專利名稱：：疏水蛋白在處理固化礦物建材、天然石材、鑄石及陶瓷表面中的用途的制作方法疏水蛋白在處理固化礦物建材、天然石材、鑄石及陶資表面中的用途發(fā)明領域本發(fā)明涉及疏水蛋白在處理固化礦物建材、天然石材、鑄石或陶瓷表面中的用途，處理此類表面的方法，以及具有含疏水蛋白涂層的固化礦物建材、天然石材、鑄石或陶資表面。技術背景已知能為室內(nèi)及室外的表面添加涂層，以改善其表面的持久性和/或外觀。此類涂層能夠例如保存、防潮、抑制污損或有助于表面清潔。該涂層可為永久性防污涂層，例如通過荷花效應灌注的涂層，如EP-A933388所7>開的那樣。該涂層也可為暫時性涂層?？梢越柚诒砻媲鍧嵾^程中涂布的清潔制劑中所含的物質(zhì)來實現(xiàn)該暫時性防污效果。例如，它們可為資磚清潔劑。WO03/002620公開了二烷基氨基烷基(甲基)丙烯酸酯作為硬表面污物釋放聚合物的用途，例如用于細石地板或不銹鋼表面。公開的制劑含有以重量計0.1%至5。/。的聚合物。DE-110061897公開了包括含硅酸鹽的疏水顆粒的清潔組合物，所述顆粒能改進污物脫離并減少再次污損。所述顆粒被待清潔物質(zhì)的表面攝取，進而影響其性質(zhì)。疏水蛋白為含有約100至150個氨基酸的小蛋白質(zhì)，為絲狀真菌例如普通裂褶菌(&/^^/^//"/co柳附wie)所特有。它們一般具有8個半胱氨酸單位。疏水蛋白對界面具有顯著親和力，因此可用于表面涂層。例如，用疏水蛋白包涂鐵氟龍(Teflon)，可以得到親水表面。疏水蛋白可分離自天然來源。但也可以通過化學方法和/或生物技術生產(chǎn)方法合成非天然存在的疏水蛋白。我們的在先申請DE102005007480.4公開了生產(chǎn)并非天然存在的疏水蛋白的方法?，F(xiàn)有技術提出了疏水蛋白在多種應用中的用途。WO96/41882提出疏水蛋白作為乳化劑、增稠劑或表面活性劑的用途，用以賦予疏水表面親水性、提高親水物質(zhì)的防水性、制備水包油乳液或油包水乳液。其他提示包括諸如制備青劑或霜劑的藥物應用，以及化妝品應用如皮膚保護或者生產(chǎn)香波或調(diào)理劑。EP-A1252516公開了于30至80'C用含疏水蛋白的溶液對窗、隱形眼鏡、生物傳感器、醫(yī)療設備、實施測定或貯藏用容器、船體、固體顆?；蜣I車框架或車體進行涂層。WO03/53383>^開了疏水蛋白在化妝品應用中處理角質(zhì)材料的用途。WO03/10331公開了疏水蛋白涂層的傳感器(例如測量電極)，該傳感器上非共價連有其他物質(zhì)如電活性物質(zhì)、抗體或酶。以上引用的參考文獻無一公開過疏水蛋白處理固化礦物建材、天然石材、鑄石或陶資表面中的用途。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的在于提供處理此類表面的新技術，由此能夠獲得至少一種防污和/或疏水化和/或保存效果。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過使用疏水蛋白處理選自固化礦物建材、天然石材、鑄石或陶瓷的材料表面，能夠實現(xiàn)該目的。在優(yōu)選實施方案中，包括疏水蛋白及至少一種溶劑的制劑用于該目的。本發(fā)明的第二方面提供了處理表面的方法，包括將所述表面與至少一種疏7JC蛋白接觸，其中所述表面包括選自固化礦物建材、天然石材、鑄石或陶瓷的材料表面。本發(fā)明的第三方面提供了用至少一種疏水蛋白包被的表面，所述表面包括固化礦物建材、天然石材、鑄石或陶資。令人驚異的是，我們發(fā)現(xiàn)即使極其少量的疏水蛋白也足以對固化礦物建材、石材或陶資的表面進行有效的防污和/或疏水性和/或保存處理。令人驚異的是，我們發(fā)現(xiàn)即使極其少量的疏水蛋白也足以對硬表面進行有效的防污處理。本發(fā)明詳述如下才艮據(jù)本發(fā)明，^使用至少一種疏水蛋白用于處理固化礦物建材、天然石材、鑄石或陶瓷表面。也可使用多種不同疏水蛋白的混合物。此處所用的術語"疏水蛋白"在下文是指具有通式結構(I)的多肽Xn-C、Xi-50-C2-Xo-5-C3-Xi-ioO-C4-Xi.ioo-C5-Xi-50-C6-Xo-5-C7-Xi-50-C8-Xm(I)其中X可為20種天然氨基酸中的任一種(苯丙氨酸Phe、亮氨酸Leu、絲氨酸Ser、酪氨酸Tyr、半胱氨酸Cys、色氨酸Trp、脯氨酸Pro、組氨酸His、谷氨酰胺Gln、精氨酸Arg、異亮氨酸Ile、曱硫氨酸Met、蘇氨酸Thr、天冬酰胺Asn、賴氨酸Lys、纈氨酸Val、丙氨酸Ala、天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、甘氨酸Gly)。各X可相同也可不同。每一例中X旁的下標為氨基酸的數(shù)目，C代表半胱氨酸、丙氨酸、絲氨酸、甘氨酸、曱硫氨酸或蘇氨酸，前提是至少四個由C標識的氨基酸為半胱氨酸，下標n和m獨立地為范圍在0至500的自然數(shù)，優(yōu)選范圍為15至300。式(I)多肽的特征還在于，相對于相同大小的水滴與非包被玻璃表面形成的接觸角，該多肽的特性可使(包被后玻璃表面)水滴接觸角增加至少20°、優(yōu)選至少25。、更優(yōu)選至少30。，且最優(yōu)選至少35。，其中每一測量均在室溫進行。d至CS代表的M酸優(yōu)選為半胱氨酸；但它們也可被其他類似大小的氨基酸所取代，優(yōu)選丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、曱硫氨酸或甘氨酸。