酶體系的制作方法
【專利摘要】酶促織物處理組合物，其包含以下的組合：（i）一種或多種嗜冷酶，以及（ii）一種或多種嗜溫酶和/或一種或多種嗜熱酶。
【專利說明】酶體系
[0001]本發(fā)明涉及酶在洗滌過程中的遞送。
[0002]在洗衣(laundering)過程中使用酶混合物是已知的。
[0003]本發(fā)明的目的是提供改善的洗滌/去污方法，其涉及用于具有可變的不受控制的溫度的洗滌液的酶。
[0004]本發(fā)明的第一方面提供了酶促織物處理組合物，其包含以下物質(zhì)的組合:
[0005]1.一種或多種嗜冷酶(psychrophilic enzyme),以及
[0006]2.一種或多種嗜溫酶(mesophilic enzyme)和/或一種或多種嗜熱酶(thermophilic enzyme)。
[0007]本發(fā)明的第二方面提供了使用根據(jù)所述第一方面的酶促織物處理組合物處理織物的方法，其中洗漆液的溫度在整個(gè)單洗漆循環(huán)過程中在低溫(Psychrophi I i C )和中溫(mesophilic)以及任選的高溫(thermophilic)之間變化。
[0008]本文中所用的術(shù)語“單洗滌循環(huán)”意指單個(gè)洗滌過程，其包括一個(gè)或多個(gè)水洗滌階段和一個(gè)或多個(gè)水漂洗階段。所述循環(huán)在最終漂洗之后結(jié)束，然后織物準(zhǔn)備進(jìn)行干燥和再使用。所述循環(huán)可包括預(yù)處理階段。
[0009]優(yōu)選地，所述溫度在整個(gè)單洗滌循環(huán)過程中在低溫、中溫和高溫之間變化。
[0010]在洗滌液的溫度在至少一部分中不受使用者控制的情況下，本發(fā)明高度有利。優(yōu)選地，所述洗滌液溫度很大量地不受控制，并且更優(yōu)選不受控制到溫度完全受環(huán)境條件驅(qū)動(dòng)的程度。所述方法可以包括手洗處理或在洗滌機(jī)中進(jìn)行，所述洗滌機(jī)優(yōu)選沒有任何水加熱。
[0011]采用本發(fā)明，變化的以及不受(使用者)控制的洗滌液溫度的組合問題均在酶性能的方面得以解決。洗滌液溫度常常既是變化的又是不受控制的。所述溫度的變化可能發(fā)生在單洗滌過程中或整個(gè)連續(xù)洗滌過程中。例如，在溫暖的氣候中，對于手洗而言，洗滌水可由通過地下管道供水的水龍頭取得，并且洗滌過程可在低溫度(5至15°C)下開始然后在較溫暖的環(huán)境條件下升溫至20°C、30°C、4(TC或更高的溫度。變化的氣候條件是指環(huán)境溫度至少季節(jié)性地變化。采用本發(fā)明，這些問題通過提供在不同的溫度區(qū)域中提供期望的功能的酶的組合而得以解決。甚至采用自動(dòng)洗滌機(jī)，洗滌液的溫度也可能在一個(gè)洗衣產(chǎn)品的整個(gè)使用期間發(fā)生變化。
[0012]本文中所用的術(shù)語“嗜冷酶”意指在O至25°C的溫度下有效的酶。
[0013]本文中所用的術(shù)語“嗜溫酶”意指在25至50°C的溫度下有效的酶。
[0014]本文中所用的術(shù)語“嗜熱酶”意指在50至90°C的溫度下有效的酶。
[0015]本文中所用的術(shù)語“有效”意指酶(在給定的溫度區(qū)域中)能夠?qū)崿F(xiàn)去污的能力或催化能力。
[0016]本文中所用的術(shù)語“酶”包括酶變體(例如通過重組技術(shù)制備的)。這樣的酶變體的實(shí)例公開于例如 EP251, 446 (Genencor)、W091/00345 (Novo Nordisk)、EP525, 610 (Solvay)以及 W094/02618 (Gist-Brocades NV)中。
[0017]優(yōu)選地,去污按緩解(Remission)單位或緩解指數(shù)進(jìn)行度量。有效去污優(yōu)選通過等于或大于2個(gè)緩解單位的緩解來表示。
[0018]本文在酶促織物處理組合物的情況中所用的術(shù)語“處理”優(yōu)選意指清洗且更優(yōu)選意指去污。
[0019]酶可來自細(xì)菌或真菌來源。包括化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程突變體。
[0020]優(yōu)選，所述一種或多種嗜冷酶和/或一種或多種嗜溫酶和/或一種或多種嗜熱酶包含共同類別的酶。這具有在不同溫度下解決特定類型污潰的優(yōu)勢。在這種情況下，優(yōu)選所述共同類別為蛋白酶或脂肪酶或糖基水解酶或裂解酶或氧化還原酶。
[0021]可替換地，本發(fā)明可包括混合類別的酶。優(yōu)選地，這包含嗜冷酶和嗜溫酶。該組合的優(yōu)勢在于過程以低溫開始的洗滌，其中脂肪酶有效但是此時(shí)抑制了蛋白酶攻擊所述脂肪酶。
[0022]嗜冷酶
[0023]優(yōu)選地，所述一種或多種嗜冷酶包含酯酶(酯水解酶)且更優(yōu)選地包含羧酸酯水解酶，更優(yōu)選包含例如脂肪酶和/或磷脂酶。
[0024]脂肪酶為高度有利的嗜冷酶，因?yàn)橹竞陀突蹪⒃诘蜏叵赂y以去除。出于大體相同的原因，磷脂酶對于低溫而言也是有利的。
[0025]有利地，可替換地或額外地，所述一種或多種嗜冷酶包含糖基水解酶(糖基化酶)，例如纖維素酶、淀粉酶 (包括α-淀粉酶)、木聚糖酶等。
