一種生物補(bǔ)片的交聯(lián)方法以及交聯(lián)生物補(bǔ)片的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及組織工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種生物補(bǔ)片的交聯(lián)方法以及交聯(lián)生物補(bǔ)片。該交聯(lián)方法工藝簡單，交聯(lián)效率較高，能夠保留膠原的天然三維結(jié)構(gòu)，所獲得的交聯(lián)生物補(bǔ)片的機(jī)械強(qiáng)度和柔韌性較高，長期保存不會出現(xiàn)發(fā)黃以及易于鈣化的現(xiàn)象。本發(fā)明實施例提供一種生物補(bǔ)片的交聯(lián)方法，所述生物補(bǔ)片為脫細(xì)胞后的細(xì)胞外基質(zhì)，包括：步驟1)將所述生物補(bǔ)片置于含有脫水縮合劑的溶液中進(jìn)行脫水縮合反應(yīng)；其中，所述脫水縮合劑為碳化二亞胺；或者，將所述生物補(bǔ)片置于含有天然生物交聯(lián)劑的溶液中，使得所述生物補(bǔ)片上的膠原分子與所述天然生物交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)；步驟2)對所述生物補(bǔ)片進(jìn)行清洗，停止反應(yīng)。
【專利說明】
一種生物補(bǔ)片的交聯(lián)方法以及交聯(lián)生物補(bǔ)片
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及組織工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種生物補(bǔ)片的交聯(lián)方法以及交聯(lián)生物補(bǔ)片。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，生物補(bǔ)片已用于各種組織器官的小面積損傷修復(fù)中，例如:皮膚、胸膜、顱骨、腫瘤等手術(shù)后的小面積損傷填補(bǔ)均會用到生物補(bǔ)片。在乳房整形手術(shù)中，患者大面積肌肉缺失，在將生物補(bǔ)片植入機(jī)體內(nèi)時，能夠起到固定支撐的作用，從而能夠減少乳房假體移位、下垂，減小患者的機(jī)體排斥反應(yīng)。
[0003]但是，生物補(bǔ)片在用于臨床時，由于其機(jī)械強(qiáng)度較低，降解速率較快，仍然容易引發(fā)術(shù)后并發(fā)癥，難以滿足臨床需求，鑒于此，人們通過在生物補(bǔ)片內(nèi)引入交聯(lián)劑，以改變膠原分子的結(jié)構(gòu)來提高生物補(bǔ)片的機(jī)械性能和柔韌性。
[0004]現(xiàn)有的交聯(lián)方法中最為常見的為:采用戊二醛通過縮醛反應(yīng)來進(jìn)行交聯(lián)固定，以及采用環(huán)氧化合物進(jìn)行交聯(lián)固定，醛類物質(zhì)與環(huán)氧化合物均為人工合成，毒性相對較高，尤其是采用縮醛反應(yīng)所獲得的生物補(bǔ)片降解時會釋放出醛的殘留毒性，表現(xiàn)出較大的細(xì)胞毒性。
[0005]專利號為CN200510120796.5中采用非醛類交聯(lián)劑對所述生物補(bǔ)片進(jìn)行交聯(lián)固定，以提高生物補(bǔ)片的機(jī)械強(qiáng)度以及韌性，具體的，采用酰胺以及環(huán)氧化物與膠原分子中的氨基、巰基反應(yīng)生成環(huán)氧鍵，以減少體內(nèi)酶對生物補(bǔ)片的攻擊位點，在此過程中，所述環(huán)氧化物不穩(wěn)定，容易發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，并且所述環(huán)氧化物與膠原分子進(jìn)行反應(yīng)時，所述膠原分子需要與所述環(huán)氧化物中的兩個或者多個環(huán)氧鍵結(jié)合才能交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，反應(yīng)時間長，交聯(lián)效率較低，難以實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，所獲得的產(chǎn)物在植入機(jī)體內(nèi)時容易發(fā)生鈣化現(xiàn)象，長期存在下變硬、變脆，從而使得力學(xué)性能降低，難以與原生物質(zhì)長合在一起，雖然在該專利中，通過引入聚氨酯、聚酰胺、聚酯、聚乳酸等高分子聚合物鏈以提高生物補(bǔ)片的韌性，但是，該生物補(bǔ)片在植入機(jī)體內(nèi)時容易引起三維結(jié)構(gòu)的塌陷，發(fā)生纖維包裹，使得該生物補(bǔ)片與原生組織的降解速度不一致，難以與原生物質(zhì)長合以及容易出現(xiàn)炎癥反應(yīng)的缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的主要目的在于，提供一種生物補(bǔ)片的交聯(lián)方法以及交聯(lián)生物補(bǔ)片。該交聯(lián)方法工藝簡單，交聯(lián)效率較高，能夠保留膠原的天然三維結(jié)構(gòu)，所獲得的交聯(lián)生物補(bǔ)片的機(jī)械強(qiáng)度和柔韌性較高，長期保存不會出現(xiàn)發(fā)黃以及易于鈣化的現(xiàn)象。