然而，C^至CS中至少4個、優(yōu)選至少5個、更優(yōu)選至少6個、特別優(yōu)選至少7個位置應當由半胱氨酸組成。本發(fā)明所用蛋白質(zhì)中的半胱氨酸可以還原形式存在，或彼此之間形成二硫鍵。特別優(yōu)選分子內(nèi)形成C-C橋，尤其是其中包括至少l個、優(yōu)選2個、更優(yōu)選3個而最優(yōu)選4個分子內(nèi)二硫橋的疏水蛋白。在上述用具有相似大小的氨基酸置換半胱氨酸的情況下，最好在這樣的c位置上成對置換，從而可彼此形成分子內(nèi)二硫橋。當半胱氨酸、絲氨酸、丙氨酸、，甘氨酸、甲硫氨酸或蘇氨酸用于x指代的位置時，通用式中單個c位置的編號可據(jù)此改變。優(yōu)選使用通用式(II)的疏水蛋白Xn-C、X3-25-C2-Xo-2-C3-Xs-5(rC4曙X2-35國C5-X2-l5-C6-Xo-2-C7國X3-35-C8-Xm(II)其中X、C以及X旁的下標各自定義如上，下標n和m代表從O到300的數(shù)字，且該蛋白質(zhì)的特征還在于上述接觸角改變。優(yōu)選使用通用式(III)的疏水蛋白Xn-C、X5-9-C2-C3-Xii-39—C4-X2-23誦C5國X5-9曙C6-C7-X6-l8-C8-Xm(IU)其中X、C以及X旁的下標各自定義如上，下標n和m代表從O到200的數(shù)字，且該蛋白質(zhì)的特征還在于上述接觸角改變，此外C代表的氨基酸中至少6個為半胱氨酸。特別優(yōu)選所有C代表的氨基酸都為半胱氨酸。殘基Xn和Xm可為與疏水蛋白天然相連的肽序列。然而，殘基Xn和xm之一或兩者均可以是不與疏水蛋白天然相連的肽序列。也包括這樣的Xn和/或Xm殘基，其中天然存在于疏水蛋白中的肽序列由非天然存在于疏水蛋白中的肽序列所延伸。當xn和/或xm為非天然存在于疏水蛋白中的肽序列時，該序列的長度一般為至少20個氨基酸，優(yōu)選至少35個氨基酸，更優(yōu)選至少50個氨基酸，而最優(yōu)選至少IOO個氨基酸。此類并非天然連于疏水蛋白的殘基，下文也稱為融合配偶體部分。這是為了說明所述蛋白質(zhì)是由疏水蛋白部分和融合配偶體部分組成的，此二者自然狀態(tài)下并不一起存在。融合配偶體部分可選自多種蛋白質(zhì)。多個融合配偶體部分也可以連接于一個疏水蛋白部分，例如連于疏水蛋白部分的氨基末端(Xn)或羧基末端(Xm)。但也可以例如將兩個融合配偶體部分連于本發(fā)明所用的蛋白質(zhì)的一個位置上(Xn或XJ。特別適宜的融合配偶體部分為天然存在于微生物、特別是大腸桿菌(五.co//)或枯草芽孢桿菌(5flci7/附sw6說/s)中的多肽。此類融合配偶體部分的實例為序列yaad(SEQIDNO:15和16)、yaae(SEQIDNO:17和18)及硫氧化還原蛋白。同樣高度適用的是前述序列的片段或衍生物，其中僅包含部分所述序列，優(yōu)選為所述序列的70%至99%，更優(yōu)選80%至98%，或相對于所述序列其中個別氨基酸或核苷酸發(fā)生了改變。還可另外修飾才艮據(jù)本發(fā)明所用蛋白質(zhì)的多肽序列，例如通過糖基化、?；蚧瘜W交聯(lián)(例如通過戊二醛交聯(lián))。根據(jù)本發(fā)明使用的蛋白質(zhì)的特性之一，在于改變了該蛋白質(zhì)所包被表面的表面特性。通過測量用蛋白質(zhì)包被表面前后的水滴接觸角并確定兩次測量之差，可以試驗性確定表面特性的改變。本領域技術人員原則上知道如何實施接觸角測量。測量接觸角的具體實驗條件描述于實驗部分。在其中所述的條件下，根據(jù)本發(fā)明所用的蛋白質(zhì)具有增加水滴在玻璃表面接觸角的特性，至少增加20。，優(yōu)選至少25。，更優(yōu)選至少30°。目前已知的疏水蛋白中疏水蛋白部分的極性和非極性氨基酸位置保守，從而產(chǎn)生了特征性的疏水性圖譜。根據(jù)生理性質(zhì)和疏水性的差異，可將目前已知的疏水蛋白分為兩類，I類和II類(Wessels等人，Ann.Rev.Phytopathol.，1994，W，413-437)。I類疏水蛋白的組裝膜高度不可溶(即使是升高溫度在1%重量的十二烷基硫酸鈉(SDS)水性溶液中也是如此)，僅通過濃縮三氟乙酸(TFA)或曱酸才可再次解離。與之相反，II類疏水蛋白的組裝形式較不穩(wěn)定。它們通過60%重量的乙醇或1%重量的SDS(于室溫)即可再次解離。氨基酸序列的比較揭示，II類疏水蛋白中半胱氨酸<:3與半胱氨酸C4之間的區(qū)域長度明顯小于I類疏水蛋白。II類疏水蛋白還比I類具有更多帶電荷的氨基酸。實施本發(fā)明尤其優(yōu)選的疏水蛋白為dewA、rodA、hypA、hypB、sc3、basfl、basf2型的疏水蛋白，下文的序列表對其進行了結構表征。疏水蛋白也可僅為其部分或衍生物。也可以將多個相同或不同結構的疏水蛋白(優(yōu)選2個或3個)一起連接于并非天然連接疏水蛋白的相應適宜多肽序列上。為實施本發(fā)明特別合適的還有具有SEQIDNO:20、22、24所示多肽序列的融合蛋白質(zhì)及其編碼核酸序列，特別是SEQIDNO:19、21、23的序列。特別優(yōu)選的實施方案還包括由SEQIDNO:20、22或24所示多肽序列起始，通過取代、插入或缺失至少l個至多10個、優(yōu)選5個、更優(yōu)選所有M酸的5%而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)仍然具有起始蛋白質(zhì)至少50%的生物特性。