[0026]嗜冷脂肪酶包括來自以下的脂肪酶:不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter sp.)第6號(hào)菌株(Suzuki 等(2001) J.Biosc1.Bioeng.92:144 - 148;不動(dòng)桿菌屬第 016 號(hào)菌株(Brueuil和 Kushner，(1975)Can.J.Microbiol.21:423-433;解脂無色桿菌(Achromobacterlipolyticum) (Khan 等，(1967), Biochem.Biophys.Acta.132:68-771967)、氣單胞菌屬(Aeromonas sp.)第 LPB4 號(hào)菌株(Lee 等(2003)，J.Microbiol.41:22-27、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila) (Pemberton 等(1997)FEMS Microbiol.Lett.152:1-10);球形芽抱桿菌(Bacillus sphaericus) MTCC7526 (Joseph.PhD Thesis (2006)Allahabad Agricultural Institute, Allahabdj IN);葉球形微桿菌(Microbacteriumphyllosphaerae) MTCC7530、莫拉氏菌屬(Moraxell sp.) (Feller 等(1990)FEMSMicrobiol.Lett.66:239-244;莫拉氏菌 M (Moraxella sp) TA144 (Feller 等(1991)Gene.102:111-115;解脂發(fā)光桿菌(Photobacterium lipolyticum) M37 (Ryu 等(2006)App1.Microbiol.Biotechnol.70:321 - 326);假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas sp.)Wp27 (Zeng 等(2004) J.Microbiol.Biotechnol.14:952-958);假交替單胞菌屬(Giudice等(2006)J.Applied MicrobiologylOl:1039-1048、南極嗜冷菌 M(Pscychrobactersp.)和弧菌 M (Vibrio sp.);南極嗜冷菌屬 Wp37 (Zeng 等(2004) J.Microbiol.Biotechnol.14:952-958);鄂霍次克海嗜冷桿菌屬(Psychrobacter okhotskensissp.) (Yumoto 等(2003) Int.J.Syst.Evol.Microbiol.53:1985 - 1989);南極嗜冷菌屬 Ant300 (Kulakovaa 等(2004)Biochemica.Biophysica.Acta.1696:59-65);不動(dòng)嗜冷桿菌(Psychrobacter immobilis)菌株 BlO(Arpigny 等(1997)J.Mol.Catal.B Enzy.3:29-35.)、粘質(zhì)沙雷氏桿菌(Serratia marcescens) (Abdouj (2003) J.DairySc1.86:127 - 132、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) (Alford 和 Pierce，(1961)J.Food Sc1.26:518-524)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis) (Joseph 等(2006)J.Gen.App1.Microbiol.52:315-320)。
[0027]嗜冷酯酶優(yōu)選包括Jeon等在Mar Biotechnol (2009) 11:307 - 316中描述的酯酶EstATl 和 EstATlI。
[0028]嗜冷糖基水解酶優(yōu)選包括糖苷酶，例如淀粉酶，例如來自游海假交替單胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)菌株 TAC125、來自河膝毒素交替單胞菌(Alteromonashaloplanktis) A23 (Feller 等(1998)Journal Biological Chemistry Vol273, N0.20第12109-12115頁)以及來自擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis sp.) 7326的α-淀粉酶；纖維素酶和木聚糖酶，來自例如梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium sp.) PXYLl (G.Akila, T.S.Chandra(2003)FEMS Microbiol.Letters219, 63-67)的。嗜冷木聚糖酶包括大腸桿菌(E.coli)嗤菌粒(Lee 等 2006b)。
[0029]優(yōu)選的嗜冷蛋白酶包括源自大比目魚黃桿菌(Flavobacterium balustinum)P104(分離自鮭魚的內(nèi)臟，并且已在1995年2月17日保藏于國家生物科學(xué)和人類
技術(shù)研究所-工業(yè)科學(xué)技術(shù)代理處(National Institute of Bioscience and
Human-Techno1gy, Agency of Industrial Science and Technology),其保藏號(hào)為FERM BP-5006,且記載于W0/1996/025489中)以及源自球形節(jié)桿菌(Arthrobacterglobiformis) S155 (Poitier 等，(1995) J.Gen.Microbiol.133:2797-2806)的那些。