[0007]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0008]—方面，本發(fā)明實施例提供一種生物補(bǔ)片的交聯(lián)方法，包括:
[0009]步驟I)將脫細(xì)胞后的細(xì)胞外基質(zhì)置于含有脫水縮合劑的溶液中進(jìn)行脫水縮合反應(yīng)，其中，所述脫水縮合劑為碳化二亞胺；
[0010]或者，將脫細(xì)胞后的細(xì)胞外基質(zhì)置于含有天然生物交聯(lián)劑的溶液中，使得所述生物補(bǔ)片上的膠原分子與所述天然生物交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)；
[0011]步驟2)對所述生物補(bǔ)片進(jìn)行清洗，停止反應(yīng)。
[0012]可選的，所述碳化二亞胺為1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽。
[0013]優(yōu)選的，所述含有脫水縮合劑的溶液中還添加有:N-羥基苯并三氮唑或N-羥基-琥珀酸酰胺。
[0014]進(jìn)一步優(yōu)選的，所述含有脫水縮合劑的溶液中還添加有酸性緩沖劑，使得反應(yīng)體系的pH值為4.5-6.5。
[0015]可選的，所述酸性緩沖劑為2-N嗎啉乙磺酸。
[0016]優(yōu)選的，所述天然生物交聯(lián)劑選自花青素、核黃素、核糖和京尼平中的任意一種。
[0017]可選的，所述步驟2)中的清洗溶液選自磷酸鹽緩沖溶液、氯化鈉溶液、hank液和水中的一種或者幾種。
[0018]優(yōu)選的，所述步驟I)中脫水縮合反應(yīng)的溫度為20_30°C，反應(yīng)時間為6_12h。
[0019]可選的，所述步驟I)中交聯(lián)反應(yīng)的溫度為30-37°C，反應(yīng)時間為12h-48h。
[0020]另一方面，本發(fā)明實施例提供一種通過上述所述的方法制備獲得的交聯(lián)生物補(bǔ)片。
[0021]本發(fā)明實施例提供的一種生物補(bǔ)片的交聯(lián)方法以及交聯(lián)生物補(bǔ)片。該交聯(lián)方法工藝簡單，交聯(lián)效率較高，其中，所述生物補(bǔ)片中的膠原分子在脫水縮合劑的存在下發(fā)生自身脫水縮合反應(yīng)，使得膠原分子的羧基和氨基生成分子內(nèi)或者分子間的酰胺鍵，而脫水縮合劑并沒有成為實際交聯(lián)的一部分，在步驟2)中可以清洗掉，從而能夠保持膠原的天然三維結(jié)構(gòu)，細(xì)胞毒性小，而天然生物交聯(lián)劑幾乎無細(xì)胞毒性，與人工合成的化合物相比，所獲得的生物補(bǔ)片的生物相容性好，安全性好，通過上述交聯(lián)方法所獲得的生物補(bǔ)片具有較高的機(jī)械強(qiáng)度和柔韌性，長期保存不會出現(xiàn)發(fā)黃以及易于鈣化的現(xiàn)象。
【附圖說明】
[0022]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖。
[0023]圖1為本發(fā)明實施例提供的一種生物補(bǔ)片的交聯(lián)方法的流程圖；
[0024]圖2為本發(fā)明實施例提供的一種碳化二亞胺與膠原分子發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)的機(jī)理圖；
[0025]圖3為本發(fā)明實施例提供的在N-羥基-琥珀酸酰胺存在下碳化二亞胺與膠原分子發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)的機(jī)理圖；
[0026]圖4為本發(fā)明實施例提供的實施例1和對照例在不同反應(yīng)階段的收縮溫度增加量與自由氨基的消耗量的關(guān)系曲線圖；
[0027]圖5為本發(fā)明實施例提供的交聯(lián)之前的生物補(bǔ)片的DSC圖譜；
[0028]圖6為本發(fā)明實施例提供的生物補(bǔ)片A的DSC圖譜。
【具體實施方式】
[0029]現(xiàn)將詳細(xì)地提供本發(fā)明實施方式的參考，其一個或多個實例描述于下文。提供每一實例作為解釋而非限制本發(fā)明。實際上，對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯而易見的是，可以對本發(fā)明進(jìn)行多種修改和變化而不背離本發(fā)明的范圍或精神。例如，作為一個實施方式的部分而說明或描述的特征可以用于另一實施方式中，來產(chǎn)生更進(jìn)一步的實施方式。因此，基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0030]本發(fā)明實施例所涉及的材料均可以通過商業(yè)途徑或通過
