鹽酸阿比多爾在制備預(yù)防和治療抗中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒的藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了以阿比多爾為主要成分的藥物及其在藥學(xué)上可接受的鹽在抗中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒感染方面的應(yīng)用。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)鹽酸阿比多爾對中東呼吸道病毒有抗病毒作用，可阻斷中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒感染宿主細(xì)胞，可用作治療抗中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒感染方面的疾病治療。
【專利說明】
鹽酸阿比多爾在制備預(yù)防和治療抗中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀 病毒的藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明是關(guān)于鹽酸阿比多爾在抗中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒感染方面的應(yīng)用， 屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 中東呼吸綜合征(Middle East Respiratory Syndrome，MERS)，又稱新沙士，2012 年首次在倫敦發(fā)現(xiàn)，并命名為1號新型冠狀病毒[Lodonl novel CoV 2012]，其結(jié)構(gòu)和SARS 的病毒相似，源于中東。2013年5月23日，世界衛(wèi)生組織將新型冠狀病毒感染命名為"中東呼 吸綜合征"。冠狀病毒在系統(tǒng)分類上屬冠狀病毒科（Coronaviridae)冠狀病毒屬 (Coronavirus)。冠狀病毒屬的病毒是具外套膜(envelope)的正鏈單股RNA病毒，直徑約80 ~120nm，其遺傳物質(zhì)是所有RNA病毒中最大的，只感染人、鼠、豬、貓、犬、禽類脊椎動物。冠 狀病毒的一個變種是引起非典型肺炎的病原體，屬于RNA病毒。冠狀病毒最先是1937年從雞 身上分離出來，病毒顆粒的直徑60_200nm，平均直徑為lOOnm，呈球形或橢圓形，具有多形 性。病毒有包膜，包膜上存在棘突，整個病毒像日冕，不同的冠狀病毒的棘突有明顯的差異。 在冠狀病毒感染細(xì)胞內(nèi)有時(shí)可以見到管狀的包涵體[Nederlands Tijdschrift Voor Geneeskunde,2014,158(158):A8119-A8119]〇
[0003] 中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)與其它冠狀病毒類似，其形態(tài)結(jié)構(gòu)為圓 形或卵圓形，病毒顆粒直徑大約60~220nm，核心為單股正鏈RNA，病毒的衣殼外面包含有糖 蛋白組成的刺突樣的結(jié)構(gòu)，因其覆蓋表面而使得整個病毒粒子在電鏡下如皇冠樣的形狀， 因而得名冠狀病毒。中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒的宿主源于中東單峰駱駝，其全基因組 大小約為301Kb，至少包含有10個開放閱讀框(open reading frame，0RF)，分別編碼一個大 的復(fù)制酶多聚蛋白、表面刺突糖蛋白、小包膜蛋白、外膜蛋白、核衣殼蛋白、及5個非結(jié)構(gòu)蛋 白等。其中由ORFla/ORFlb編碼的復(fù)制酶多聚蛋白包含兩個多聚蛋白ppla和pplab，然后由 蛋白酶剪切為15或16個非結(jié)構(gòu)蛋白產(chǎn)物NSP1-NSP16,而NSP12即為RNA依賴的RNA聚合酶 [New England Journal of Medicine,2013,369(5):407-416]〇
[0004] 自2012年下半年開始，沙特阿拉伯最先開始零星出現(xiàn)患有急性呼吸系統(tǒng)綜合征并 伴隨腎功能衰竭的病人，病原體檢測顯示這些患者均染有一種新病毒。它與人們熟知的非 典病毒同屬冠狀病毒，但類型不同，其傳染性弱于非典病毒，但病死率比非典高，達(dá)40%。此 后，約旦、卡塔爾、阿聯(lián)酋、突尼斯乃至法國、德國、英國、美國先后發(fā)現(xiàn)該病確診病例。世界 衛(wèi)生組織將這一新型冠狀病毒命名為"中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒"。值得特別關(guān)注的 是，這個疾病到現(xiàn)在沒有可用的疫苗和藥物治療方法。在針對東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒 (MERS-CoV)病毒藥物研發(fā)方面，我們試探的去研究鹽酸阿比多爾抗MERS-CoV病毒作用。
