專利名稱：用于改進(jìn)人類皮膚、毛發(fā)和/或指甲的健康的膠原蛋白水解物的制作方法
用于改進(jìn)人類皮膚、毛發(fā)和/或指甲的健康的膠原蛋白水解物
本發(fā)明涉及用于改進(jìn)人類皮膚、毛發(fā)和/或指甲的健康的膠原蛋白水解物。
一段時(shí)間以來已知，可以通過經(jīng)口攝入膠原蛋白水解物獲得在人類皮膚、毛發(fā)和/或指甲的健康方面的有利效果(參見例如Vivian Zague 關(guān)于膠原蛋白水解物的攝入對(duì)皮月夫性質(zhì)的影響的新觀點(diǎn)(A new view concerning the effects of Collagen hydrolysateintake on skin properties)，，，Arch.Dermatol.Res.2008 (9) 479-483)。皮膚健康的改進(jìn)在本文中被理解為對(duì)皮膚的天然性質(zhì)和功能的各種積極影響，其中所述性質(zhì)和功能既可以由于老化而受損，也可以額外地通過不同的消極環(huán)境影響而受損。攝入膠原蛋白水解物也對(duì)毛發(fā)和/或指甲的性質(zhì)產(chǎn)生有利影響。
本發(fā)明所基于的目的是，進(jìn)一步提高膠原蛋白水解物對(duì)皮膚、毛發(fā)和/或指甲的健康的積極效果，并且提出對(duì)于這種應(yīng)用特別有效的膠原蛋白水解物。
就一開始所述種類的膠原蛋白水解物而言，根據(jù)本發(fā)明通過以下方式來實(shí)現(xiàn)所述目的，其中至少90重量％的膠原蛋白水解物具有小于3500Da的分子量，并且膠原蛋白水解物包含至少四種分子量在600和1200Da之間的特征肽。
膠原蛋白水解物包含具有不同鏈長(zhǎng)或分子量的肽，所述肽在膠原蛋白的蛋白鏈切割期間產(chǎn)生，其中所述肽的分子量分布可以取決于水解物的制備條件而顯著變化。目前已經(jīng)出人意料地表明，相比于目前使用的包含明顯更少比例的低分子量肽和/或不包含特征肽的膠原蛋白水解物，具有上述性質(zhì)的膠原蛋白水解物在多種不同方面對(duì)皮膚健康產(chǎn)生特別有利的影響，即顯示出顯著更好的結(jié)果。
以至少90重量％低于3500Da的極限值為基礎(chǔ)的膠原蛋白水解物的分子量分布可以例如通過凝膠滲透色譜法使用限定的膠原蛋白片段的校準(zhǔn)標(biāo)樣極精確和可重復(fù)地確定。
至少45重量％的膠原蛋白水解物優(yōu)選具有小于1500Da的分子量，即膠原蛋白水解物的一定比例的肽是特別短鏈的。已經(jīng)表明，通過這種特別低分子的比例(其在目前使用的膠原蛋白水解物中僅以明顯更少的量存在)，可以獲得皮膚健康方面的極為突出的效果。
根據(jù)本發(fā)明使用的膠原蛋白水解物的平均分子量(重均Mw)通常在約1700至約2300Da的范圍內(nèi)。
膠原蛋白水解物的特征肽(其有趣地對(duì)膠原蛋白水解物的效力做出重大貢獻(xiàn))的存在可以特別通過MALD1-質(zhì)譜法確定，其中特征肽在質(zhì)譜中以峰的形式出現(xiàn)。在通過MALD1-質(zhì)譜法確定的分子量分布中，至少四種特征肽優(yōu)選具有相比于其周圍至少兩倍的強(qiáng)度，進(jìn)一步優(yōu)選至少四倍的強(qiáng)度。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，膠原蛋白水解物包含620和690Da之間的肽、790和860Da之間的肽、980和1050Da之間的肽以及1175和1245Da之間的肽。這些肽以特有方式使根據(jù)本發(fā)明的膠原蛋白水解物區(qū)別于已知的膠原蛋白水解物。
膠原蛋白水解物還可額外地具有1500和3500Da之間的特征肽，所述特征肽也構(gòu)成與根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的膠原蛋白水解物的區(qū)別特征。
膠原蛋白水解物優(yōu)選具有12重量％或更大的羥基脯氨酸比例。通過脯氨酸的翻譯后羥基化形成的氨基酸羥基脯氨酸僅存在于膠原蛋白中，因此膠原蛋白水解物中高比例的羥基脯氨酸是基本不存在其他結(jié)締組織蛋白(例如彈性蛋白和蛋白聚糖)的度量，所述其他結(jié)締組織蛋白的片段取決于制備方法也可以以一定量被包含在膠原蛋白水解物中。
有利的是，膠原蛋白水解物通過明膠的酶促水解制得。明膠包含變性膠原蛋白并且通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同方法從不同動(dòng)物種類的結(jié)締組織或從骨骼獲得。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，作為膠原蛋白水解物的起始材料使用的明膠優(yōu)選從哺乳動(dòng)物的皮膚，特別是從豬皮或牛皮獲得，但是也不排除使用來自家禽的明膠。