此處，應理解根據(jù)本發(fā)明所用蛋白質(zhì)的生物特性是指上述至少20°的接觸角改變。根據(jù)本發(fā)明所用的多肽可通過肽合成的成熟技術化學制備，例如通過Merrifield固相合成?？梢岳煤线m的方法將天然存在的疏水蛋白從自然來源中分離出來。例如可見W6sten等人，Eur.JCellBio.63，122-129(1994)或WO96/41882。非天然融合蛋白質(zhì)優(yōu)選通過遺傳工程方法制備，其中將編碼融合配偶體的核酸序列(特別是DNA序列)與編碼疏水蛋白部分的核酸序列(特別是DNA序列)組合，從而通過組合核酸序列的基因表達在宿主微生物中產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)。此類構建方法公開于我們在先申請DE102005007480.4中。用于所述構建方法的合適宿主或生產(chǎn)微生物包括原核細胞(包括古生菌(j/r/ifl^))或真核細胞，特別是細菌(包括嗜鹽菌(/^/Mff"eWff)和甲烷球菌(附e幼artoc"))、真菌、昆蟲細胞、植物細胞和哺乳動物細胞，更優(yōu)選大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌(5fl"7/肌w^flteWfi附)、米曲霉(J5/7erg"/W5107Zefl)、構巢曲霉(y45/7Cg"/附WlV/"/flf!S)、黑曲霉(」5/^《///"51w/gw)、巴斯德畢赤酵母(尸/cA/fl/mstoWs)、假單胞菌屬物種(尸WM甴w0fi氾5/7CC)、乳酸桿菌(/"Cto6fl"7//)、多形漢遜酵母(^a朋eWM/a/^(v附O/77/m)、里氏木霉(7Wc/^flfe"柳fl/ww/)、SF9(或相關細胞)等等。為實施本發(fā)明，可以使用得到的調(diào)節(jié)核酸序列遺傳調(diào)控下的本發(fā)明所用多肽編碼核酸序列的表達構建體，以及含有至少一種這些表達構建體的載體來制備疏水蛋白。所用表達構建體優(yōu)選包括特定編碼序列5，上游的啟動子，以及特定編碼序列3'下游的終止子序列，適用的情況下還包括各自與編碼序列有效連接的其他常見調(diào)控元件。"有效連接"是指啟動子、編碼序列、終止子以及適用情況下的其他調(diào)控元件的有序排列，從而使每一調(diào)控元件能夠實現(xiàn)其表達編碼序列所需的功能。有效連接序列的實例為尋耙序列以及增強子、聚腺苷化信號等。其他調(diào)控元件包括可選擇標記、擴增信號、復制起點等。合適的調(diào)控序列描述于如Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,CA(1990)中。除了這些調(diào)控序列，在實際結構基因的上游可能還存在對這些序列的天然調(diào)控，且適用的情況下可對之進行遺傳修飾，從而關閉天然調(diào)控而增強基因表達。優(yōu)選的核酸構建體最好還包括一個或多個與啟動子功能性連接的上述增強子序列，以增強核酸序列的表達。其他有利的序列如其他調(diào)控元件或終止子也可插入DNA序列的3，端。構建體中可能具有一個或多個拷貝的核酸。如為選擇構建體所需，適用的情況下，所述構建體還可包括其他標記如抗生素抗性或營養(yǎng)缺陷型補償基因。例如，所述方法有利的調(diào)控序列存在于啟動子如cos、tac、trp、tet、trp國tet、Ipp、lac、Ipp-lac、laclq國T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)SP6、X-PR或imlambda-P啟動子中，所述啟動子最好用于革蘭氏陰性細菌。其他有利的調(diào)控序列存在于例如革蘭氏陽性啟動子amy和SP02、酵母或真菌啟動子ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中。也可使用人工啟動子進行調(diào)控。為在宿主生物中表達核酸構建體，最好將其插入載體(如質(zhì)粒或噬菌體)中，從而達到基因在宿主中的最佳表達。載體以及質(zhì)粒和噬菌體，還包括所有其他本身已知的載體，例如病毒(如SV40、CMV、桿狀病毒和腺病毒)、轉座子、IS元件、噬菌粒、粘粒以及線性或環(huán)狀DNA，還有農(nóng)軒菌(々/v6a"m'"挑)系統(tǒng)。這些載體在宿主生物中可以自主或隨染色體復制。這些載體構成了本發(fā)明的另一形式。合適質(zhì)粒的實例為，大腸桿菌的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、p股、pKK223畫3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III"3-Bl、tgtll或pBdCI，鏈霉菌(&r印to柳j;cM)的plJ101、pIJ364、plJ702或plJ361，桿菌的pUB110、pC194或pBD214，棒狀桿菌(Owj"ekcter/"柳)的pSA77或pAJ667，真菌的pALSl、plL2或pBB116,酵母的2a、pAG誦l、YEp6、YEpl3或pEMBLYe23，或植物的pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。