小分子多肽47aa的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了小分子多肽47aa在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明利用生物工程技術(shù)，基因重組一段47個(gè)氨基酸多肽對應(yīng)的DNA序列到PCMV?HA真核表達(dá)載體。經(jīng)酶切和序列分析證明重組成功后，將此真核表達(dá)重組多肽轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞，免疫印跡證明多肽的蛋白表達(dá)，經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)該小分子多肽具有顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，在制備抗腫瘤藥物中的將具有廣泛的應(yīng)用。
【專利說明】
小分子多化47aa的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別設(shè)及小分子多膚47aa的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 非霍奇金淋己瘤(non-Hodgkin's lym地oma，NHL)是造血系統(tǒng)最常見的腫瘤。NHL 起源于淋己結(jié)和其他結(jié)外淋己組織的惡性腫瘤，約占我國全部惡性淋己瘤的85%-90%，遠(yuǎn) 高于歐美國家。近Ξ十年來，NHL的發(fā)病率增長了一倍，在我國，每年新增患者約2.5萬人。在 發(fā)病率增長最快的腫瘤中位居第3位。目前，NHL的治療主要W化學(xué)藥物治療及生物祀向治 療為主，但由于其極易復(fù)發(fā)及耐藥性的存在，成為目前研究難治性腫瘤的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。NHL 細(xì)胞的原發(fā)耐藥及獲得性耐藥是化療成功的主要障礙，其結(jié)果是腫瘤細(xì)胞對藥物治療的不 敏感，并導(dǎo)致各種藥物對人體正常組織的細(xì)胞毒作用?，F(xiàn)有研究表明，淋己瘤細(xì)胞和淋己結(jié) 基質(zhì)構(gòu)成的腫瘤微環(huán)境是影響?zhàn)囌?xì)胞耐藥性的主要因素。
[0003] 目前對非霍奇金淋己瘤的治療主要是內(nèi)科保守治療為主，主要采用利妥昔單抗、 多柔比星、美羅華等，積極防治并發(fā)癥等措施，尚無突破性進(jìn)展。因此急需研究開發(fā)非霍奇 金淋己瘤治療藥物。
[0004] 整合素是分布在細(xì)胞表面的由異源二聚體組成的跨膜糖蛋白，總共包含18種α亞 基和8種β亞基，在不同的細(xì)胞類型中總共可W形成24種整合素。其中，β1整合素 （Integrin betal)是分布較為廣泛介導(dǎo)細(xì)胞與胞外基質(zhì)粘附信號的主要分子之一。大量研究表明，β1 整合素在多種侵襲性癌癥中高表達(dá)，由胞外段，跨膜結(jié)構(gòu)域W及胞內(nèi)尾端結(jié)構(gòu)域組成。其中 胞內(nèi)尾端結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)傳遞信號級聯(lián)反應(yīng)活化下游通路，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)也能接 收胞內(nèi)的信號，促進(jìn)其自身的活化。在淋己細(xì)胞白血病細(xì)胞中檢測到整合素 m胞膜的高表 達(dá)激活了 MAPK/E服的信號傳導(dǎo)，通過維持抗調(diào)亡蛋白md-l的蛋白水平，活化caspase-9和 caspase-3并且抑制細(xì)胞色素 C的釋放，介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞對多柔比星的耐藥。近期研究表明， TUBAlA(tubulin al地ala)可W與m整合素的胞內(nèi)尾端結(jié)構(gòu)域相互作用，并且促進(jìn)m整合 素在胞膜的聚集。因此發(fā)明一種多膚競爭性的結(jié)合TUBA1A，顯得迫在眉睫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種小分子多膚 47aa的應(yīng)用，具有抗腫瘤的應(yīng)用價(jià)值。
[0006] 技術(shù)方案:為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0007] 小分子多膚在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述的小分子多膚，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
[000引編碼所述的小分子多膚的基因，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009] 含有所述的小分子多膚的編碼基因的DM序列的載體。
[0010] 所述的載體，將小分子多膚的DNA序列連接進(jìn)PCMV-HA載體，構(gòu)建出重組表達(dá)質(zhì)粒。
[0011] 有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用生物工程技術(shù)，基因重組一段47個(gè)氨基酸 多膚對應(yīng)的DM序列到PCMV-HA真核表達(dá)載體。經(jīng)酶切和序列分析證明重組成功后，將此真 核表達(dá)重組多膚轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞，免疫印跡證明多膚的蛋白表達(dá)，經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)該小分子多 膚具有顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，在制備抗腫瘤藥物中的將具有廣泛的應(yīng)用。