明膠的酶促水解通常通過至少一種內(nèi)切蛋白酶進(jìn)行，其中在本發(fā)明的范圍內(nèi)優(yōu)選的是，使用多種內(nèi)切蛋白酶(即至少兩種不同的內(nèi)切蛋白酶)，從而由此相應(yīng)地影響所得膠原蛋白水解物的氨基酸分布情況(AminosaurepiOfil)并且提高水解物對(duì)皮膚、毛發(fā)和/或指甲的健康的積極效果。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案，膠原蛋白水解物通過至少兩種具有不同特異性的內(nèi)切蛋白酶，特別是至少兩種不同的金屬蛋白酶和/或絲氨酸蛋白酶的依次作用制得，即通過分別在特定氨基酸之前或之后切割膠原蛋白分子的氨基酸序列的蛋白酶的依次作用制得。金屬蛋白酶和/或絲氨酸蛋白酶有利地為來自于微生物枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、米曲霉(Aspergillus oryzae)和蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)的酶。
通過選擇合適的內(nèi)切蛋白酶不僅可以獲得膠原蛋白水解物的特征性分子量分布，而且也可以影響水解物中包含的肽的末端處的氨基酸種類。就此而言，例如優(yōu)選的是，膠原蛋白水解物的至少50%的N-端氨基酸為疏水性氨基酸，特別是丙氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。
本發(fā)明還特 別涉及膠原蛋白水解物用于刺激通過皮膚細(xì)胞生物合成細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的用途。皮膚細(xì)胞特別包括成纖維細(xì)胞，所述成纖維細(xì)胞尤其合成膠原蛋白(主要為I型)、彈性蛋白以及蛋白聚糖。這些蛋白以足夠量形成對(duì)于皮膚的細(xì)胞外基質(zhì)的建立或再生是決定性的，皮膚的細(xì)胞外基質(zhì)又對(duì)于皮膚的性質(zhì)例如張力和彈性及其水分平衡是非常決定性的。
皮膚細(xì)胞也包括角化細(xì)胞，所述角化細(xì)胞不僅負(fù)責(zé)皮膚最外層的角質(zhì)化，而且負(fù)責(zé)毛發(fā)和指甲的形成。因此可以通過根據(jù)本發(fā)明使用的膠原蛋白水解物刺激這些細(xì)胞從而改進(jìn)皮膚的屏障功能以及毛發(fā)和/或指甲的健康。
本發(fā)明的一個(gè)重要方面涉及膠原蛋白水解物用于提高皮膚的張力和/或減少皺紋形成的用途。皮膚的這些性質(zhì)通常由于老化以及由于環(huán)境影響例如紫外線輻射或有毒物質(zhì)而變差。由于基質(zhì)蛋白膠原蛋白和彈性蛋白特別對(duì)皮膚的張力和彈性負(fù)責(zé)，可以通過受根據(jù)本發(fā)明使用的膠原蛋白水解物大幅刺激的所述基質(zhì)蛋白的增加的合成來抵抗這些影響并且顯著改進(jìn)皮膚健康。
本發(fā)明的另一重要方面涉及膠原蛋白水解物用于提高皮膚的水分含量的用途。細(xì)胞外基質(zhì)中包含的蛋白聚糖(例如多能蛋白聚糖、雙糖鏈蛋白聚糖和核心蛋白聚糖)(也證實(shí)其合成受根據(jù)本發(fā)明使用的膠原蛋白水解物刺激)對(duì)皮膚結(jié)合足夠量的水分的能力做出巨大貢獻(xiàn)。皮膚的水分含量也可以通過有害的環(huán)境影響例如紫外線輻射而降低，其中水分損失通常伴有皮膚的柔韌性降低、皸裂和過度角質(zhì)化。
本發(fā)明的另一方面涉及膠原蛋白水解物用于改進(jìn)皮膚的屏障功能的用途。所謂的CE-蛋白(“角質(zhì)化包膜蛋白)，尤其是外皮蛋白、兜甲蛋白和絲聚蛋白對(duì)屏障功能起重要作用，已證實(shí)它們的生物合成受低分子量的膠原蛋白水解物刺激。因此，通過根據(jù)本發(fā)明使用膠原蛋白水解物，改進(jìn)了皮膚的水分損失的減少、屏障功能以及針對(duì)病原菌和有毒物質(zhì)的天然保護(hù)。
根據(jù)本發(fā)明使用膠原蛋白水解物還額外導(dǎo)致皮膚區(qū)域內(nèi)的抗氧化作用，由此可以降低例如由紫外線輻射或突變物質(zhì)造成的DNA損傷(突變)的頻率。這種突變構(gòu)成細(xì)胞過早老化的原因并且因此促進(jìn)皮膚的老化癥狀(張力降低、形成皺紋等)，因此可以通過根據(jù)本發(fā)明的用途抑制所述過程。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案，膠原蛋白水解物用于經(jīng)口攝入。在經(jīng)口攝入時(shí)，膠原蛋白水解物通常通過血液循環(huán)比在局部應(yīng)用時(shí)更有效地轉(zhuǎn)運(yùn)至作用位點(diǎn)，即特別是轉(zhuǎn)運(yùn)至皮膚細(xì)胞。此外，這種應(yīng)用形式對(duì)于使用者來說通常不費(fèi)事。