所述質(zhì)粒構成了可能質(zhì)粒的一小部分。其他質(zhì)粒本身已知，可見于例如書籍CloningVectors(PouwelsP.H.等人編輯Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985，ISBN0444904018)。為表達其他存在的基因，核酸構建體中最好還包括3，-和/或5，-末端調(diào)控序列以增強表達，所述序列根據(jù)宿主生物和基因的選擇而加以選擇，以達到最佳表達。這些調(diào)控序列旨在使基因和蛋白質(zhì)的表達具有特異性。例如，取決于宿主生物，這可能意味著基因僅在誘導后表達或過表達，或即刻表達和/或過表達。優(yōu)選引入基因的表達可受調(diào)控序列或因子的正面影響而增強。因而最好利用強轉錄信號(如啟動子和/或增強子)在轉錄水平增強調(diào)控元件。然而，除此之外，也可以通過如提高mRNA的穩(wěn)定性來增強翻譯。在另一種載體形式中，含有核酸構建體或核酸的載體也可以最好以線性DNA的形式引入微生物，并通過異源或同源重組整合于宿主生物的基因組中。線性DNA可由線性化載體如質(zhì)粒組成，或僅由該核酸構建體或核酸組成。為實現(xiàn)生物中異源基因的最佳表達，最好根據(jù)生物中特定的密碼子使用來修飾核酸序列。通過計算機分析所研究生物的其他已知基因，可以確定密碼子的使用。將合適的啟動子與合適的編碼核苷酸序列及終止子或聚腺苷化信號融合，制備表達盒。常規(guī)重組和克隆技術見于例如T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.Sambrook，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)，及T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1984)，以及Ausubel，F(xiàn).M.等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssoc.andWileyInterscience(1987)中，可用于此目的。為實現(xiàn)合適宿主生物中的表達，最好將重組核酸構建體或基因構建體插入宿主特異性的載體中，這可提供宿主中基因的最佳表達。載體本身為已知且可見例如"CloningVectors"(PouwelsP.H.等人編輯，Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985)?？梢岳幂d體制備例如由至少一個載體轉化的可用于生產(chǎn)本發(fā)明所用多肽的重組微生物。最好將上述重組構建體引入合適的宿主系統(tǒng)并表達之。此處，優(yōu)選使用本領域技術工人已知的成熟的克隆和轉染技術以在特定表達系統(tǒng)中表達所述核酸，例如共沉淀、原生質(zhì)體融合、電穿孔、逆轉錄病毒轉染等。合適系統(tǒng)的描述見于例如CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.Ausubel等人編輯，WileyInterscience,NewYork1997,或Sambrook等人.MolecularCloning:ALaboratoryManual.第2版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989。也可以制備同源重組的微生物。為此，可制備包括至少一部分本發(fā)明所用基因或編碼序列的載體，適用的情況下，所述編碼序列中引入至少一個氨基酸缺失、氨基酸添加或M酸取代，從而修飾(例如功能性破壞)該序列(敲除載體)。引入序列可為例如相關微生物的同源物或由哺乳動物、酵母或昆蟲來源衍生而來?；蛘?，可設計用于同源重組的載體，從而使內(nèi)源性基因在同源重組時發(fā)生突變或其他改變，但仍然編碼功能性蛋白質(zhì)(例如改變上游調(diào)控區(qū)域由此改變內(nèi)源性蛋白質(zhì)的表達)。本發(fā)明所用基因的改變了的部分位于同源重組載體中。適于同源重組載體的構建見于例如Thomas,K.R.和Capecchi，M.R.(1987)Cell51:503。適用于本發(fā)明所用核酸或核酸構建體的重組宿主生物原則上可為任何原核或真核生物。最好使用微生物如細菌、真菌或酵母作為宿主生物。革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌，優(yōu)選腸桿菌科(五wten^flcteWflc^e)、假單胞菌科(i^ewfifo/wo""dflceffe)、才艮瘤菌科(及/^oAZff"ffe)、鏈霉菌科0S^^pto附y(tǒng)cetoc^^)或諾卡氏菌科(7Vocfln/i'flceae)的細菌，特別優(yōu)選4吏用的細菌為埃希氏菌屬(五sc^ri'c/^fl)、假單胞菌屬、鏈酶菌屬、諾卡氏菌屬、伯克霍爾德菌屬(5wrMo似eWfl)、沙門氏菌屬、農(nóng)桿菌屬或紅球菌屬(及Ao^cocc"s)的細菌。根據(jù)宿主生物的不同，通過技術工人公知的方式生長或培養(yǎng)用于制備融合蛋白質(zhì)方法的生物。