[0030]嗜冷裂解酶優(yōu)選包括果膠裂解酶，例如來自游海假交替單胞菌菌株ANT/505 (Truong 等(20 01)Extremophiles5:35-44)的。
[0031]嗜溫酶
[0032]優(yōu)選地，所述一種或多種嗜溫酶包括蛋白酶和/或糖苷酶和/或果膠裂解酶。
[0033]優(yōu)選的嗜溫蛋白酶包括絲氨酸蛋白酶或金屬基蛋白酶，優(yōu)選地，堿性微生物蛋白酶或類胰蛋白酶的蛋白胰(trypsin-like protease)。堿性蛋白酶包括枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)，尤其是源自芽孢桿菌屬(Bacillus)的那些，例如枯草桿菌蛋白酶Novo(subtilisin Novo)、枯草桿菌蛋白酶 Carlsberg (subtilisin Carlsberg)、枯草桿菌蛋白酶309 (subtilisin309)、枯草桿菌蛋白酶147 (subtilisinl47)和枯草桿菌蛋白酶168(subtilisinl68)0所述類胰蛋白酶(即能夠裂解在賴氨酸或精氨酸的C-末端側(cè)處的肽鍵。)這樣的蛋白酶可以來源于豬或牛。還包括源自鐮刀菌(Fusarium)的胰蛋白酶。
[0034]市售可得的蛋白酶包括AlcalaseTM、SavinaseTM、PrimaseTM、DuralaseTM、Dyrazym?、Esperase?、Everlase?、Polarzyme? 以及 Kannase?, (Novozymes A/S)，Maxatase?、Maxacal?> Maxapem?> Properase?, Puraf ect?> Purafect 0xP?> FN2? 和 FN3? (GenencorInternational Inc.)。
[0035]優(yōu)選的嗜溫脂肪酶包括來自腐質(zhì)霉屬(Humicola)(也稱嗜熱真菌屬(Thermomyces))的脂肪酶，例如來自梳棉狀腐質(zhì)霉(H.lanuginosa (T.1anuginosus))或來自特異腐質(zhì)霉(H.1nsolens);假單胞菌屬(Pseudomonas)脂肪酶，例如來自產(chǎn)堿假單胞菌(P.alcaligenes)或類產(chǎn)堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)、洋蔥假單胞菌(P.cepacia)、斯氏假單胞菌(P.stutzeri)、突光假單胞菌(P.fluorescens)、假單胞菌屬菌株 SD705 (W095/06720 和 W096/27002)、威斯康星假單胞菌(P.wisconsinensis);芽孢桿菌屬脂肪酶，例如來自枯草芽孢桿菌(B.subtilis) (Dartois等(1993), Biochemica etBiophysica Acta, 1131, 253-360)、嗜熱芽抱桿菌(B.stearothermophiIus) (JP64/744992)或短小芽孢桿菌(B.pumilus) (W091/16422)。
[0036]市售可得的嗜溫脂肪酶包括Lipolase? 和 Lipolase Ultra?、Lipex?(NovozymesA/S)。
[0037]優(yōu)選的嗜溫磷脂酶(EC3.1.1.4和/或EC3.1.1.32)包括水解磷脂的酶。包括水解一個(gè)脂肪?；?分別在sn-Ι和sn-2位)以形成溶血磷脂的磷脂酶A1和A2 ;和可以水解溶血磷脂中剩余的脂肪?；娜苎字?或磷脂酶B);而且還包括磷脂酶C和磷脂酶D (磷酸二酯酶)，其分別釋放二?；视突蛄字?。
[0038]本文所用的與本發(fā)明的酶有關(guān)的術(shù)語“磷脂酶A”意為涵蓋具有磷脂酶A1和/或磷脂酶A2活性的酶。磷脂酶活性也可以通過還具有其他活性的酶(例如具有磷脂酶活性的脂肪酶)提供。
[0039]所述嗜溫磷脂酶可以是任何來源的，例如動(dòng)物源(例如哺乳動(dòng)物)、例如來源于胰腺(例如?；蛘哓i胰腺)、或者蛇毒或蜂毒。優(yōu)選地，磷脂酶可以是微生物源的，例如源自絲狀真菌、酵母或細(xì)菌、例如曲霉屬或種，例如黑曲霉；網(wǎng)柄菌屬(Dictyostelium),例如盤基網(wǎng)柄菌(D.discoideum);毛霉屬(Mucor),例如爪睡毛霉(M.javanicus)、大毛霉(M.mucedo)、細(xì)孢毛霉(M.subtilissimus);脈孢菌屬(Neurospora),例如粗糙脈孢菌(N.crassa);根毛霉屬(Rhizomucor),例如微小根毛霉(R.pusillus)；根霉菌屬(Rhizopus),例如少根根霉(R.arrhizus)、例日本根霉(R.japonicus)、匍枝根霉(R.stolonifer);核盤菌屬(Sclerotinia)，例如大豆核盤菌(S.1ibertiana)；毛蘚菌屬(Trichophyton),例如紅色毛蘚菌(T.rubrum);維氏核盤菌屬(Whetzelinia),例如W.scIerotiorum ;芽孢桿菌屬，例如巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌；梓檬酸桿菌屬(Citrobacter),例如弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii);腸桿菌屬(Enterobacter),例如產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)或陰溝腸桿菌(E.cloacae);愛德華氏菌屬(Edwardsiella),遲鈍愛德華氏菌(E.tarda);歐文氏菌屬(Erwinia),例如草生歐文氏菌(E.herbicola)；埃希氏菌屬(Escherichia),例如大腸桿菌；克雷伯氏菌屬，例如肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae);變形菌屬(Proteus),例如普通變形菌(P.vulgaris);普羅威登斯菌屬(Providencia),例如斯氏普羅威登斯菌(P.stuartii);沙門氏菌屬，例如鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium);沙雷氏菌屬(Serratia),例如液化沙雷氏菌(S.1iquefasciens)、粘質(zhì)沙雷氏菌(S.marcescens);志賀氏菌屬(Shigella),例如弗氏志賀氏菌(S.f