【申請人】獲取。
[0031 ] 一方面，本發(fā)明實施例提供一種生物補(bǔ)片的交聯(lián)方法，參見圖1，包括:
[0032]步驟I)將脫細(xì)胞后的細(xì)胞外基質(zhì)置于含有脫水縮合劑的溶液中進(jìn)行脫水縮合反應(yīng)，其中，所述脫水縮合劑為碳化二亞胺；
[0033]或者，將脫細(xì)胞后的細(xì)胞外基質(zhì)置于含有天然生物交聯(lián)劑的溶液中，使得所述生物補(bǔ)片上的膠原分子與所述天然生物交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)；
[0034]步驟2)對所述生物補(bǔ)片進(jìn)行清洗，停止反應(yīng)。
[0035]所述碳化二亞胺是一種多肽縮合劑，碳化二亞胺與膠原分子進(jìn)行交聯(lián)的反應(yīng)機(jī)理參見圖2所示，碳化二亞胺I與膠原分子2的羧基耦合形成O-異酰基脲活化中間體3，這一活化中間體3受到膠原分子2中-NH2的進(jìn)攻脫去，形成酰胺4和脲5，活性中間體3可以與另一膠原分子2的羧酸反應(yīng)生成酸酐6，酸酐6與膠原分子2中的-NH2反應(yīng)也得到酰胺4，在此過程中，碳化二亞胺僅起到脫水縮合作用，并不成為交聯(lián)產(chǎn)物的一部分。
[0036]本發(fā)明實施例提供的一種生物補(bǔ)片的交聯(lián)方法。該交聯(lián)方法工藝簡單，交聯(lián)效率較高，其中，所述脫細(xì)胞后的細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原分子在脫水縮合劑的存在下發(fā)生自身脫水縮合反應(yīng)，使得膠原分子的羧基和氨基生成分子內(nèi)或者分子間的酰胺鍵，而脫水縮合劑并沒有成為實際交聯(lián)的一部分，在步驟2)中可以清洗掉，從而能夠保持膠原的天然三維結(jié)構(gòu)，細(xì)胞毒性小，而天然生物交聯(lián)劑幾乎無細(xì)胞毒性，與人工合成的化合物相比，所獲得的生物補(bǔ)片的生物相容性好，安全性好，通過上述交聯(lián)方法所獲得的生物補(bǔ)片具有較高的機(jī)械強(qiáng)度和柔韌性，長期保存不會出現(xiàn)發(fā)黃以及易于鈣化的現(xiàn)象。
[0037]本發(fā)明的一實施例中，所述碳化二亞胺為1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽。
[0038]由于1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽的細(xì)胞毒性小，具有良好的水溶性，可以將1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽與膠原分子在水溶液中進(jìn)行脫水縮合反應(yīng)，并且在反應(yīng)完成之后1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽容易用水清洗，能夠進(jìn)一步減少碳化二亞胺的殘留，從而進(jìn)一步減小細(xì)胞毒性反應(yīng)。
[0039]本發(fā)明的一實施例中，所述含有脫水縮合劑的溶液中還添加有:N-羥基苯并三氮唑或N-羥基-琥珀酸酰胺。
[0040]由于碳化二亞胺在與膠原分子中的羧基反應(yīng)生成O-異?；寤罨虚g體3時，參見圖2，該活化中間體3不穩(wěn)定，會重排生成N-?；?副產(chǎn)物，當(dāng)所述脫水縮合劑包括N-羥基苯并三氮唑或N-羥基-琥珀酸酰胺時，N-羥基苯并三氮唑與N-羥基-琥珀酸酰胺可以與0-異?；寤罨虚g體3的羧基形成較為穩(wěn)定的中間體，在此以N-羥基-琥珀酸酰胺為例進(jìn)行說明，參見圖3，N-羥基-琥珀酸酰胺8可以與O-異酰基脲活化中間體3的羧基形成較為穩(wěn)定的中間體9，所述中間體9與膠原分子2中的氨基反應(yīng)生成酰胺4，從而能夠提高產(chǎn)率，減少副反應(yīng)的發(fā)生。
[0041]本發(fā)明的一實施例中，所述含有脫水縮合劑的溶液中還添加有酸性緩沖劑，使得反應(yīng)體系的pH值為4.5-6.5。
[0042]在上述pH值下，能夠最大程度上提高交聯(lián)效率與交聯(lián)度。
[0043]其中，對所述酸性緩沖液的種類不做限定。
[0044]本發(fā)明的一實施例中，所述酸性緩沖液為2-N嗎啉乙磺酸。
[0045]在碳化二亞胺/N-羥基-琥珀酸酰胺/2-N嗎啉乙磺酸體系中，能夠提高脫水縮合的反應(yīng)速度，縮短反應(yīng)時間。
[0046]其中，對所述天然生物交聯(lián)劑的種類不做限定。