膠原蛋白水解物優(yōu)選以營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑的形式使用。膠原蛋白水解物在此通常用于在一般保健的意義上改進(jìn)皮膚健康或者也用于美容應(yīng)用；這種營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑可被稱為“營(yíng)養(yǎng)食品”或“營(yíng)養(yǎng)美容品”。但是在本發(fā)明的范圍內(nèi)，例如在存在特應(yīng)性皮炎時(shí)(其中患者具有干燥皸裂皮膚的趨勢(shì)增加)，膠原蛋白水解物用于治療臨床病癥的用途也是可能的。
營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑可以幾乎以任意形式提供，例如以片劑、膠囊、糖衣片劑、錠劑或溶液(例如在單個(gè)安瓿中或在飲料中)的形式。
膠原蛋白 水解物也可以被包含在食品或高檔食品中，例如甜食或用于配制飲料的速溶粉中。因此，水解物可以在正常營(yíng)養(yǎng)的過程中被使用者攝入而無需額外的花費(fèi)(所謂的“功能食物”)。就此而言特別有利的是，膠原蛋白水解物基本上是無味的。
有利的是，每日攝入約1.5至5g，優(yōu)選約2至3g，進(jìn)一步優(yōu)選約2.3至2.7g膠原蛋白水解物。已經(jīng)表明，通過經(jīng)口攝入所述量的水解物在數(shù)周內(nèi)即可顯著改進(jìn)皮膚健康。
本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案涉及膠原蛋白水解物的局部應(yīng)用，即以美容產(chǎn)品的形式應(yīng)用從而施用在皮膚、毛發(fā)和/或指甲上。膠原蛋白水解物在此可以被特別包含在乳霜、膏劑、洗劑或凝膠中。還有利的是，膠原蛋白水解物例如以約5至10重量％的量被添加到身體護(hù)理產(chǎn)品，例如沐浴凝膠或洗發(fā)劑。
根據(jù)如下實(shí)施例參考附圖更詳細(xì)地描述本發(fā)明的這些和其他優(yōu)點(diǎn)。附圖分別顯示了:


圖1A至IC:與I型膠原蛋白、雙糖鏈蛋白聚糖或多能蛋白聚糖的合成的刺激相關(guān)的圖2A和2B:與無毛小鼠的皮膚水分的提高相關(guān)的圖3:與CE-蛋白的合成的刺激相關(guān)的圖4A至4C:不同膠原蛋白水解物的MALDI_質(zhì)譜；和
圖5A和5B:與I型膠原蛋白、核心蛋白聚糖和多能蛋白聚糖的合成的刺激相關(guān)的圖。
具體實(shí)施方式
1.膠原蛋白水解物的制備和性質(zhì)
為了制備根據(jù)本發(fā)明的膠原蛋白水解物，使用豬皮明膠(A型，200至250g Bloom)的濃度為20至40重量％ (干物質(zhì))的水溶液作為起始材料。明膠通過兩種不同的微生物來源的內(nèi)切蛋白酶在50至60° C下依次作用120至180分鐘進(jìn)行酶促水解，其中使用枯草芽孢桿菌或解淀粉芽孢桿菌的內(nèi)切蛋白酶作為第一種酶，并且使用地衣芽孢桿菌的內(nèi)切蛋白酶作為第二種酶。然后使酶熱滅活并將溶液噴霧干燥。
所得膠原蛋白水解物的分子量分布可以通過凝膠滲透色譜法使用如下參數(shù)確定:
固定相:TSK2000 Sff XL (Tosoh Bioscience 股份有限公司)
移動(dòng)相:0.4mol/l磷酸二氫鈉ρΗ5.3
流速:0.5ml/min
校準(zhǔn)標(biāo)樣:限定的I型膠原蛋白片段(FILK, Freiberg)
檢測(cè):UV-檢測(cè)器Knauer K_2501，在 214nm 下
確定得到根據(jù)下表I所示的根據(jù)本發(fā)明的膠原蛋白水解物(在下文中稱為低分子量水解物)的分子量分布。為了對(duì)比，表I中也給出用相同方法確定的市售獲得的膠原蛋白水解物(在下文中稱為聞分子量水解物)的分子量分布:
表I
權(quán)利要求
1.用于改進(jìn)人類皮膚、毛發(fā)和/或指甲的健康的膠原蛋白水解物，其特征在于，至少90重量％的膠原蛋白水解物具有小于3500Da的分子量，并且膠原蛋白水解物包含至少四種分子量在600和1200Da之間的特征肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠原蛋白水解物，其中至少45重量％的膠原蛋白水解物具有小于1500Da的分子量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的膠原蛋白水解物，其中所述至少四種特征肽在通過MALD1-質(zhì)譜法確定的分子量分布中具有相比于其周圍至少兩倍的強(qiáng)度，優(yōu)選至少四倍的強(qiáng)度。