Iexneri);鏈霉菌屬，例如紫紅鏈霉菌(S.violeceoruber);或耶爾森氏菌屬,例如小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Y.enterocolitica)。因此磷脂酶可以源于例如真菌類,例如核菌(Pyrenomycetes)類，如鐮孢屬(genus Fusarium),例如大刀鐮孢(F.culmorum)、異孢鐮孢(F.heterosporum)、腐皮鐮孢(F.solani)的菌株，或尖鐮孢(F.0xysporum)的菌株。磷脂酶還可以來自曲霉屬內(nèi)的絲狀真菌菌株，例如泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、黑曲霉或米曲霉(Aspergillu oryzae)的菌株。
[0040]優(yōu)選的嗜溫磷脂酶是源自腐質(zhì)霉屬的菌株，尤其是疏棉狀腐質(zhì)霉菌株或變體；以及是源自鐮刀菌的菌株， 尤其是尖鐮孢的菌株。磷脂酶可以是源自尖鐮孢DSM2672的。
[0041]優(yōu)選地，嗜溫磷脂酶包括磷脂酶A1 (EC.3.1.1.32)或磷脂酶A2 (EC.3.1.1.4)。
[0042]市售嗜溫磷脂酶的實(shí)例包括LECITASE? 和 LECITASE?ULTRA, YIELSMAX 或 LIP0PANF (可購自 Novozymes A/S,丹麥)。
[0043]優(yōu)選的嗜溫角質(zhì)酶(EC3.1.1.74.)是源自曲霉屬的菌株，尤其是米曲霉(Aspergillus oryzae);鏈格孢菌株，特別是甘藍(lán)鏈格孢菌(Alternaria brassiciola)；鐮孢菌屬(Fusarium)菌株，特別是爺病鐮孢菌(Fusarium solani)、豌豆根腐鐮孢菌(Fusarium solani pisi)、大刀粉紅鍵抱菌(Fusarium roseum cuImorum)或接骨木粉紅鍵抱菌(Fusarium roseum sambucium);長螺抱屬(Helminthosporum)菌株，特別是麥根腐長螺孢菌(Helminthosporum sativum);腐質(zhì)霉屬菌株,特別是特異腐質(zhì)霉；假單胞菌屬菌株，特別是門多薩假單胞菌(Pseudomonas mendocina),或惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida);絲核菌屬(Rhizoctonia)菌株,特別是立枯絲核菌(Rhizoctonia solani);鏈霉菌屬(Streptomyces)菌株,特別是擠瘡病鏈霉菌(Streptomyces scabies);或細(xì)基格孢屬(Ulocladium)菌株,特別是群生細(xì)基格孢(Ulocladium consortiale)。最優(yōu)選地,角質(zhì)酶源自特異腐質(zhì)霉菌株，特別是特異腐質(zhì)霉DSM1800菌株。
[0044]市售的角質(zhì)酶包括N0V0ZYM?51032 (可購自Novozymes A/S,丹麥)。
[0045]優(yōu)選的嗜溫淀粉酶U和/或β)包括例如獲自芽孢桿菌屬(例如地衣芽孢桿菌(B.1icheniformis)的菌株 NCIB8059、ATCC6634、ATCC6598、ATCCl 1945、ATCC8480、ATCC9945a ;或者芽孢桿菌菌株DSMl2649 (AA560 α -淀粉酶)或芽孢桿菌屬DSMl2648 (ΑΑ349 α -淀粉酶))的α -淀粉酶。
[0046]市售可得的嗜溫淀粉酶有Duramyl?、Termamy 1?> Termamyl Ultra?、Natalase?、Stainzyme?、FungamyI? 和 BAN?(Novozymes A/S), Rapidase? 和 Purastar?(可購自Genencor International Inc.)。
[0047]優(yōu)選的嗜溫纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鐮刀霉屬、梭孢殼屬(Thielavia)、枝頂孢屬(Acremonium)的纖維素酶,例如，由特異腐質(zhì)霉、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)和尖抱鍵刀菌(Fusarium oxysporum)所產(chǎn)生的真菌纖維素酶。
[0048]尤其優(yōu)選的嗜溫纖維素酶為具有護(hù)色(color care)益處的堿性或中性纖維素酶。市售可得的纖維素酶包括 CelluzymeTM、CarezymeTM、EndolaseTM、RenozymeTM (Novozymes A/S)、Clazinase? 和 Puradax HA?(Genencor International Inc.),以及 KAC-500 (B) ?(KaoCorporation)。