[0047]本發(fā)明的一實施例中，所述天然生物交聯(lián)劑選自花青素、核黃素、核糖和京尼平中的任意一種。
[0048]其中，花青素是純天然的抗衰老的營養(yǎng)補(bǔ)充劑，能夠營養(yǎng)皮膚，增強(qiáng)皮膚免疫力，通過對彈性蛋白酶和膠原蛋白酶的抑制使皮膚變得光滑而富有彈性，在將花青素引入細(xì)胞外基質(zhì)中時，由于花青素分子中含有較多的酚羥基、醇羥基以及醚鍵，能夠與所述細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原分子中的羥基、氨基和羧基形成氫鍵，幫助膠原蛋白纖維形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，從而提高細(xì)胞外基質(zhì)的機(jī)械強(qiáng)度，同時，所述花青素能夠為機(jī)體再生提供營養(yǎng)，從而加快機(jī)體恢復(fù)，減慢所述生物補(bǔ)片在體內(nèi)的降解速率;核黃素又稱為維生素B2，為一種安全性較高的天然生物交聯(lián)劑，核黃素分子可以在膠原纖維之間形成一系列生化“橋梁”，從而能夠提高細(xì)胞外基質(zhì)的交聯(lián)度，提高細(xì)胞外基質(zhì)的機(jī)械強(qiáng)度;核糖是一種五碳醛糖，核糖分子中存在醚鍵、醇羥基，同樣能夠與所述細(xì)胞外基質(zhì)的膠原分子的氨基和羧基產(chǎn)生氫鍵，從而能夠形成交聯(lián)產(chǎn)物;所述京尼平是一種從梔子中提取的環(huán)烯醚萜苷，是一種天然的生物交聯(lián)劑，其毒性遠(yuǎn)低于人工合成交聯(lián)劑，例如，戊二醛、環(huán)氧化合物等，所述京尼平與膠原分子進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)時，機(jī)理為:所述京尼平上的烯碳原子受到膠原分子的氨基的親核進(jìn)攻，開環(huán)形成雜環(huán)胺化合物，京尼平上的酯基團(tuán)與氨基反應(yīng)生成酰胺釋放出甲醇，可見，所述京尼平可以與所述細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而能夠提高細(xì)胞外基質(zhì)的機(jī)械強(qiáng)度。
[0049]其中，對所述步驟I)中脫水縮合反應(yīng)的溫度和時間不做限定。
[0050]本發(fā)明的一實施例中，所述步驟I)中脫水縮合反應(yīng)的溫度為20_30°C，反應(yīng)時間為
6-12ho
[0051]該反應(yīng)較為溫和，交聯(lián)度效率較高。在反應(yīng)過程中，可以通過實時取樣的方式對反應(yīng)的交聯(lián)效率進(jìn)行檢測。
[0052]具體的，與現(xiàn)有技術(shù)中的環(huán)氧化合物相比，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽與膠原分子發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)時，每減少一個氨基就生成一個酰胺鍵，而一個環(huán)氧化合物中的兩個環(huán)氧基需要與兩個氨基發(fā)生反應(yīng)才能夠形成交聯(lián)產(chǎn)物，由于反應(yīng)過程中分子間的相互作用，環(huán)氧化物與兩個氨基均反應(yīng)所消耗的能量大于1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽消耗兩個氨基所消耗的能量，因此，交聯(lián)效率較高，反應(yīng)條件較為溫和。
[0053]其中，對所述步驟I)中交聯(lián)反應(yīng)的溫度和時間不做限定。
[0054]本發(fā)明的一實施例中，所述步驟I)中交聯(lián)反應(yīng)的溫度為30-37°C，反應(yīng)時間為12h_48h0
[0055]該反應(yīng)也較為溫和，交聯(lián)效率也較高。同樣的，在反應(yīng)過程中，可以通過實時取樣的方式對反應(yīng)的交聯(lián)效率進(jìn)行檢測，具體反應(yīng)機(jī)理不再贅述。
[0056]其中，對所述反應(yīng)過程中交聯(lián)效率的檢測方法不做限定。所述交聯(lián)效率可以通過升高溫度檢測自由氨基的消耗量來獲得。若升高單位溫度氨基的消耗量小，說明自由氨基的數(shù)量少，交聯(lián)效率較高。
[0057]其中，對所述步驟2)中的清洗溶液不做限定。
[0058]本發(fā)明的又一實施例中，所述步驟2)中的清洗溶液選自磷酸鹽緩沖液、氯化鈉溶液、Hanks液和水中的一種或者幾種。Hanks液是生物醫(yī)學(xué)實驗中最常用的無機(jī)鹽溶液和平衡鹽溶液。