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的膠原蛋白水解物，其中膠原蛋白水解物包含620和690Da之間的肽、790和860Da之間的肽、980和1050Da之間的肽以及1175和1245Da之間的肽。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的膠原蛋白水解物，其中膠原蛋白水解物還包含分子量在1500和3500Da之間的特征肽。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的膠原蛋白水解物，其中膠原蛋白水解物具有12重量％或更大的羥基脯氨酸比例。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的膠原蛋白水解物，其中膠原蛋白水解物通過明膠的酶促水解制得。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的膠原蛋白水解物，其中膠原蛋白水解物通過至少兩種具有不同特異性的內(nèi)切蛋白酶，特別是至少兩種不同的金屬蛋白酶和/或絲氨酸蛋白酶的依次作用制得。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的膠原蛋白水解物，其中金屬蛋白酶和/或絲氨酸蛋白酶選自來自于微生物枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、角軍淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、米曲霉(Aspergillusoryzae)和蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)的酶。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的膠原蛋白水解物，其中膠原蛋白水解物的至少50%的N-端氨基酸為疏水性氨基酸，特別是丙氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的膠原蛋白水解物，其用于刺激通過皮膚細(xì)胞生物合成細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的膠原蛋白水解物，其用于提高皮膚的張力和/或較少皺紋形成。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的膠原蛋白水解物，其用于提高皮膚的水分含量。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的膠原蛋白水解物，其用于改進(jìn)皮膚的屏障功能。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的膠原蛋白水解物，其中膠原蛋白水解物用于經(jīng)口攝入。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的膠原蛋白水解物，其中膠原蛋白水解物為營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的膠原蛋白水解物，其中膠原蛋白水解物被包含在食品或高檔食品中。
18.根據(jù)權(quán)利要求15至17任一項(xiàng)所述的膠原蛋白水解物，其中每日攝入約1.5至5g，優(yōu)選約2至3g，進(jìn)一步優(yōu)選約2.3至2.7g膠原蛋白水解物。
19.根據(jù)權(quán)利要求1至14任一項(xiàng)所述的膠原蛋白水解物，其中膠原蛋白水解物用于局部應(yīng)用。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的膠原蛋白水解物，其中膠原蛋白水解物被包含在乳霜、膏齊U、洗劑、凝膠或洗 發(fā)劑中。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于改進(jìn)人類皮膚、毛發(fā)和/或指甲的健康的膠原蛋白水解物，其中至少90重量%的膠原蛋白水解物具有小于3500Da的分子量，并且其中膠原蛋白水解物包含至少四種分子量在600和1200Da之間的特征肽。
文檔編號(hào)A61Q19/08GK103209678SQ201180054946
公開日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2011年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月15日
發(fā)明者斯特凡·豪斯曼斯, 莫尼卡·吉森-維澤爾, 斯特芬·厄塞爾 申請(qǐng)人:格利達(dá)股份公司