[0049]優(yōu)選的嗜溫果膠酸裂解酶包括源自以下或由以下克隆得到的果膠酸裂解酶:細(xì)菌屬例如歐文氏菌屬、假單胞菌屬、克雷伯氏菌屬和黃單胞菌屬、以及枯草芽孢桿菌(Nasser 等，(1993) FEBS Letts.335:319-326)和芽孢桿菌屬 YA-14 (Kim 等，(1994) Biosc1.Biotech.Biochem.58:947-949)；短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus) (Dave 和 Vaughn,(1971)，J.Bacteriol.108:166-174)、多粘芽抱桿菌(B.Polymyxa) (Nagel 和 Vaughn,(1961)，Arch.Biochem.Biophys.93:344-352)、嗜熱芽抱桿菌(B.stearothermophilus)(Karbassi 和 Vaughn, (1980), Can.J.Microbiol.26:377-384)、芽抱桿菌屬(Hasegawa 和Nagel, (1966)，J.Food Sc1.31:838-845)和芽孢桿菌 RK9 (Kelly 和 Fogarty，(1978), Can.J.Microbiol.24:1164-1172)?？梢允褂梅嵌r(jià)陽離子依賴型的和/或熱穩(wěn)定的果膠裂解酶。
[0050]市售可得堿性嗜溫果膠酸裂解酶的實(shí)例包括可購自Novozymes A/S，丹麥的BIOPREP? SC0URZYME?Lo
[0051]優(yōu)選的嗜溫甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)包括源自以下的甘露聚糖酶:曲霉屬絲狀真菌屬(filamentous fungus genus Aspergillus)菌株，優(yōu)選黑曲霉(Aspergillusniger)或棘抱曲霉(Aspergillus aculeatus)或里氏木霉(Trichoderma reesei);或芽孢桿菌微生物FERM P-8856，其產(chǎn)生β -甘露聚糖酶和β -甘露糖苷酶；或嗜堿芽孢桿菌AM-OOl ;或解淀粉芽孢桿菌。所述甘露聚糖酶可包含源自Bacillus agaradhaeren、地衣芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、芽孢桿菌屬、和特異腐質(zhì)霉的堿性5和26族的甘露聚糖酶。[0052]市售可得甘露聚糖酶的實(shí)例包括可購自Novozymes A/S,丹麥的Mannaway?。
[0053]優(yōu)選的嗜溫過氧化物酶/氧化酶包括源自鬼傘屬(Coprinus)，例如灰蓋鬼傘(C.cinereus)的過氧化物酶及其變體。市售可得的過氧化物酶包括Guardzyme?和Novozym?(Novozymes A/S)。
[0054]嗜熱酶
[0055]嗜熱蛋白酶包括源自嗜i芽孢桿菌屬菌株HS08 (African Journal ofBiotechnology Vol.5(24),第2433-2438頁，2006年12月18日)和嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.Stearothermophilius) 1503; Thermos caldophilus GK24;水生棲熱菌(Τ.Aquaticus)Τ351;水生棲熱菌YTlAq.1和Aq.1I的蛋白酶。
[0056]嗜熱脂肪酶包括源自嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus thermocatenulatus) BTLl的那些以及優(yōu)選源自 BTL2 (Schimdt-Dannert 等,Biochim.Biophys.Acta(1994) 1214,第43-5 頁和 Biochim.Biophys.Acta (1996) 1301，第 105 - 114 頁)的那些。
[0057]嗜糖基水解酶包括源自嗜熱鏈狀芽孢桿菌Donk，菌株BS_1 (JournalBiochemistry, Vol67, 1:65-75)以及源自芽抱桿菌屬 ANT-6(ProcessBiochemistry(May2003)Vol38, 10:1397-1403)的 α-淀粉酶。嗜益裂解酶包括源自意大利嗜熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacter italicus sp.) nov.菌株 Ab9 (Kozianowski等，(1997)Extremophiles Voll, 4:171-182)的果膠裂解酶。
[0058]一旦根據(jù)本發(fā)明選定各個(gè)合適的酶，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言分離能夠生產(chǎn)該酶的合適微生物以及實(shí)施本領(lǐng)域中已知的用于制備在例如粉末或液體組合物中以及/或者在某些洗滌條件下等具有所需穩(wěn)定性/性能的酶的優(yōu)化步驟是相對容易的。
[0059]織物處理組合物可以包括洗衣/織物清潔/護(hù)理組合物并且可以包含一種或多種表面活性劑和/或任選的其它成分。
[0060]本發(fā)明的這種組合物可以是干燥固體形式，例如粉末化、顆粒、或者片狀粉末或者液體或者凝膠形式。其也可以是固體清潔劑棒的形式。所述組合物可以是濃縮物，其在使用前被稀釋、再水合和/或溶解在溶劑(包括水)中。所述組合物也可以是即用(使用中的)組合物。