【附圖說明】
[0012] 圖1是PCMV-HA載體圖；
[0013] 圖2是CCK8實(shí)驗(yàn)檢測47aa多膚抑制0CI-Ly8細(xì)胞增殖結(jié)果圖；
[0014] 圖3是CCK8實(shí)驗(yàn)檢測47aa多膚抑制Raji細(xì)胞增殖結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn) 方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第Ξ版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等 譯，科學(xué)出版社，2002年）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行。
[0016] 實(shí)施例1小分子多膚的制備
[0017] 重組膚的克隆載體構(gòu)建:提取人的mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，WcDNA為模板，上游引物 為5 ' -CCGGAATTCCGATTCATGACAGAAGGGAGTTTGC(含EcoRl酶切位點(diǎn)）；下游引物為5 ' - CGGGGTACCTCATTTTCCCTCATACTTCGGAT(含 Kpnl 酶切位點(diǎn)），應(yīng)用 PCR 技術(shù)成功擴(kuò)增出 47aa 對 應(yīng)的14化P的mRNA序列，如SEQ ID NO. 2所示，所表達(dá)的小分子多膚的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。擴(kuò)增得到的片段與PCMV-HA載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌D冊α中， 在含Amp+瓊脂平板上挑選克隆，W堿裂解法小提重組質(zhì)粒后，WEC0R1酶切鑒定。
[001引重組膚的真核表達(dá)載體構(gòu)建：將含有47aa多膚核酸片段的PCMV-HA質(zhì)粒（圖1)經(jīng) EC0R1酶切后，利用回收試劑盒獲得該片段，同時(shí)用相同的酶處理質(zhì)粒PCDNA3.1 (約化bp)， 然后將回收多膚核酸片段和經(jīng)酶切的載體PCMV-HA在T4DNA連接酶作用下于16 °C連接過夜。 酶切鑒定重組體，結(jié)果顯示該P(yáng)CMV-HA片段正確。
[0019]實(shí)施例2多膚抗腫瘤功能的檢測
[0020]細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn):將實(shí)施例1制備的重組膚真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞后，48小時(shí)后檢 測細(xì)胞活性，CCK8結(jié)果顯示此多膚具有顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖的顯著作用。
[0021 ]在96孔板中接種細(xì)胞懸液(100化/孔），密度為104-105/mL，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培 養(yǎng)過夜(在37°C，5%C02的條件下），刺激細(xì)胞;到達(dá)時(shí)間點(diǎn)后換液，向每孔加入10化L含10化 CCK-8溶液的細(xì)胞培養(yǎng)基;將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)解育1.5-化；用酶標(biāo)儀測定(測定波長490， 參照波長630)處的吸光度。吸收值大小反映了細(xì)胞活性，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，W時(shí)間為橫坐標(biāo)， 吸收值為縱坐標(biāo)做圖。同時(shí)分別轉(zhuǎn)染包含或缺失此35aa多膚的兩個(gè)剪切型蛋白來證明此序 列對腫瘤生長抑制的必要作用。Μ?Τ結(jié)果顯示與空載對照相比，47aa多膚真核表達(dá)實(shí)驗(yàn)組顯 著抑制了淋己瘤細(xì)胞〇CI-Ly8及Raji細(xì)胞的增殖，如圖2,圖3所示。結(jié)果顯示，表達(dá)包含此多 膚的剪切型蛋白顯著抑制了淋己瘤細(xì)胞的增殖，而缺失此47aa多膚蛋白喪失了抑癌作用， 證明了此47aa多膚顯著的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的功效。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 小分子多肽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述的小分子多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 編碼權(quán)利要求1所述的小分子多肽的基因，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。3. 含有權(quán)利要求2所述的小分子多肽47aa的編碼基因的DNA序列的載體。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體，其特征在于:將小分子多肽47aa的DNA序列連接進(jìn)PCMV-HA載體，構(gòu)建出重組表達(dá)質(zhì)粒。
【文檔編號】A61P35/00GK105920584SQ201610352664
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月25日
【發(fā)明人】沈愛國, 程純, 王燏嬋, 歐陽玉
【申請人】南通大學(xué)