龍虎人丹的中暑模型的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及龍虎人丹的中暑模型的構(gòu)建方法，具體涉及龍虎人丹在中暑模型及正 常大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究。
【背景技術(shù)】
[0002] 中暑(heatstroke ,HS)是高溫引起的人體體溫調(diào)節(jié)功能失調(diào)，體內(nèi)熱量過度積蓄， 從而引發(fā)神經(jīng)器官受損。傳統(tǒng)中藥，特別是中藥復(fù)方治療中暑具有悠久歷史，在中暑及并發(fā) 癥的防治方面具有獨(dú)特的思維和實(shí)踐優(yōu)勢。
[0003] 實(shí)驗(yàn)研究表明：龍虎人丹能降低實(shí)驗(yàn)性中暑大鼠體溫，減輕實(shí)驗(yàn)性中暑大鼠血液 濃縮程度，并有調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)性中暑大鼠電解質(zhì)紊亂現(xiàn)象及降低動(dòng)物死亡率的作用趨勢，具有 一定的抗中暑作用。關(guān)于龍虎人丹在中暑模型動(dòng)物下的藥代動(dòng)力學(xué)方面的研究還沒有相關(guān) 報(bào)道，其吸收進(jìn)入體內(nèi)的成分不清楚，不利于確定其產(chǎn)生藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于，提供龍虎人丹的中暑模型的構(gòu)建方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)所存 在的上述缺點(diǎn)和不足。
[0005] 本研究中采用中暑模型大鼠進(jìn)行龍虎人丹的藥動(dòng)學(xué)研究，為龍虎人丹的藥效物質(zhì) 的確定提供幫助;并同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組，觀察病理狀態(tài)龍虎人丹的藥動(dòng)學(xué)規(guī)律的變化。
[0006] 本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問題，可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：
[0007] 龍虎人丹的中暑模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：
[0008] 步驟(1)動(dòng)物的準(zhǔn)備:清潔級(jí)的大鼠；
[0009] 步驟（1)中，所述大鼠選用Wistar大鼠230 ± 20g，飼養(yǎng)室溫度為23 ± 2°C，濕度為60 ±5%，12h明暗循環(huán)，動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境3天后，于實(shí)驗(yàn)前禁食12h，自由飲水。
[0010]步驟(2)中暑模型的建立：
[0011] 大鼠在清潔級(jí)動(dòng)物房內(nèi)常溫環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后，在人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行熱 暴露。箱內(nèi)相對(duì)濕度55~75%，箱內(nèi)溫度調(diào)節(jié)為39°C，大鼠熱暴露Ih;
[0012] 常溫對(duì)照組除溫度外，其余環(huán)境條件與應(yīng)激組相同，非熱暴露條件下，大鼠在22~ 25°C室溫條件下飼養(yǎng)，普食，自由飲水，用電子肛溫計(jì)測量大鼠肛溫，以肛溫超過40°C±1°C 作為中暑造模成功大鼠；
[0013]步驟(3)給藥與樣品采集：
[0014] 取中暑模型大鼠18只，雄性體重230 ± 20g，隨機(jī)分組為中暑高、中、低三個(gè)劑量組， 每組6只；并設(shè)正常高劑量對(duì)照組6只，雄性，禁食12h;
[0015] 步驟(3)中，低劑量組灌胃給藥龍虎人丹0.115g/kg;中劑量組灌胃給藥龍虎人丹 0.23g/kg;高劑量組灌胃給藥龍虎人丹0.92g/kg。
[0016] 步驟(3)中，大鼠灌胃給藥后4小時(shí)提供食物，整個(gè)過程禁食不禁水，于給藥前和給 藥后5111；[11，15111；[11，30111；[11，1]1，2]1，4]1，6]1，12]1，24]1，48]1眼底靜脈叢取血，4°〇6,000\8離心 IOmin得到血漿后，分取上層血漿100μΙ，置于-80°C冰箱中保存，待測。
[0017]步驟⑷樣品測定：
[0018] 血漿按上述建立的LC-MS/MS及HS-SroE-GC-MS/MS方法進(jìn)行測定，同時(shí)進(jìn)行質(zhì)量控 制，每個(gè)分析批生物樣品測定時(shí)建立隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行三濃度雙樣本質(zhì)控樣品分析，質(zhì) 控樣品CV〈15%作為當(dāng)日數(shù)據(jù)是否接受的標(biāo)準(zhǔn)；
[00?9 ]步驟(5)藥代動(dòng)力學(xué)分析與統(tǒng)計(jì)分析：
[0020] 通過每測定批次的隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算相應(yīng)批次中有效成分的血漿藥物濃度，所 得濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)。
[0021] 步驟（5 )中，所述數(shù)據(jù)使用WinNonl in軟件（Bui Id 6 · 1 · 0 · 173，Phars ight Corporation，MO，USA)，采用非房室模型計(jì)算Cmax Jm^AUCo-hAUCtH^ti/hCL/FJd/FJRTo-t 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
[0022]本發(fā)明的有益效果：
