后觀察，無(wú)細(xì) 菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為最低殺菌濃度。
[0053] 2.結(jié)果不同樣品對(duì)實(shí)驗(yàn)菌的抗菌活性，見(jiàn)下表1。
[0054] 表1中藥組合物對(duì)3種細(xì)菌的抗菌活性測(cè)定結(jié)果
[0055]

【權(quán)利要求】
1. 一種具有抗菌、鎮(zhèn)痛功效的中藥組合物，其特征在于：該組合物是由地骨皮純化活 性部位與桑白皮純化活性部位配合組成，重量份數(shù)配比按單味生藥量為（1 : 1)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種中藥組合物，其制備方法的特征在于：（1)取地骨皮藥材 適量，依次用水提法、醇提法得到提取物；提取物再用PHD400型大孔樹(shù)脂分離，分別收集水 洗脫液及50%乙醇洗脫液，合并，回收，濃縮，得分離物；分離物再經(jīng)超濾膜（10000)過(guò)濾純 化，濃縮，干燥得地骨皮活性部位。（2)取桑白皮藥材（未去栓皮）適量，用70%乙醇回流 提取得醇取物：將醇物先后用AB-8大孔樹(shù)脂、聚酰胺色譜柱分離純化，分別收集50%、70% 乙醇洗脫部份，回收溶劑，合并，濃縮干燥，得桑白皮活性部位。（3)將上述地骨皮活性部位 與桑白皮活性部位按生藥重量配比（1 : 1)混合均勻，即得抗菌鎮(zhèn)痛中藥組合物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所得的中藥組合物，經(jīng)HPLC法檢測(cè)，主含活性成分甜菜堿、東茛菪內(nèi) 酯及桑根白皮素，三者總含量大于80 %。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種中藥組合物，其特征是，該組合物可抑制和殺滅常見(jiàn)細(xì) 菌，并具有顯著的鎮(zhèn)痛作用，效果明顯高于單味藥。該組合物可應(yīng)用于防治細(xì)菌感染、各類 疼痛及炎癥的藥物制劑中，也包括在牙膏、漱口水及口香糖等保健用品中的使用。
【文檔編號(hào)】A61Q11/00GK104147240SQ201410333115
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月10日
【發(fā)明者】皮文霞, 李祥, 邱蓉麗, 周盈 申請(qǐng)人:南京中醫(yī)藥大學(xué)