[0061 ] 本發(fā)明適合用于工業(yè)或家用織物洗滌組合物、織物調(diào)理組合物以及用于洗滌織物和調(diào)理織物的組合物(所謂的通過洗滌調(diào)理劑組合物)中。本發(fā)明也可以被應(yīng)用于工業(yè)或家用非洗滌劑基織物護(hù)理組合物，例如直接施用例如滾抹(roll-on)或噴涂組合物，所述組合物可以用作例如在“主”洗之前預(yù)處理織物的局部。
[0062]酶可以以組合物的0-5重量％、優(yōu)選2-4重量％且最優(yōu)選2.5-3.5重量％(其中重量％意指組合物總重量的百分比)存在。
[0063]洗滌液中(本發(fā)明的酶的總范圍的)總蛋白質(zhì)濃度優(yōu)選為0.01至10.0mg/L并更優(yōu)選為2至5mg/L。
[0064]組合物的總蛋白質(zhì)濃度和重量％將分別包含各個(gè)水平的嗜冷酶/嗜溫酶以及任選的嗜熱酶；并且在該組合之內(nèi)，所述水平可以低于例如各個(gè)酶單獨(dú)使用時(shí)所用水平的一半。這是可能的，因?yàn)閷?shí)現(xiàn)了在一個(gè)溫度下，高峰值可能似乎在那個(gè)溫度范圍中提供了很大的有效性的同時(shí)，而在其中溫度不受控制的洗滌過程中在該范圍之外存在極小或者沒有活性。采用本發(fā)明，其是在實(shí)現(xiàn)有效性的實(shí)際洗滌的整個(gè)不受控制的溫度范圍內(nèi)具有有效性的酶和這種低于(例如一半的)各自水平的組合，這意味著可以提供溫度敏感的酶促性能組合物且同時(shí)將該組合物的成本維持在合理水平(因?yàn)榭偟拿负繘]有更高且甚至可能較低)。
[0065]酶可以是唯一的織物處理劑，或者也可以并入其它去污劑。
[0066]可以包括的其它洗滌劑成分包括表面活性劑、助洗劑(builder)、螯合劑、水溶助劑、防腐劑、絡(luò)合劑、聚合物、穩(wěn)定劑、香料、熒光增白劑，或者其它成分例如織物調(diào)理劑(包括粘土、泡沫促進(jìn)劑、抑泡劑(消泡劑)、防腐蝕劑、污物懸浮劑、抗污潰再沉積劑、抗微生物劑、污點(diǎn)抑制劑(tarnish inhibitor),以及其一種或兩種的組合,前提是這些成分與所述酶相容。
[0067]織物洗滌組合物可以包含織物洗滌劑材料，其選自非皂陰離子表面活性劑、非離子表面活性劑、皂、兩性 表面活性劑和兩性離子表面活性劑和其混合物。表面活性劑在組合物中的存在水平可以為0.1重量％至60重量％。
[0068]存在于組合物中的任何酶可以采用常規(guī)的穩(wěn)定劑進(jìn)行穩(wěn)定，例如多元醇(例如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物例如芳香族硼酸酯或苯基硼酸衍生物(例如4-甲?；交鹚?。
_9] 本發(fā)明的非限制性實(shí)施方案的實(shí)施例
[0070]現(xiàn)將參照以下附圖對本發(fā)明的各種非限制性實(shí)施方案作更具體的描述，其中:
[0071]附圖1-3分別對應(yīng)于表l_3a、b,并顯示了酶AHA和Stainzyme單獨(dú)使用以及兩者一起使用在各種條件下的有效性數(shù)據(jù)。
[0072]克隆、制備以及純化(來自游海假交替單胞菌菌株TAB23的)嗜冷淀粉酶的示例性方法:
[0073]克隆來自公眾可獲得的基因序列數(shù)據(jù)庫的嗜冷酶的方法
[0074]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，從經(jīng)同行評議的文獻(xiàn)中確定α淀粉酶(以下稱為AHA)具有期望的嗜低溫特性(Feller, G.等，1992; J.Biol.Chem.267 (8)，5217-5221)。從公眾可獲得的數(shù)據(jù)庫(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/2467084)(圖1)獲取包含所述淀粉酶的基因序列(GenBank登錄號(hào):X58627.1)，并將其經(jīng)由電腦模擬(in siIico)進(jìn)行修飾以使其能夠以利于重組蛋白的表達(dá)的方式并入大腸桿菌相容性質(zhì)粒載體PUC19。圖2示出了用于在大腸桿菌中制備蛋白質(zhì)的經(jīng)修飾的序列，圖3為一旦并入pUC19載體時(shí)的AHA的序列。作為Eurogentec Ltd (Southampton, UK)的服務(wù),采用他們自身專有的方法化學(xué)合成了圖2中所示的序列并將其插入到pUC19質(zhì)粒(圖3中所示的)。
[0075]制備嗜冷α -淀粉酶AHA的方法[0076]將IOng含AHA-編碼DNA的pUC19質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入化學(xué)活性的大腸桿菌菌株HB101，平鋪到含100 μ g/ml羧節(jié)青霉素(carbenicillin)的LB瓊脂上,于37°C下培育過夜。然后將單個(gè)菌落用于接種(2L搖瓶中)含100 μ g/ml羧芐青霉素的體積為0.5L的LB培養(yǎng)基。將瓶在定軌搖床上于18°C以120rpm孵化24-36小時(shí)，此時(shí)將細(xì)胞從培養(yǎng)基中分離出來(離心，10，OOOg, 15分鐘，4°C )。將含重組AM的培養(yǎng)基在4°C儲(chǔ)存直到需要時(shí)。