[0059]例如，可以用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗，也可以先采用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗，再用水進(jìn)行清洗。
[0060]其中，對清洗的溫度不做限定，本發(fā)明的一實施例中，所述清洗的溫度為2-40°C。[0061 ]其中，當(dāng)所述清洗溶液為磷酸鹽緩沖液、氯化鈉溶液或者Hanks液時，對所述清洗溶液的濃度不做限定。本發(fā)明的一實施例中，所述清洗溶液濃度為0.01-0.2mol/L。
[0062]本發(fā)明的又一實施例中，所述方法還包括:
[0063]在所述步驟I)之前對所述細(xì)胞外基質(zhì)采用物理交聯(lián)方法進(jìn)行交聯(lián);或者，
[0064]在所述步驟2)之后對所述生物補(bǔ)片采用物理交聯(lián)方法進(jìn)行交聯(lián)。
[0005]在本發(fā)明實施例中，通過物理交聯(lián)與化學(xué)交聯(lián)相結(jié)合，能夠進(jìn)一步提高所述生物補(bǔ)片的機(jī)械強(qiáng)度。
[0066]其中，對所述脫細(xì)胞后的細(xì)胞外基質(zhì)的獲取不做限定。
[0067]本發(fā)明的一實施例中，所述方法還包括:獲取脫細(xì)胞后的細(xì)胞外基質(zhì);具體為:
[0068]SlOl、將動物膜組織表面的脂肪組織和結(jié)締組織去除；
[0069]S102、將SlOl所獲得的膜組織在I %的雙氧水中浸泡lh，再在75%的次氯酸乙醇溶液中浸泡0.5h，對所述膜組織進(jìn)行殺菌消毒；
[0070]S103、將殺菌消毒后的膜組織在IM的氫氧化鈉溶液中浸泡Ih進(jìn)行脫細(xì)胞；
[0071]S104、將S103所獲得的膜組織在85%的丙酮溶液中震蕩Ih進(jìn)行脫脂，獲得脫細(xì)胞后的細(xì)胞外基質(zhì)。
[0072]其中，對所述動物膜組織的獲取不做限定。
[0073]所述動物膜組織選自小腸粘膜、腹膜、心包膜、羊膜或者隔膜中的任意一種。
[0074]另一方面，本發(fā)明實施例提供一種通過上述所述的交聯(lián)方法制備獲得的交聯(lián)生物補(bǔ)片。該生物補(bǔ)片能夠保持天然的三維結(jié)構(gòu)，細(xì)胞毒性小，交聯(lián)度高，并且該生物補(bǔ)片的機(jī)械強(qiáng)度和柔韌性較高，長期保存可不會出現(xiàn)發(fā)黃以及易于鈣化的現(xiàn)象，該生物補(bǔ)片在植入機(jī)體時，具有良好的生物相容性和安全性，利于機(jī)體的再生，能夠與原生組織很好地長合在一起。
[0075]其中，對所述交聯(lián)生物補(bǔ)片的機(jī)械強(qiáng)度不做限定。
[0076]本發(fā)明的一實施例中，所述交聯(lián)生物補(bǔ)片的拉伸強(qiáng)度為11-12N。拉伸強(qiáng)度是指在外力作用下，材料抵抗永久變形和破壞的能力。
[0077]其中，對所述交聯(lián)生物補(bǔ)片的交聯(lián)度不做限定。
[0078]本發(fā)明的一實施例中，所述交聯(lián)生物補(bǔ)片的交聯(lián)度為78%_79.5%。
[0079]其中，對所述交聯(lián)生物補(bǔ)片的交聯(lián)度的測試方法不做限定。
[0080]膠原的交聯(lián)度可以利用三硝基苯硫酸(TNBS)和氨基酸官能團(tuán)的化學(xué)反應(yīng)，通過檢測其紫外吸光度值來測量交聯(lián)膠原基質(zhì)中自由氨基數(shù)量，以自由氨基數(shù)量的變化來表征膠原的交聯(lián)度。
[0081]其中，對所述交聯(lián)生物補(bǔ)片的熱穩(wěn)定性不做限定。
[0082]本發(fā)明的一實施例中，所述交聯(lián)生物補(bǔ)片的變性溫度為80_84°C。本發(fā)明實施例中，生物補(bǔ)片的熱穩(wěn)定性也有極大的提高。
[0083]其中，對所述交聯(lián)生物補(bǔ)片的變性溫度的測量不做限定。
[0084]可以采用差示掃描量熱分析法(DSC)對所述交聯(lián)生物補(bǔ)片的變性溫度進(jìn)行測量。
[0085]實施例
[0086]下面的實施例用來說明本發(fā)明，并不是想限制本發(fā)明的范圍。以下實施例僅以具體實施過程中各組分的實際添加濃度為例進(jìn)行說明，實際使用時，各組分的濃度并不對本發(fā)明目的的實現(xiàn)構(gòu)成影響。
[0087]對照例
[0088]為了描述方便，將所述對照例中所獲得的交聯(lián)生物補(bǔ)片記為H;
[0089]生物補(bǔ)片H的制備方法具體為:
[0090]SlOl、將牛心包表面的脂肪組織和結(jié)締組織去除；
[0091]S102、將SlOl所獲得的牛心包在在I %的雙氧水中浸泡lh，再在75%的次氯酸乙醇溶液中浸泡0.5h，對所述膜組織進(jìn)行殺菌消毒；
[0092]S103、將殺菌消毒后的牛心包在IM的氫氧化鈉溶液中浸泡Ih進(jìn)行脫細(xì)胞；