[0005] 鹽酸阿比多爾，已經(jīng)被證實(shí)對多種病毒具有抗病毒廣譜作用[Arbidol :a broad-spectrum antiviral compound that blocks viral fusion.Curr Med Chem.2008,15 (10) : 997-1005]。其廣譜性的作用機(jī)制源于它存在膜融合抑制作用[Membrane fusion .Nature Structural&MoIecuIar Biology · 2008，15(7): 658-64]?；谒淖饔脵C(jī) 制，我們假設(shè)他對中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒依然有抗病毒作用機(jī)制。所以我們開展鹽 酸阿比多爾在中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒抗病毒藥效的應(yīng)用性研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供鹽酸阿比多爾在制備預(yù)防或治療抗中東呼吸系統(tǒng)綜合征 冠狀病毒的藥物中的應(yīng)用。
[0007] 具體而言，為解決的本發(fā)明的技術(shù)問題，采用如下技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明提供了如結(jié)構(gòu)式(I)所示的鹽酸阿比多爾在制備預(yù)防和治療抗中東呼吸系 統(tǒng)綜合征冠狀病毒的藥物中的應(yīng)用。
[0009]
(I)
[0010] 所述的藥物是以結(jié)構(gòu)式(I)所示的鹽酸阿比多爾作為有效成分的藥物。
[0011]
(I)
[0012] 上述的應(yīng)用中，所述的藥物是以結(jié)構(gòu)式（I)所示的鹽酸阿比多爾作為有效成分的 單體化合物
[0013]
⑴。
[0014] 所述藥物為結(jié)構(gòu)式(I)所示的鹽酸阿比多爾和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
[0015] 所述藥物的劑型為丸劑、片劑、膠囊或口服液。
[0016] 本發(fā)明的化合物的體外半數(shù)細(xì)胞毒性評價(jià)模型為MTT法半數(shù)細(xì)胞毒性的檢測評價(jià) 模型。
[0017]本發(fā)明所述的MTT法半數(shù)細(xì)胞毒性評價(jià)模型是指使用MTT染色劑能與活細(xì)胞線粒 體結(jié)合，可定量檢測出細(xì)胞的半數(shù)細(xì)胞毒性濃度(TC50)。
[0018]本發(fā)明化合物外抗病毒給藥模型分別為預(yù)防給藥模型，和治療給藥模型及預(yù)防與 治療混合模式。
[0019] 本發(fā)明所述的預(yù)防與治療混合模型是用200yL的倍比稀釋的藥物長滿單層的24孔 板細(xì)胞板作用24小時(shí)。后去除藥物，加200yL病毒滴度為100TCID 5Q/0.1mL的病毒液吸附兩小 時(shí)，去病毒液，換200yL的倍比稀釋的藥物的維持培養(yǎng)基，48小時(shí)后，觀察細(xì)胞病變，收集病 毒液，測試各組的TCID 5q病毒滴度，評價(jià)藥物抑制率。
[0020] 本發(fā)明通過運(yùn)用體外三種抗病毒藥效評價(jià)模型，評價(jià)鹽酸阿比多爾化合物對中東 呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒抑制作用，首次發(fā)現(xiàn)鹽酸阿比多爾對中東呼吸道病毒有抗病毒作 用，可阻斷中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒感染宿主細(xì)胞，可用作治療抗中東呼吸系統(tǒng)綜合 征冠狀病毒感染方面的疾病治療。
【附圖說明】
[0021] 圖1是鹽酸阿比多爾抗中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒感染模型。長滿單層VERO細(xì) 胞的24孔細(xì)胞板模型，黑色孔代表含孵育病毒及藥物藥效組，無色孔代表無藥藥物作用的 病毒對照組，陰影線孔代表含無病毒孵育的藥物毒性組。
【具體實(shí)施方式】
[0022]實(shí)施例1.藥物評價(jià)原理 [0023] 病毒擴(kuò)增