微生物通常生長于液體培養(yǎng)基中，其中包括碳源(通常為糖的形式)、氮源(通常為有機氮源如酵母膏或鹽如硫酸銨的形式)、微量元素(如鐵鹽、錳鹽和鎂鹽)，以及適用情況下的維生素，溫度為0。C至100°C，優(yōu)選10。C至60°C，同時供以氧氣。此處，營養(yǎng)液的pH值可保持在固定值，即培養(yǎng)期間可以調(diào)節(jié)也可不調(diào)節(jié)。培養(yǎng)可批量、半批量或連續(xù)進行。營養(yǎng)素可以在發(fā)酵起始時加入，或以半連續(xù)或連續(xù)的方式進行隨后加料。可以通過實施例中所述的方法從生物中分離酶，也可以粗提物的形式用于反應。同樣適用于重組制備多肽或其功能生物活性片段的方法，是培養(yǎng)多肽生產(chǎn)微生物，適用的情況下誘導多肽表達，并從培養(yǎng)物中分離所述多肽。如果期望，也可通過該方法工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)多肽?？赏ㄟ^已知方法培養(yǎng)并發(fā)酵重組微生物。例如，可以在溫度20至40。C、pH6-9的TB培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基中繁殖細菌。合適的培養(yǎng)條件詳細描述于T.Maniatis,E.RFritsch和J.Sambrook，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)中。若多肽并非分泌至培養(yǎng)基中，則破壞細胞并通過已知蛋白質(zhì)分離方法從裂解物中獲取產(chǎn)物。可以根據(jù)需要通過高頻超聲、通過高壓(如弗氏細胞壓碎器)、通過滲透溶解、通過去污劑、裂解酶或有機溶劑的作用、通過勻漿器或通過兩種或多種所列方法的組合來破壞細胞?？梢岳靡阎纳挿椒兓嚯?，例如分子篩色鐠(凝膠過濾)，如Q瓊脂糖凝膠色鐠、離子交換色鐠和疏水色i普，也可使用其他常用方法如超濾、結晶、鹽析、透析和非變性凝膠電泳。合適的方法見述于例如Cooper，F(xiàn).G"BiochemischeArbeitsmethoden,VerlagWalterdeGruyter,Berlin,NewYork或Scopes,R.,ProteinPurification,SpringerVerlag,NewYork,Heidelberg,Berlin中。通過載體系統(tǒng)或寡核苷酸分離重組蛋白質(zhì)可能有利，所述寡核普酸以特定核苷酸序列延伸了cDNA，從而編碼改變的多肽或融合蛋白質(zhì)，可用于例如簡化純化。此類適當1務飾的實例有作為錨起作用的"標簽"，例如稱為六組氨酸錨的修飾，或能夠作為抗原被抗體識別的表位(描述于如Harlow,E.和Lane,D.，1988，Antibodies:ALaboratoryManual.ColdSpringHarbor(N.Y.)Press中)。其他合適標簽的實例如HA、鉤調(diào)蛋白-BD、GST、MBD;幾丁質(zhì)-BD、鏈酶親和素-BD-avi-標簽、Flag-標簽、T7等。這些錨可用于將蛋白質(zhì)附著到固相支持物如聚合物基質(zhì)上，例如，其可裝載在色譜柱中，或可在微量滴定板或其他支持物上使用。相應的純化方法可從親和標簽提供商處獲得。如所述制備的蛋白質(zhì)可作為融合蛋白質(zhì)直接使用，或者在切割并除去融合配偶體部分后作為"純"疏水蛋白使用。當需要移除融合配偶體部分時，最好在融合蛋白質(zhì)的疏水蛋白部分和融合配偶體部分之間摻入潛在的裂解位點(蛋白酶的特異性識別位點)。合適的裂解位點具體包括通過生物信息學工具能夠確定的那些否則將既不存在于疏水蛋白部分也不存在于融合配偶體部分中的肽序列。特別合適的有例如BrCN甲硫氨酸裂解或蛋白酶介導的Xa因子裂解、腸激酶裂解、凝血酶、TEV(煙草蝕紋病毒蛋白酶)裂解。根據(jù)本發(fā)明待用疏水蛋白處理的表面包括選自固化礦物建材、天然石材、鑄石或陶瓷的材料表面。此類表面尤其見于室內(nèi)及室外的建筑領域。本發(fā)明的固化礦物建材為基本上混合無機建材及水后由于化學和/或物理反應固化而得到的石樣塊狀物。起始材料為在空氣和水中均可固化的水硬固化建材，或僅在空氣中固化的空氣固化建材。建材還可以包括例如蒸汽固化建材。此類固化建材的實例具體包括混凝土或灰泥，均可得自從水泥(如硅酸鹽水泥、快干水泥或火山灰水泥)，及其與粗骨料(coarseaggregate)(如沙、砂礫或膨化材料)以及水的混合物。它們還可以已知方式包括其他無機和/或有機輔料，例如混凝土超增塑劑(s叩erplasticizer)。其他固化建材的實例包括內(nèi)部及外部應用的石骨、石灰、底灰。天然石材包括天然存在的石材如砂巖、花崗巖、片麻巖、板巖、石灰?guī)r或大理石。這些類型的石材不僅可用作形狀不規(guī)則的碎石，也可以鑄型建筑成分的形式使用，例如用作建筑石材、窗臺、臺階、欄桿、門柱、鋪面石板、地面石板、屋頂石板、裝飾元素或雕塑。鑄石包括可與天然石材類似地應用、但并非天然來源而是一般由工業(yè)制造的建筑成分。其實例包括瓷磚、煉磚、沙石灰磚、混凝土砌塊、加氣混凝土砌塊或膨脹粘土砌塊。術語"陶資"原則上為本領域技術人員公知。陶瓷為由非金屬無機化合物制備物件的總稱，通?？捎糜诟邷夭僮?。陶瓷可為粗混合物中含至少20%重量粘土材料的粘土陶瓷材料，及特種陶瓷材料，后者不含有粘土材料或僅含有低含量的粘土材料。