[0077]淀粉酶的組成性生產(chǎn)采用通過Roche Diagnostics以試劑盒(產(chǎn)品目錄編號(hào)11876473316)形式供應(yīng)的試劑在96-孔微量滴定板中如下進(jìn)行證實(shí):將10 μ I的待評價(jià)的各試樣(或其稀釋物)加入到所述微量滴定板的孔中(一式兩份)。加入75 μ I試劑1，接著加入15 μ I試劑2。測試空白包含所述添加物，含AHA的生長培養(yǎng)基用未經(jīng)使用的LB代替。將板在指定溫度(通常為20°C)下孵化30分鐘，然后在吸光度檢測設(shè)定為405nm處的FluoStar Optima酶標(biāo)儀上評價(jià)硝基苯酹的釋放(由于淀粉酶活性)。
[0078]純化重組AHA的方法
[0079]將一次的1-2L含AHA的LB生長培養(yǎng)基首先用無菌蒸餾水以1:2的比例進(jìn)行稀釋，然后將其使用以下方式濃縮到300ml至500ml之間:使用采用標(biāo)稱截留分子量為30，000道爾頓的再生纖維素過濾器裝置的切向錯(cuò)流過濾。然后將(含AHA的)濃縮LB通過以下方式進(jìn)行純化:通過離子交換色譜(使用100ml的Macro-Prep High Q離子交換載體-BioRad),接著通過采用1.5cm x60cm S200色譜柱(GE Healthcare)進(jìn)行凝膠過濾。使用上述淀粉酶測試確定含AHA的級(jí)分，并通過SDS-PAGE分析使用考馬斯法蛋白污潰(Imperial stain -ThermoPierce)評價(jià)蛋白質(zhì)在預(yù)期的49000道爾頓的存在(及其純度)。
[0080]酶鉬合A、 B、C、D、E 如下。
[0081]在各組合A-D中，所述組合包含一種或多種嗜冷酶以及嗜溫酶和/或嗜熱酶。
[0082]在以下鉬合物中測試酶有效件
[0083]示例說明提高α-淀粉酶組合物溶液在寬的溫度范圍中的催化活性的方法，其中所述溫度范圍包括低溫、中溫和高溫(如本文中所限定的術(shù)語)。
[0084]采用由Roche Diagnostics以試劑盒(產(chǎn)品目錄編號(hào)11876473316)形式供應(yīng)的試劑確定AHA、Stainzyme以及AHA和Stainzyme —起在20°C至50°C的溫度之間的α -淀粉酶活性。
[0085]各酶的儲(chǔ)備溶液(lmg/ml的 AHA, 0.5mg/ml 的 Stainzyme)在緩沖液 A (IOOmMHepes, IOOmM NaCl, ImM CaCl, ρΗ7.0)中制備。將所述酶儲(chǔ)備溶液在緩沖液A中以1:125的比例進(jìn)一步稀釋并將其混合入冰上的如下各反應(yīng)混合物中:
[0086]1)2.25ml淀粉酶檢測試劑1、0.45ml檢測試劑2、0.3ml經(jīng)稀釋的Stainzyme
[0087]2) 2.25ml淀粉酶檢測試劑1、0.45ml檢測試劑2、0.3ml經(jīng)稀釋的AHA
[0088]3) 2.25ml淀粉酶檢測試劑1、0.45ml檢測試劑2、0.3ml緩沖液A(陰性對照)
[0089]4) 2.25ml淀粉酶檢測試劑1、0.45ml檢測試劑2、0.15ml經(jīng)稀釋的Stainzyme、
0.15ml經(jīng)稀釋的AHA
[0090]將100 μ I的等分試樣立即轉(zhuǎn)移至0.2ml薄壁96-孔PCR板(每種反應(yīng)混合物2整列孔，針對每個(gè)評價(jià)的溫度給出兩個(gè)重復(fù)的讀數(shù))并在能夠運(yùn)行溫度梯度的PCR儀器(Techne TC-500)中如此培養(yǎng):
[0091]設(shè)置所述儀器使得運(yùn)行20°C與50°C之間的溫度梯度。將等分到96-孔PCR板中的樣品在上述條件下孵化正好30分鐘，此時(shí)將PCR板迅速冷卻到4°C。在該冷卻步驟期間，將50 μ I的IM tris.base (未經(jīng)緩沖的)加入到各孔以使反應(yīng)停止(防止進(jìn)一步釋放硝基苯酚反應(yīng)產(chǎn)物)。在充分混合之后，將100 μ I的各反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到干凈的平底微量滴定板中并使用Fluostar Optima酶標(biāo)儀評價(jià)405nm處的吸光度。將各測試溫度下的空白值從含酶混合物所獲得的結(jié)果中扣除。結(jié)果示于圖1中。
[0092]在所述試驗(yàn)的變型中，各酶的儲(chǔ)備溶液(lmg/ml的AHA, 0.5mg/ml的Stainzyme)在緩沖液A (IOOmM Hepes, IOOmM NaCl, ImM CaCl, ρΗ7.0)中制備。將所述酶儲(chǔ)備溶液用緩沖液A以1:250的比例進(jìn)一步稀釋并將其混合入冰上的如下各反應(yīng)混合物中:
[0093]1)2.25ml淀粉酶檢測試劑1、0.45ml檢測試劑2、0.15ml緩沖液A、0.15ml經(jīng)稀釋的 Stainzyme
[0094]2)2.25ml淀粉酶檢測試劑1、0.45ml檢測試劑2、0.15ml緩沖液A、0.15ml經(jīng)稀釋的AHA
[0095]3) 2.25ml淀粉酶檢測試劑1、0.45ml檢測試劑2、0.3ml緩沖液A(陰性對照)
[0096]4) 2.25ml淀粉酶檢測試劑1、0.45ml檢測試劑2、0.15ml經(jīng)稀釋的Stainzyme、
0.15ml經(jīng)稀釋的AHA
[0097]將100 μ I的等分試樣立即轉(zhuǎn)移至0.2ml薄壁96-孔PCR板(每種反應(yīng)混合物2整列孔，針對每個(gè)評價(jià)的溫度給出兩個(gè)重復(fù)的讀數(shù))并在能夠運(yùn)行溫度梯度的PCR儀器(Techne TC-500)中如此培養(yǎng):