[0024] 將非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO)按3X105個/孔，接種至96孔板中，置37°C，5%C02培養(yǎng)，待 長滿單層。將中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒臨床分離株100倍稀釋接種到長滿單層細(xì)胞的 96孔板中，置37°C，5%C02培養(yǎng)兩天(含正常對照組）。
[0025]兩天后，病變程度高達(dá)75%以上，置_80°C超低溫冰箱，反復(fù)凍融一次，收集細(xì)胞擴(kuò) 增的病毒液，3000r/min離心30分鐘，去沉淀物，分裝小管置-80°C超低溫冰箱長期保存。 [0026]中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒半數(shù)致死滴度(TCID 5Q)測定 [0027] 將非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO)按3X105個/孔，接種至96孔板中，置37°C，5%C02培養(yǎng)，待 長滿單層。加入十倍倍比稀釋的MERS-CoV病毒液，IOOyL/孔，37°C孵育2小時(shí)或3000轉(zhuǎn)離心1 小時(shí);棄去上清，加入新鮮培養(yǎng)液，IOOyL/孔，2日后觀察結(jié)果，記錄CPE。并用Reed-Muench計(jì) 算病毒半數(shù)致死滴度（TCID5Q) [Reed LJ，Muench Η. A simple method of estimating fifty percent endpoints.Am J Hyg,1938,27(3):493-497]〇
[0028]鹽酸阿比多爾抗中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒藥效評價(jià)
[0029] 96孔板單層細(xì)胞以PBS洗滌1次，加入含約IOOTCID5q的病毒稀釋液IOOyL/孔，37°C、 5 % CO2培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)，棄去病毒液，加入2倍梯度稀釋的藥物，每個濃度設(shè)置4個復(fù)孔， 以最大無毒濃度為藥物起始濃度，在34°C、5%C02培養(yǎng)箱中孵育2天。記錄細(xì)胞病變 (Cytopathogenic Effect，CPE)。細(xì)胞出現(xiàn)CPE按6級標(biāo)準(zhǔn)記錄（表1)。記錄CPE后，用MTT染 色，進(jìn)行OD值測定。用Reed-Muench法計(jì)算藥物半數(shù)有效濃度（IC5Q)，計(jì)算治療指數(shù) (Selective Index，SI): SI = TC5Q/IC5Q)。[參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)，徐叔云主編》，治療指數(shù) (SI)M表示有效]。
[0030] 鹽酸阿比多爾藥物毒性評價(jià)
[0031] 鹽酸阿比多爾粉末用DMSO溶解后，加入培養(yǎng)液稀釋至20mg/mL，DMS0終濃度為1%， 經(jīng)0.22μπι濾膜過濾后置4°C保存;過濾后置4°C保存。按每孔約2.5 X IO4細(xì)胞接種到96孔板， 24~48h后待細(xì)胞長成單層后，棄去培養(yǎng)液，加入不同稀釋度的藥物100μL孔，正常細(xì)胞對 照孔加入I OOyL/孔MEM，37 °C 5 %⑶2繼續(xù)培養(yǎng)2~5天，每孔加 MTT溶液（5mg/mL) 20yL，置37 °C，5%CO2溫箱中繼續(xù)孵育4小時(shí)。吸棄培養(yǎng)上清液，每孔加 IOOyL二甲基亞砜(DMSO)，低速 振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值。 按照下列公式計(jì)算抑制率，并用Reed-Muench法 [2]計(jì)算50%毒性濃度為藥物半數(shù)有毒濃度 (TC5q)。計(jì)算抑制率=(正常組一給藥組)/正常組X 100%
[0032]鹽酸阿比多爾藥效評價(jià)
[0033]用200yL的倍比稀釋的藥物長滿單層的24孔板細(xì)胞板作用24小時(shí)。后去除藥物，加 200yL病毒滴度為100TCID5Q/0.1mL的病毒液吸附兩小時(shí)，去病毒液，換200yL的倍比稀釋的 藥物的維持培養(yǎng)基，48小時(shí)后，觀察細(xì)胞病變，收集病毒液，測試各組的TCID 5q病毒滴度，評 價(jià)藥物抑制率。
[0034]實(shí)施例2.鹽酸阿比多爾抗病毒模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 [0035] 鹽酸阿比多爾藥物毒性評價(jià)