陶瓷可為細陶瓷或粗陶瓷、多孔或致密陶瓷。陶瓷材料原則上而言可具有釉層。釉質(zhì)可為彩色，也可為無色。粘土陶瓷材料的實例包括建筑陶瓷品，例如砌體墻磚或煉磚、粘土管道、耐火磚、屋頂瓷磚、陶器產(chǎn)品、粘土巖產(chǎn)品、石灰石產(chǎn)品、長石產(chǎn)品、瓷器、硬瓷、軟瓷或瓷磚，可帶有釉質(zhì)。特種陶瓷品的實例包括硅石、粘土結合碳化硅、熔鑄石、氧化物陶資絕緣材料、陶瓷濾器、碳化物陶瓷材料、電瓷、磁性陶瓷或牙科陶瓷。其他有關陶瓷的細節(jié)可見于如Biichner等人，^4wcg"w/sc力eC/re附/e"，VCHVerlag，Weinheim,NewYork1986，431-476頁。表面可由若干種不同材料制成。一個實例為具有由瓷磚和瓷磚灰泥組成表面的瓷磚墻面。表面還可包括不同類型的材料如金屬的包埋部分。根據(jù)本發(fā)明使用時，疏水蛋白本身就可用于處理所^面。然而，優(yōu)選疏水蛋白用作至少一種合適溶劑中的制劑或組合物。對用于實施本發(fā)明的疏水蛋白的選擇并無限制?？梢允褂靡环N疏水蛋白或多種不同的疏水蛋白。本領域技術人員會做出合適的選擇。例如，可以使用融合蛋白質(zhì)如yaad-Xa-dewA-his(SEQIDNO:19)或yaad-Xa-rodA-his(SEQIDNO:21)，其中yaad融合配偶體也可為縮短狀態(tài)。制劑用溶劑可包括水和/或有機溶劑。也可使用溶劑混合物。溶劑的種類取決于疏水蛋白、待處理表面的性質(zhì)以及用途，可由本領域技術人員適當選擇。溶劑優(yōu)選包括水或者水與水混溶有機溶劑的混合物。此類有機溶劑的實例包括水混溶的單羥基醇或多羥基醇，例如曱醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、乙二醇、丙二醇或甘油。也可使用醚醇。實例包括(聚)乙二醇或(聚)丙二醇的單烷基醚，例如乙二醇單丁醚。水溶性及有機溶劑的種類和量由本領域技術人員選定。為制備根據(jù)本發(fā)明所用的組合物，優(yōu)選使用初始合成的、初始分離的和/或初始純化的水性疏水蛋白溶液。4艮據(jù)其純度，它們可能仍包括合成中的助劑殘留物。但也可以通過冷凍干燥實質(zhì)性地初步分離疏水蛋白，而在第二步制劑成型。本領域技術人員可根據(jù)表面的種類和/或其規(guī)劃用途，確定制劑中的疏水蛋白量。但即使相對小量也足以實現(xiàn)防污作用。以重量計占制劑中所有組分總量0.0001%至1%的量即可滿足要求，但本發(fā)明并不僅限于該范圍。該量優(yōu)選為0.0005%至0.5%重量的范圍，更優(yōu)選為0.001%至0.1%重量的范圍。制劑還任選另外包括其他成分，例如混合材料和/或助劑。此類成分的實例具體包括表面活性劑，如陰離子、非離子、兩性和/或陽離子表面活性劑。其他混合材料的實例包括酸或堿，例如羧酸或氨、緩沖體系、聚合物、無機顆粒如Si()2或硅酸鹽、染料、香劑或殺蟲劑。根據(jù)本發(fā)明，將表面與疏水蛋白或包括至少一種疏水蛋白及至少一種溶劑的組合物接觸，對表面進行處理。接觸可以通過例如噴灑、刷洗或滾動實施，或將整個物件浸入制劑中來實施接觸。后者自然只可能用于未安裝的物件。處理時間由本領域技術人員決定。可以持續(xù)幾秒鐘至數(shù)小時。處理后可用例如水漂洗表面，以除去過量的處理液。處理也可以與表面清潔組合實現(xiàn)。通過使用包括至少一種疏水蛋白、至少一種表面活性劑及至少一種溶劑的清潔組合物實現(xiàn)之?？捎谑覝匾韵隆⑹覝鼗蛏邷囟冗M行處理，例如20至100。C，優(yōu)選20至60。C。用組合物處理后，干燥處理表面。處理表面可于準室溫干燥，也可升高溫度干燥。在處理及適用情況下的表面干燥之后，可升高溫度例如高至120。C的溫度進行表面的熱后處理。熱后處理也可與干燥組合進行。熱后處理的溫度范圍優(yōu)選為30至100°C,更優(yōu)選范圍為40至80'C，例如范圍為50至70°C。處理時間由本領域技術人員決定，例如范圍可為1分鐘至10小時。根據(jù)處理的性質(zhì)，可通過用IR輻射器輻照表面或用熱蒸汽鼓吹表面實施熱后處理。本發(fā)明的方法提供了選自固化礦物建材、天然石材、鑄石或陶瓷的表面，所述表面具有包括至少一種疏水蛋白的涂層。該涂層一般包括位于表面上的至少一層疏水蛋白單分子層。本發(fā)明的處理提供了至少一種防污和/或疏水性和/或保存效果。通常情況下可以得到至少兩種益處，特別是組合的疏水性和防污性。即使少量疏水蛋白也具有顯著的效果。通常情況下，用僅含0.01%重量疏水蛋白的組合物處理，即可引起表面的有效改變。可以通過原則上已知的方法確定防污效果，例如通過比較用水沖洗后未處理表面及用疏水蛋白處理后表面的污物可分離性。通過測量接觸角的已知方式能夠確定疏水性程度本發(fā)明的處理對于陶瓷表面例如瓷磚尤其有效。可以同時得到防污及疏水效果。這特別在潮濕的室內(nèi)如浴室中具有顯著的優(yōu)勢。。以下實施例對本發(fā)明進行了舉例說明A部分本發(fā)明所用疏水蛋白的制備及測試實施例1克隆vaad-Hisg/yaaE-Hist的初步工作利用寡核苷酸Hal570和Hal571(Hal572/Hal573)進行聚合酶鏈式反應。所用的模板DNA為細菌枯草芽孢桿菌的基因組DNA。得到的PCR片段包括枯草芽孢桿菌yaaD/yaaE基因的編碼序列，且其末端處分別為Ncol及BglII的限制性切割位點。