[0093]S104、將S103所獲得的牛心包在85%的丙酮溶液中震蕩Ih進(jìn)行脫脂，獲得脫細(xì)胞后的細(xì)胞外基質(zhì)；
[0094]S105、將所獲得的脫細(xì)胞后的細(xì)胞外基質(zhì)浸泡在置于含有環(huán)氧化物的溶液中，在30 0C下進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)3-14天；
[0095]S106、將S105所獲得的生物補(bǔ)片依次用0.0lmol/L的磷酸鹽緩沖液和水清洗，獲得交聯(lián)生物補(bǔ)片H。
[0096]實施例1
[0097]為了描述方便，將所述實施例1中所獲得的交聯(lián)生物補(bǔ)片記為A;
[0098]生物補(bǔ)片A的制備方法具體為:
[0099]SlOl、將牛心包表面的脂肪組織和結(jié)締組織去除；
[0100]S102、將SlOl所獲得的牛心包在在I %的雙氧水中浸泡lh，再在75%的次氯酸乙醇溶液中浸泡0.5h，對所述膜組織進(jìn)行殺菌消毒；
[0101 ] S103、將殺菌消毒后的牛心包在IM的氫氧化鈉溶液中浸泡Ih進(jìn)行脫細(xì)胞；
[0102]S104、將S103所獲得的牛心包在85%的丙酮溶液中震蕩Ih進(jìn)行脫脂，獲得脫細(xì)胞后的細(xì)胞外基質(zhì)。
[0103]S105、將所獲得的脫細(xì)胞后的細(xì)胞外基質(zhì)浸泡在置于含有脫水縮合劑的溶液中，所述細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白分子與所述脫水縮合劑在20 V下進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)6h;該脫水縮合劑為0.15M的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和0.06M的琥珀酸酰胺的混合水溶液，所述混合水溶液中添加有0.15M的2-N-嗎啉乙磺酸溶液，反應(yīng)體系的pH值為4.5；
[0104]S106、將S105所獲得的生物補(bǔ)片依次用0.0lmol/L的磷酸鹽緩沖液和水清洗，獲得交聯(lián)生物補(bǔ)片A。
[0105]實施例2
[0106]為了描述方便，將所述實施例2中所獲得的交聯(lián)生物補(bǔ)片記為B;
[0107]生物補(bǔ)片B的制備方法具體為:
[0108]SlOl、將羊小腸粘膜表面的脂肪組織和結(jié)締組織去除；
[0109]S1 2、將S1I所獲得的羊小腸粘膜在在I %的雙氧水中浸泡I h，再在7 5 %的次氯酸乙醇溶液中浸泡0.5h，對所述膜組織進(jìn)行殺菌消毒；
[0110]S103、將殺菌消毒后的羊小腸粘膜在IM的氫氧化鈉溶液中浸泡Ih進(jìn)行脫細(xì)胞；
[0111]S104、將S103所獲得的羊小腸粘膜在85%的丙酮溶液中震蕩Ih進(jìn)行脫脂，獲得脫細(xì)胞后的細(xì)胞外基質(zhì)。
[0112]S105、將S104所獲得的細(xì)胞外基質(zhì)在3000yW/cm2的紫外線輻照下進(jìn)行物理交聯(lián)；
[0113]S106、將S105所獲得的細(xì)胞外基質(zhì)浸泡在含有脫水縮合劑的溶液中，在30°C下反應(yīng)12h，該脫水縮合劑為0.1M的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽溶液，該反應(yīng)體系的pH值為5.5;
[0114]S107、將S106所獲得的生物補(bǔ)片依次用0.2mol/L的氯化鈉溶液和水清洗，獲得交聯(lián)生物補(bǔ)片B。
[0115]實施例3
[0116]為了描述方便，將所述實施例3中所獲得的交聯(lián)生物補(bǔ)片記為C;
[0117]生物補(bǔ)片C的制備方法具體為:
[0118]SlOl、將隔膜表面的脂肪組織和結(jié)締組織去除；
[0119]S102、將SlOl所獲得的隔膜在在I %的雙氧水中浸泡lh，再在75%的次氯酸乙醇溶液中浸泡0.5h，對所述膜組織進(jìn)行殺菌消毒；
[0120]S103、將殺菌消毒后的隔膜在IM的氫氧化鈉溶液中浸泡Ih進(jìn)行脫細(xì)胞；
[0121]S104、將S103所獲得的隔膜在85%的丙酮溶液中震蕩Ih進(jìn)行脫脂，獲得脫細(xì)胞后的細(xì)胞外基質(zhì)。
[0122]S105、將S104所獲得的細(xì)胞外基質(zhì)浸泡在含有脫水縮合劑的溶液中，在25°C下反應(yīng)1h，該脫水縮合劑為0.1M的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽溶液；
[0123]S106、將S105所獲得的生物補(bǔ)片依次用0.lmol/L的Hanks液和水清洗；
[0124]S107、將S106所獲得的細(xì)胞外基質(zhì)在3000yW/cm2的紫外線輻照3h進(jìn)行物理交聯(lián)，獲得交聯(lián)生物補(bǔ)片C。