[0036] 鹽酸阿比多爾以DMSO溶解后，完全溶解，無色澄清，加入培養(yǎng)液過濾后，有少許白 色析出，震蕩均勻溶液澄清。鹽酸阿比多爾在非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO)的半數(shù)有毒濃度(TC50) 為(61.3±0.02)μΜ，最大無毒濃度為48.25μΜ。
[0037]中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒半數(shù)致死滴度(TCID5Q)測定
[0038]通過Re e d -Mu e n c h方法學(xué)，檢測出擴(kuò)增的中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒為 105-25TCID5〇/0.1mL〇
[0039 ]鹽酸阿比多爾抗中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒藥效評價(jià) [0040] 通過MDCK細(xì)胞病變抑制法及MTT法對鹽酸阿比多爾進(jìn)行藥效評價(jià)，對中東呼吸系 統(tǒng)綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)的半數(shù)有效濃度IC50分別為12.82 ± 1.12μΜ、16.27 ± 1.08μ M，治療指數(shù)分別是4.78、3.77,有效(見表1)
[0041 ] 表1 .MDCK細(xì)胞病變抑制法及MTT法對阿比多爾進(jìn)行藥效評價(jià)
[0043 ]鹽酸阿比多爾抗中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒活性評價(jià)
[0044] 預(yù)防與治療混合模型，L0GTCID5Q/30yL結(jié)果顯示，45.12μΜ濃度的鹽酸阿比多爾的 上清液的MERS-CoV病毒為0，完全抑制，22.56μΜ、11.28μΜ濃度的鹽酸阿比多爾的上清液清 液的MERS-CoV病毒分別為1.38 ± 0.01、3.6 ± 0.02，說明鹽酸阿比多爾阻斷中東呼吸系統(tǒng)綜 合征冠狀病毒感染活性，具體見表2。
[0045] 表2鹽酸阿比多爾阻斷中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒感染活性
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 如結(jié)構(gòu)式（1)所示的鹽酸阿比多爾在制備預(yù)防和治療抗中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病 毒的藥物中的應(yīng)用，其中：其中冊-代表徑基，化-代表漠。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物是W結(jié)構(gòu)式（I)所示的鹽酸阿比多 爾作為有效成分的藥物，3. 根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物為鹽酸阿比多爾及其藥學(xué)可可接受的 鹽及其在藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。4. 一種用于預(yù)防和治療抗中東呼吸綜合癥冠狀病毒的的藥物組合物，其特征在于，所 述的藥物組合物含有如式(I)所示的鹽酸阿比多爾，5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物W式（I)所示的 鹽酸阿比多爾作為有效成份，6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物含有W式（I)所 示的鹽酸阿比多爾及其藥學(xué)可可接受的鹽及其在藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
【文檔編號】A61K31/4045GK106074506SQ201610421259
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月13日 公開號201610421259.2, CN 106074506 A, CN 106074506A, CN 201610421259, CN-A-106074506, CN106074506 A, CN106074506A, CN201610421259, CN201610421259.2
【發(fā)明人】楊子峰, 胡文輝, 李潤峰, 趙金存, 趙昕, 鐘南山
【申請人】廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院, 廣州呼吸疾病研究所, 中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院