miR-506在制備預(yù)防或/和治療胰腺癌的藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體設(shè)及miR-506在制備預(yù)防或/和治療膜腺癌的藥物 中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 根據(jù)最新流行病學(xué)調(diào)查，膜腺癌位居歐美等發(fā)達(dá)國家惡性腫瘤死亡率第四位，全 球每年約250萬人死于膜腺癌。近20年來我國膜腺癌的發(fā)病率持續(xù)增高，目前膜腺癌位居惡 性腫瘤死亡率第五位。在膜腺癌的治療中，外科手術(shù)、化療及放療等手段的療效均不盡人 意，其術(shù)后1年生存率不到20%，5年生存率僅為4%。因此，發(fā)現(xiàn)一種特有的、可用于早期診 斷和預(yù)后的標(biāo)記物和祀向分子，對于戰(zhàn)勝膜腺癌具有重要意義。
[0003] microRNAs(miRNAs)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種長約22個(gè)核巧酸的內(nèi)源性非編碼RNA，可 與目的基因3'UTR結(jié)合降解mRNA和(或)抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)。人類基因組中 目前已經(jīng)被鑒定的miRNA數(shù)目在1000個(gè)W上，miRNA具有高度保守性，在個(gè)體生長發(fā)育W及 包括腫瘤在內(nèi)的多中疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。最近的許多研究發(fā)現(xiàn)miRNA參 與腫瘤細(xì)胞的增殖、調(diào)亡、分化、耐藥及侵襲轉(zhuǎn)移，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。
[0004] 研究表明，在不同的腫瘤中，miR-506的功能不盡相同。miR-506在徑喜樹堿耐藥的 結(jié)腸癌細(xì)胞中高表達(dá)，miR-506的過表達(dá)可W下調(diào)PPARa提高癌細(xì)胞的耐藥性。在黑色素瘤 中，miR-506可W啟動(dòng)黑色素細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、促進(jìn)黑色素瘤的生長。相反，在惡性轉(zhuǎn)化后的 人支氣管上皮細(xì)胞（16皿E-T)中miR-506低表達(dá);過表達(dá)miR-506后可W抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo) G0/G1細(xì)胞周期阻滯，明顯抑制細(xì)胞的錯(cuò)定非依賴生長W及裸鼠移植瘤模型的生長。但miR-506 在調(diào)節(jié)膜腺癌的的表達(dá)及臨床相關(guān)性， W 及它所發(fā)揮的作用和分子機(jī)制仍未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供miR-506在制備預(yù)防或/和治療膜腺癌的藥 物中的應(yīng)用;本發(fā)明的目的之二在于提供miR-506與吉西他濱聯(lián)合用于制備預(yù)防或/和治療 膜腺癌的藥物中的應(yīng)用;本發(fā)明的目的之S在于提供檢測miR-506的試劑在制備診斷和預(yù) 示膜腺癌試劑盒中的應(yīng)用。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0007] l、miR-506在制備預(yù)防或/和治療膜腺癌的藥物中的應(yīng)用。
[000引進(jìn)一步，所述miR-506在制備抑制膜腺癌細(xì)胞增殖的藥物中的應(yīng)用。
[0009] 進(jìn)一步，所述miR-506在制備抑制膜腺癌成瘤能力的藥物中的應(yīng)用。
[0010] 進(jìn)一步，所述miR-506在制備誘導(dǎo)膜腺癌細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯的藥物中的應(yīng)用。
[0011] 進(jìn)一步，所述miR-506在制備誘導(dǎo)膜腺癌細(xì)胞調(diào)亡的藥物中的應(yīng)用。
[0012] 2、miR-506與吉西他濱聯(lián)合用于制備預(yù)防或/和治療膜腺癌的藥物中的應(yīng)用。
[OOU] 3、檢測miR-506的試劑在制備診斷和預(yù)示膜腺癌試劑盒中的應(yīng)用，miR-506在膜腺 癌中明顯低表達(dá)。