[0125]實施例4
[0126]為了描述方便，將所述實施例4中所獲得的交聯(lián)生物補(bǔ)片記為D;
[0127]生物補(bǔ)片D的制備方法具體為:
[0128]SlOl、將隔膜表面的脂肪組織和結(jié)締組織去除；
[0129]S102、將SlOl所獲得的隔膜在在I %的雙氧水中浸泡lh，再在75%的次氯酸乙醇溶液中浸泡0.5h，對所述膜組織進(jìn)行殺菌消毒；
[0130]S103、將殺菌消毒后的隔膜在IM的氫氧化鈉溶液中浸泡Ih進(jìn)行脫細(xì)胞；
[0131]S104、將S103所獲得的隔膜在85%的丙酮溶液中震蕩Ih進(jìn)行脫脂，獲得脫細(xì)胞后的細(xì)胞外基質(zhì)。
[0132]S105、將S104所獲得的細(xì)胞外基質(zhì)浸泡在含有天然生物交聯(lián)劑的溶液中，在30°C下反應(yīng)12h，該天然生物交聯(lián)劑為0.1M的京尼平溶液；
[0133]S106、將S105所獲得的生物補(bǔ)片依次用0.lmol/L的Hanks液和水清洗；
[0134]S107、將S106所獲得的細(xì)胞外基質(zhì)在3000yW/cm2的紫外線輻照3h進(jìn)行物理交聯(lián)，獲得交聯(lián)生物補(bǔ)片D。
[0135]實施例5
[0136]為了描述方便，將所述實施例5中所獲得的交聯(lián)生物補(bǔ)片記為E;
[0137]所述實施例5與所述實施例4基本相同，不同的是，所述天然生物交聯(lián)劑為花青素，交聯(lián)反應(yīng)的溫度為37°C，反應(yīng)時間為24h。
[0138]實施例6
[0139]為了描述方便，將所述實施例6中所獲得的交聯(lián)生物補(bǔ)片記為F;
[0140]所述實施例6與所述實施例4基本相同，不同的是，所述天然生物交聯(lián)劑為核黃素，交聯(lián)反應(yīng)的溫度為35°C，反應(yīng)時間為48h。
[0141]實施例7
[0142]為了描述方便，將所述實施例7中所獲得的交聯(lián)生物補(bǔ)片記為G;
[0143]所述實施例7與所述實施例4基本相同，不同的是，所述天然生物交聯(lián)劑為核糖，交聯(lián)反應(yīng)的溫度為35°C，反應(yīng)時間為40h。
[0144]實驗例
[0145]對實施例1-7所獲得的交聯(lián)生物補(bǔ)片A-G和對照例中所獲得的交聯(lián)生物補(bǔ)片H分別進(jìn)行機(jī)械強(qiáng)度、交聯(lián)度以及熱穩(wěn)定性測試。
[0146]1、機(jī)械強(qiáng)度測試
[0147]分別檢測生物補(bǔ)片A-G的拉伸強(qiáng)度，可以得出:本發(fā)明實施例提供的生物補(bǔ)片A-G的拉伸強(qiáng)度分別為12N、11.8N、I IN、11.2N、11.5N、11.8N和11.6N，對照例中生物補(bǔ)片H的拉伸強(qiáng)度為8N。
[0148]2、交聯(lián)度測試
[0149]利用三硝基苯硫酸(TNBS)和氨基酸官能團(tuán)的化學(xué)反應(yīng)，通過檢測其紫外吸光度值來測量交聯(lián)膠原基質(zhì)中自由氨基數(shù)量，以自由氨基數(shù)量的變化來表征膠原的交聯(lián)度，并在7天后測量質(zhì)量失衡率。
[0150]測試結(jié)果:實施例1-7所提供的交聯(lián)生物補(bǔ)片A-G的交聯(lián)度分別為:79.5%、78.5%、78%、78.6%、79%、79.1%和78.3%，7天后質(zhì)量失衡率分別為0.29%、0.35%、
0.25%、0.27%、0.3%、0.31%和0.29。對照例中生物補(bǔ)片H的交聯(lián)度為58%，7天后質(zhì)量失衡率為0.3%。
[0151]3、交聯(lián)效率測試
[0152]通過在反應(yīng)過程中分別對實施例1-7和對照例在不同的反應(yīng)階段取樣，采用升高溫度的方法檢測自由氨基的消耗量。
[0153]通過實驗發(fā)現(xiàn):實施例1-7升高單位溫度氨基的消耗量小，交聯(lián)效率明顯高于對照例;參見圖4，為實施例1和對照例在不同反應(yīng)階段取樣后，收縮溫度增加量與自由氨基的消耗量的關(guān)系曲線，可以得知:在整個反應(yīng)過程中，實施例1的曲線的平均斜率即A [ΝΗ2]/ΔTs相對于對照例更小，說明升高單位溫度消耗自由氨基的量更小，表明實施例1具有更高的交聯(lián)效率。
[0154]4、熱穩(wěn)定性測試
[0155]對本發(fā)明實施例提供的生物補(bǔ)片以及交聯(lián)之前的生物補(bǔ)片用差示掃描量熱法(DSC)進(jìn)行熱穩(wěn)定性測試。