純化PCR片段并用限制性核酸內(nèi)切酶Ncol及BglII切割之。該DNA片段用作插入物并克隆入Qiagen的pQE60載體中，所述載體事先已由限制性核酸內(nèi)切酶NcoI及BglII線性化。由此得到載體pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5,可用于表達分別由YAAD::HIS6和YAAE::HIS6組成的蛋白質(zhì)。Hal570:gcgcgcccatggctcaaacaggtactgaHal571:gcagatctccagccgcgttcttgcatacHal572:ggccatgggattaacaataggtgtactaggHal573:gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc實施例2vaad疏水蛋白DewA-His^的克隆利用寡核苷酸KaM416和KaM417進行聚合酶鏈式反應。所用的模板DNA為霉菌構巢曲霉的基因組DNA。得到的PCR片段包括疏水蛋白基因dewA的編碼序列，且其N-末端處為Xa因子蛋白酶裂解位點。純化PCR片段并用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI切割之。該DNA片段用作插入物并克隆入事先已由限制性核酸內(nèi)切酶BamHI線性^1的pQE60YAAD#2載體中。由此得到載體#508，可用于表達由YAAD::Xa::dewA::HIS6組成的融合蛋白質(zhì)。KaM416:GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGCKaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC實施例3vaad疏水蛋白RodA-His^的克隆利用寡核苷酸KaM434和KaM435，類似于質(zhì)粒#508克隆質(zhì)粒#513。KaM434:GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGCKaM435:CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG實施例4vaad疏水蛋白BASF1-His^的克隆利用寡核苷酸KaM417和KaM418，類似于質(zhì)粒#508克隆質(zhì)粒#507。所用的模板DNA為人工合成的DNA序列-疏水蛋白BASF1(見附錄)。KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGCKaM418:CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG實施例5vaad疏水蛋白BASF2-His^的克隆利用寡核苷酸KaM417和KaM418，類似于質(zhì)粒#508克隆質(zhì)粒#506。所用的才莫板DNA為人工合成的DNA序列-疏水蛋白BASF2(見附錄)。KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGCKaM418:CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG實施例6yaad疏水蛋白SC3-His^的克隆利用寡核苷酸KaM464和KaM465，類似于質(zhì)粒#508克隆質(zhì)粒#526。所用的才莫板DNA為普通裂褶菌cDNA(見附錄)。KaM464:CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGCKaM465:GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT實施例7重組大腸桿菌菌株vaad疏水蛋白DewA-His^的發(fā)酵于15mlGreiner試管中以表達yaad疏水蛋白DewA-His6的大腸桿菌菌林接種3mlLB液體培養(yǎng)基。37。C在200rpm的搖床中醉育8小時。每次用1ml預培養(yǎng)物接種2個含隔板和250mlLB培養(yǎng)基(+100fig/ml氨節(jié)青霉素)的11Erlenmeyer燒瓶，并在37°C180rpm的搖床中孵育9小時。于201的發(fā)酵罐中用0.5l預培養(yǎng)物(相對水測得OD6o。nml:10)接種13.51LB培養(yǎng)基(+100pg/ml氨節(jié)青霉素)。在OD6。nm為~3.5時加入140ml100mM的IPTG。3小時后，冷卻發(fā)酵罐至10°C，并通過離心除去發(fā)酵液。使用細胞沉淀進一步純化。實施例8重組疏水蛋白融合蛋白質(zhì)的純化(具有C末端His6標簽的疏水蛋白融合蛋白質(zhì)的純化)將100g細胞沉淀(100-500mg疏水蛋白)溶于50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)中，至總體積為200ml并重懸之。用UltraturraxT25型(JankeandKunkel;IKA-Labortechnik)處理懸液10分鐘，然后與500單位benzonase核酸酶(Merck，Darmstadt;訂貨號1.01697.0001)于室溫孵育1小時，以降解核酸。在細胞破碎前，利用玻璃管(glasscartridge)(Pl)進行過濾。