[0023] 本發(fā)明采用建立的龍虎人丹中8種非揮發(fā)性成分液相色譜-質(zhì)譜分析LC-MS/MS及4 種揮發(fā)性成分氣象色譜-質(zhì)譜分析HS-SPDE-GC-MS/MS生物樣品分析方法，研究了龍虎人丹 在正常及中暑大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究規(guī)律。
[0024] 本發(fā)明的結(jié)果可為理解龍虎人丹的抗中暑的藥效物質(zhì)的提供幫助。
【附圖說明】
[0025]圖1正常大鼠口服高劑量(0.92g/kg)(·)、中暑大鼠口服高劑量（)、中劑量(▲) 和低劑量（\)(〇.92,0.23,0.1158/1^)龍虎人丹后兒茶素、表兒茶素、甘草苷、異甘草苷、甘 草素、異甘草素、胡椒堿和甘草次酸的血藥濃度-時(shí)間曲線圖。
[0026]圖2正常大鼠口服高劑量（0.92g/kg)(·)、中暑大鼠口服高劑量（)、中劑量 (▲)、低劑量（X ) (0.92，0.23，0.115g/kg)龍虎人丹后的血藥濃度-時(shí)間曲線圖
【具體實(shí)施方式】
[0027]以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā) 明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0028] 實(shí)施例1
[0029] 1.材料與方法
[0030] 1.1.動(dòng)物
[0031]清潔級(jí)Wistar大鼠（230 ± 20g)由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)室溫度 為23 ± 2°C，濕度為60 ± 5 %，12h明暗循環(huán)，動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境3天后，于實(shí)驗(yàn)前禁食12h，自由飲 水。
[0032] 1.2.中暑模型的建立
[0033]大鼠在清潔級(jí)動(dòng)物房內(nèi)常溫環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后，在人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行熱 暴露。箱內(nèi)相對(duì)濕度55~75 %，箱內(nèi)溫度調(diào)節(jié)為39°C，大鼠熱暴露Ih。常溫對(duì)照組除溫度外， 其余環(huán)境條件與應(yīng)激組相同，非熱暴露條件下，大鼠在22~25°C室溫條件下飼養(yǎng)，普食，自 由飲水。用電子肛溫計(jì)測量大鼠肛溫，以肛溫超過40°C±1°C作為中暑造模成功大鼠。
[0034] 1.3.給藥與樣品采集
[0035] 取中暑模型大鼠18只，雄性(體重230±20g)，隨機(jī)分組為中暑高、中、低三個(gè)劑量 組，每組6只；并設(shè)正常高劑量對(duì)照組6只，雄性，禁食12h。低劑量組灌胃給藥龍虎人丹 0.115g/kg;中劑量組灌胃給藥龍虎人丹0.23g/kg;高劑量組灌胃給藥龍虎人丹0.92g/kg。 灌胃給藥后4小時(shí)提供食物，整個(gè)過程禁食不禁水。于給藥前和給藥后5min，15min，30min， 111，211，411，611，1211，2411，4811眼底靜脈叢取血，4°〇6,000\8離心101^11得到血漿后，分取上層 血漿1〇〇μ1，置于_80°C冰箱中保存，待測。
[0036] 1.4.樣品測定
[0037] 血漿按上述建立的LC-MS/MS及HS-SroE-GC-MS/MS方法進(jìn)行測定。同時(shí)進(jìn)行質(zhì)量控 制，每個(gè)分析批生物樣品測定時(shí)建立隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行三濃度雙樣本質(zhì)控樣品分析，質(zhì) 控樣品CV〈15%作為當(dāng)日數(shù)據(jù)是否接受的標(biāo)準(zhǔn)。
[0038] 1 · 5 ·藥代動(dòng)力學(xué)分析與統(tǒng)計(jì)分析
[0039] 通過每測定批次的隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算相應(yīng)批次中有效成分的血漿藥物濃度，所 得濃度_時(shí)間數(shù)據(jù)使用WinNonl in軟件（Bui Id 6 · 1 · 0 · 173，Pharsight Corporation，M0， 1^)，采用非房室模型計(jì)算(^、1^^1]0)-*^1]0)-〇〇、切2、〇^、￥(1/^、]\?1'()-*等藥代動(dòng)力學(xué)參 數(shù)。
[0040] 2.結(jié)果
[0041 ] 2.1LC-MS/MS 部分
[0042]中暑模型大鼠和正常大鼠灌服龍虎人丹后血漿濃度-時(shí)間曲線見圖1，各成分的藥 動(dòng)學(xué)參數(shù)見表1-表SASahHSmhHSm)分別為中暑低劑量組，中暑中劑量組和中暑高劑 量組。
[0043]結(jié)果表明，兒茶素、表兒茶素、甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素、胡椒堿和甘草 次酸等成分吸收進(jìn)入血中，其中甘草次酸濃度最高。甘草次酸和胡椒堿在模型3個(gè)劑量組和 正常組、甘草素和異甘草素在模型高及中劑量組和正常組、而兒茶素、表兒茶素、甘草苷、異 甘草苷僅在模型高劑量組和正常組可以繪制出C-T曲線。
[0044]兒茶素、表兒茶素、甘草苷、異甘草苷和胡椒堿吸收快，在Ih內(nèi)達(dá)峰，消除快，t1/22h 左右;甘草素、異甘草素吸收也快，在IOmin左右達(dá)峰，但在2h左右出現(xiàn)第2峰，具有雙峰現(xiàn) 象，消除略慢，t1/22.6-6h左右;甘草次酸達(dá)峰較遲，可能與其需腸菌轉(zhuǎn)化而來有關(guān)，消除在 所有成分中最慢，t 1/26h左右。
[0045]本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，龍虎人丹中的異甘草苷和胡椒堿在中暑大鼠體內(nèi)的暴露量增 加，tl/2延長。
[0046]圖1正常大鼠口服高劑量(0.92g/kg)(·)、中暑大鼠口服高劑量（)、中劑量(▲) 和低劑量（\)(〇.92,0.23,0.1158/1^)龍虎人丹后兒茶素、表兒茶素、甘草苷、異