[0156]測試結(jié)果:參見圖5，為交聯(lián)之前的生物補(bǔ)片的DSC檢測結(jié)果，它以樣品吸熱或放熱的速率，即熱流率dH/dt(單位毫焦/秒)為縱坐標(biāo)，以溫度T為橫坐標(biāo)，可以測定多種熱力學(xué)和動力學(xué)參數(shù)，可以得出:交聯(lián)之前的生物補(bǔ)片的變性溫度為56.1°C;參見圖6，為交聯(lián)生物補(bǔ)片A的DSC檢測結(jié)果，可以得出在交聯(lián)之后的生物補(bǔ)片A的變性溫度約為83.2°C，而交聯(lián)生物補(bǔ)片G的DSC檢測結(jié)果經(jīng)文獻(xiàn)報道其變性溫度為70°C，因此，可以得知:本發(fā)明實施例提供的生物補(bǔ)片的熱穩(wěn)定性有極大的提高。
[0157]綜上所述，本發(fā)明實施例提供的制備方法工藝簡單，交聯(lián)效率較高，其中，所述脫細(xì)胞后的細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原分子在脫水縮合劑的存在下發(fā)生自身脫水縮合反應(yīng)，使得膠原分子的羧基和氨基生成分子內(nèi)或者分子間的酰胺鍵，而脫水縮合劑并沒有成為實際交聯(lián)的一部分，在步驟2)中可以清洗掉，從而能夠保持膠原的天然三維結(jié)構(gòu)，細(xì)胞毒性小，而天然生物交聯(lián)劑幾乎無細(xì)胞毒性，與人工合成的化合物相比，所獲得的生物補(bǔ)片的生物相容性好，安全性好，并且通過上述交聯(lián)方法所獲得的生物補(bǔ)片具有較高的機(jī)械強(qiáng)度和柔韌性，長期保存不會出現(xiàn)發(fā)黃以及易于鈣化的現(xiàn)象。
[0158]以上所述，僅為本發(fā)明的【具體實施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以所述權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。
【主權(quán)項】
1.一種生物補(bǔ)片的交聯(lián)方法，所述生物補(bǔ)片為脫細(xì)胞后的細(xì)胞外基質(zhì)，其特征在于，包括: 步驟I)將所述生物補(bǔ)片置于含有脫水縮合劑的溶液中進(jìn)行脫水縮合反應(yīng);其中，所述脫水縮合劑為碳化二亞胺； 或者，將所述生物補(bǔ)片置于含有天然生物交聯(lián)劑的溶液中，使得所述生物補(bǔ)片上的膠原分子與所述天然生物交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)； 步驟2)對所述生物補(bǔ)片進(jìn)行清洗，停止反應(yīng)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的交聯(lián)方法，其特征在于，所述碳化二亞胺為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的交聯(lián)方法，其特征在于，所述含有脫水縮合劑的溶液中還添加有:N-羥基苯并三氮唑或N-羥基-琥珀酸酰胺。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的交聯(lián)方法，其特征在于，所述含有脫水縮合劑的溶液中還添加有酸性緩沖劑，使得反應(yīng)體系的PH值為4.5-6.5。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的交聯(lián)方法，其特征在于，所述酸性緩沖劑為2-N嗎啉乙磺酸。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的交聯(lián)方法，其特征在于， 所述天然生物交聯(lián)劑選自花青素、核黃素、核糖和京尼平中的任意一種。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的交聯(lián)方法，其特征在于，所述步驟2)中的清洗溶液選自磷酸鹽緩沖溶液、氯化鈉溶液、hank液和水中的一種或者幾種。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的交聯(lián)方法，其特征在于，所述步驟I)中脫水縮合反應(yīng)的溫度為20-30 0C，反應(yīng)時間為6-12h。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的交聯(lián)方法，其特征在于，所述步驟I)中交聯(lián)反應(yīng)的溫度為30-37 0C，反應(yīng)時間為12h-48h。10.—種通過權(quán)利要求1-9任一項所述的方法制備獲得的交聯(lián)生物補(bǔ)片。
【文檔編號】A61L27/50GK105963783SQ201610284706
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年4月29日
【發(fā)明人】冉永峰
【申請人】陜西瑞盛生物科技有限公司