為使細胞石皮碎并剪切殘留的基因組DNA，于1500bar進行兩次勻漿(MicrofluidizerM-110EH;MicrofluidicsCorp.)。離心勻漿物(SorvallRC-5B，GSARotor，250ml離心杯，60分鐘，4°C，12000rpm，23000g)，將上清液置于冰上，并將沉淀重懸于100ml磷酸鈉緩沖液(pH7.5)中。離心和重懸步驟重復3次，其中第3次的磷酸鈉緩沖液中含1%SDS。重懸后，將溶液攪拌l小時，然后進行最終離心(SorvallRC-5B，GSARotor，250ml離心杯，60分4中，4°C，12000rpm,23000g)。根據(jù)SDS-PAGE分析，最終離心的上清液中存在疏水蛋白(圖l)。該實驗表明，疏水蛋白很可能以包涵體的形式存在于相應的大腸桿菌細胞中。將50ml含有疏水蛋白的上清液施加在50ml鎳-瓊脂糖高效17-5268-02柱(Amersham)上，其中該柱用50mMTris-Cl緩沖液(pH8.0)平衡。用50mMTris-Cl緩沖液(pH8.0)洗柱，隨后用含有200mM咪唑的50mMTris-Cl緩沖液(pH8.0)洗脫疏水蛋白。為除去咪唑，在50mMTris-Cl緩沖液(pH8.0)中透析溶液。圖l顯示了所制備疏水蛋白的純化泳道l:施加于鎳-瓊脂糖柱的溶液(l:10稀釋)泳道2:滲漏=洗滌步驟的洗脫物泳道3-5:OD280峰值處的洗脫級分圖1的疏水蛋白分子量為約53kD。某些較小的條帶代表疏水蛋白的降解產(chǎn)物。實施例9性能測試；對疏水蛋白改變水滴在玻璃上的接觸角的表征物質(zhì)玻璃(窗玻璃，StiddeutscheGlas，Maimheim，Germany):疏水蛋白濃度100pg/ml在50mM醋酸鈉(pH4)+0.1%重量Tween20中溫育玻璃片過夜(溫度80。C)然后用疏水蛋白涂層在蒸餾水中沖洗玻璃片然后溫育10分4中/8(TC/l。/。重量的水性十二烷^^克酸鈉(SDS)蒸餾水溶液蒸餾水洗滌樣品風干(室溫)，并于室溫測定5pl水滴的接觸角(度數(shù))。在DataphysicsContactAngleSystemOCA15+，軟件SCA20.2.0.(2002年11月)中確定接觸角測量值。根據(jù)生產(chǎn)商的說明進行測量。未處理玻璃的接觸角為30±5°;實施例8的功能性疏水蛋白(yaad-dewA-his6)涂層的接觸角為75±5。。B部分疏水蛋白在陶瓷表面防污涂層中的應用所用溶液利用根據(jù)實施例8制備的融合蛋白質(zhì)yaad-Xa-dewA-his(SEQIDNO:19)的水溶液進行性能測試。疏水蛋白在溶液中的濃度為100嗎/ml(0.01%重量)。所用陶瓷表面陶瓷瓷磚、閃耀白，10cmx15cm(來自Novocker),用乙醇和7JC擦拭。所用污物利用IKW砂石土(ballastsoil)實施測試(根據(jù)Seifen，F(xiàn)ette，Ole，Wachse(SOFW)-Journal,124巻，14/98，1029頁)。處理方法將2g上述濃度為100嗎/ml的水性疏水蛋白溶液滴至每塊資磚上(1.3nm疏水蛋白/cm2)，并輕輕用布使其分布于整個表面。然后資磚風干24小時。隨后用水沖洗瓷磚，并在裝有水的玻璃杯中放置3x10分鐘。每次沖洗均使用新鮮水。然后將瓷磚垂直風干。接觸角的測量和防污效果經(jīng)處理瓷磚上水滴的接觸角測量值為56°(10次測量的均值)。相比之下，未處理瓷磚的接觸角為20。。因此資磚已被顯著疏水化。通過轉移移液管分別用50、100及200pgIKW砂石土弄臟經(jīng)處理資磚以及作為對比用的未處理瓷磚，并室溫干燥l小時。然后每次用500ml水3次沖洗瓷磚。盡管這樣不能將污物從未處理表面上離解下來，但在疏水蛋白預處理的資磚上卻觀察到部分污物的脫離。因此，用疏水蛋白預處理減少了污物在陶資表面的附著，并導致陶覺表面的疏水化。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>權利要求1.疏水蛋白在處理選自固化礦物建材、天然石材、鑄石或陶瓷的材料表面中的用途。2.權利要求l的用途，其中通過使用包括溶劑及至少一種疏水蛋白的組合物實現(xiàn)所述處理。3.處理表面的方法，包括將所述表面與至少一種疏水蛋白接觸，其中所述表面包括選自固化礦物建材、天然石材、鑄石或陶瓷的材料表面。4.權利要求3的方法，其中通過使用包括溶劑及至少一種疏水蛋白的組合物實現(xiàn)所述處理。5.權利要求3或4的方法，其中所述溶劑包括水。6.權利要求3至5中任一項的方法，其中所述組合物中疏水蛋白的量以重量計占所述制劑所有組分總量0.0001%至1%的范圍。7.由至少一種疏水蛋白涂層的表面，所述表面包括選自固化礦物建材、天然石材、鑄石或陶瓷的材料表面。8.權利要求7的涂層表面，其特征在于防污。9.權利要求7或8的涂層表面，其特征在于疏水性。全文摘要本發(fā)明涉及疏水蛋白在處理固化礦物建材、天然石材、鑄石或陶瓷表面中的用途，處理此類表面的方法，以及具有含疏水蛋白涂層的固化礦物建材、天然石材、鑄石或陶瓷表面。文檔編號B08B17/00GK101151106SQ200680010238公開日2008年3月26日申請日期2006年3月28日優(yōu)先權日2005年3月30日發(fā)明者C·博爾施韋勒,H·貝克爾,H-G·勒邁爾,M·考羅什,T·薩布科夫斯基,U·鮑斯申請人:巴斯福股份公司