[0098]設(shè)置所述儀器使得運(yùn)行20°C與50°C之間的溫度梯度。將等分到96-孔PCR板中的試樣，在上述條件下孵化正好30分鐘，此時(shí)將PCR板迅速冷卻到4°C。在該冷卻步驟期間，將50 μ I的IM tris.base (未經(jīng)緩沖的)加入到各孔以使反應(yīng)停止(防止進(jìn)一步釋放硝基苯酚反應(yīng)產(chǎn)物)。在充分混合之后，將100 μ I的各反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到干凈的平底微量滴定板中并使用Fluostar Optima酶標(biāo)儀評價(jià)405nm處的吸光度。將各測試溫度下的空白值從含酶混合物所獲得的結(jié)果中扣除。結(jié)果示于圖2中。
[0099]在所述試驗(yàn)的另一個(gè)變型中，各酶的儲(chǔ)備溶液(lmg/ml的AHA, 0.5mg/ml的Stainzyme)在緩沖液 A (1OOmM Hepes, IOOmM NaCl, ImM CaCl, ρΗ7.0)中制備。將所述酶儲(chǔ)備溶液用緩沖液A以1:415的比例進(jìn)一步稀釋并將其混合進(jìn)入冰上的如下各反應(yīng)混合物中:
[0100]1)2.25ml淀粉酶檢測試劑1、0.45ml檢測試劑2、0.3ml經(jīng)稀釋的Stainzyme
[0101]2) 2.25ml淀粉酶檢測試劑1、0.45ml檢測試劑2、0.3ml經(jīng)稀釋的AHA
[0102]3) 2.25ml淀粉酶檢測試劑1、0.45ml檢測試劑2、0.3ml緩沖液A(陰性對照) [0103]4) 2.25ml淀粉酶檢測試劑1、0.45ml檢測試劑2、0.15ml經(jīng)稀釋的Stainzyme、
0.15ml經(jīng)稀釋的AHA
[0104]將100 μ I的等分試樣立即轉(zhuǎn)移至0.2ml薄壁96-孔PCR板(每種反應(yīng)混合物2整列孔，針對每個(gè)評價(jià)的溫度給出兩個(gè)重復(fù)的讀數(shù))并在能夠運(yùn)行溫度梯度的PCR儀器(Techne TC-500)中如此培養(yǎng):
[0105]設(shè)置所述儀器使得運(yùn)行20°C與50°C之間的溫度梯度。將等分到96-孔PCR板中的試樣，在上述條件下孵化正好30分鐘，此時(shí)將PCR板迅速冷卻到4°C。在該冷卻步驟期間，將50 μl的IM tris.base (未經(jīng)緩沖的)加入到各孔以使反應(yīng)停止(防止進(jìn)一步釋放硝基苯酚反應(yīng)產(chǎn)物)。在充分混合之后，將100 μ I的各反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到干凈的平底微量滴定板中并使用Fluostar Optima酶標(biāo)儀評價(jià)405nm處的吸光度。將各測試溫度下的空白值從含酶混合物所獲得的結(jié)果中扣除。結(jié)果示于圖3中。
[0106]表1a和lb:AHA、Stainzyme以及兩種酶一起的活性數(shù)據(jù),其中將各酶的儲(chǔ)備溶液以1:125的比例稀釋以用于測試中(數(shù)據(jù)值為使用設(shè)定到405nm處的Fluostar Optima酶標(biāo)儀在用測試底物在20°C與50°C之間的溫度梯度孵化30分鐘后獲得的吸光度讀數(shù))。以圖表形式不于圖5中。
[0107]表1a 溫度 22.533.8 CC )
[0108]
【權(quán)利要求】
1.一種酶促織物處理組合物，其包含以下的組合: i.一種或多種嗜冷酶，以及 ii.一種或多種嗜溫酶和/或一種或多種嗜熱酶。
2.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的酶促織物處理組合物，其中所述嗜冷酶、嗜溫酶以及優(yōu)選嗜熱酶均包含共同類別的酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的酶促織物處理組合物，其中所述共同類別為蛋白酶或脂肪酶或糖基水解酶或裂解酶。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的酶促織物處理組合物，其中所述一種或多種嗜冷酶包含酯酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的酶促織物處理組合物，其中所述一種或多種嗜冷酶包含脂肪酶。
6.使用根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的酶促織物處理組合物處理織物的方法，其中洗滌液的溫度在整個(gè)單洗滌循環(huán)過程中在低溫和中溫之間變化。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述溫度在整個(gè)單洗滌循環(huán)過程中在低溫、中溫和高溫之間變化。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7的處理織物的方法，其中所述方法包括手洗處理和/或用洗滌機(jī)處理。
9.根據(jù)權(quán)利要求4-8中任一項(xiàng)的處理織物的方法，其中洗滌液的溫度在至少一部分中不受使用者控制。
【文檔編號(hào)】C11D11/00GK103748205SQ201280040074
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2012年8月16日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月18日
【發(fā)明者】N·J·帕瑞, S·威爾森 申請人:荷蘭聯(lián)合利華有限公司