[0014] 進(jìn)一步，所述診斷和預(yù)示為評估膜腺癌預(yù)后效果，miR-506低表達(dá)的膜腺癌患者預(yù) 后差。
[0015] 本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明通過對miR-506在膜腺癌、癌旁組織和正常膜腺表 達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在膜腺癌組織及膜腺癌細(xì)胞中miR-506明顯低表達(dá)，臨床分析顯示miR-506 低表達(dá)的膜腺癌患者預(yù)后差，因此 miR-506 可 W 作為診斷和預(yù)示膜腺癌的標(biāo)志物。進(jìn)一 步探索miR-506低表達(dá)的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)miR-506啟動(dòng)子在癌組織中高甲基化，在癌旁及正常膜 腺組織中低甲基化，并且甲基化水平和miR-506表達(dá)呈負(fù)相關(guān);用去甲基化試劑處理膜腺癌 細(xì)胞株后發(fā)現(xiàn)miR-506表達(dá)上調(diào)，表明甲基化可能是miR-506低表達(dá)的主要原因，臨床分析 還發(fā)現(xiàn)高甲基化與膜腺癌患者預(yù)后負(fù)相關(guān)。
[0016] 通過在膜腺癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-506發(fā)現(xiàn)miR-506miR-506顯著抑制膜腺癌細(xì)胞增 殖抑制裸鼠皮下成瘤能力，降低Ki-67表達(dá)，流式檢測表明miR-506誘導(dǎo)膜腺癌細(xì)胞細(xì)胞周 期阻滯和調(diào)亡，調(diào)亡標(biāo)志物cleaved-PARP和caspase-3在過表達(dá)miR-506組中明顯上調(diào)，因 此miR-506可W作為預(yù)防和治療膜腺癌的藥物;通過細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)miR-506增強(qiáng)膜腺 癌細(xì)胞對吉西他濱的敏感性，因此miR-506可W與吉西他濱聯(lián)合用藥，提高吉西他濱的治療 效果。進(jìn)一步對治療或預(yù)防膜腺癌的機(jī)制進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，miR-506和SP皿1的表達(dá)在細(xì)胞株 及膜腺癌組織中呈負(fù)相關(guān)，miR-506還可W下調(diào)PI3K/AKT通路下游相關(guān)分子表達(dá)，表明miR-506通過SPHK1/PI3K/AKT信號通路抑制膜腺癌生長，促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯和調(diào)亡，為膜腺癌的 治療提供了新的標(biāo)志物，對臨床膜腺癌的診斷和治療具有重要意義。
【附圖說明】
[0017] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0018] 圖1為膜腺癌、癌旁組織及正常膜腺組織中miR-506表達(dá)結(jié)果(a.膜腺癌與癌旁組 織比較結(jié)果，Aj表示癌旁組織，T表示膜腺癌組織;b.正常組織與膜腺癌組織比較結(jié)果，N表 示正常組織，T表示膜腺癌組織;C.生存分析結(jié)果）。
[0019] 圖2為膜腺癌、癌旁組織及正常膜腺組織中miR-506啟動(dòng)子甲基化檢測結(jié)果(a.癌 旁組織與膜腺癌組織比較結(jié)果，Aj表示癌旁組織，T表示膜腺癌組織;b.正常組織與膜腺癌 組織比較結(jié)果，N表示正常組織，T表示膜腺癌組織;C.甲基化水平與miR-506表達(dá)分析結(jié)果； d.焦憐酸測序代表圖）。
[0020] 圖3為去甲基化試劑處理膜腺癌細(xì)胞株對miR-506表達(dá)的影響及臨床生存分析結(jié) 果(a.去甲基化試劑處理膜腺癌細(xì)胞株與未處理細(xì)胞株miR-506表達(dá)情況;b.臨床生存分析 結(jié)果）。
[0021] 圖4為細(xì)胞增殖、成瘤能力和細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果(a和b為miR-506過表達(dá)細(xì)胞膜腺 癌細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果;C和d為miR-506過表達(dá)細(xì)胞成瘤能力檢測結(jié)果;e和f為流式細(xì)胞術(shù)檢 ^UmiR-506過表達(dá)細(xì)胞膜腺癌細(xì)胞細(xì)胞周期結(jié)果）。
[0022] 圖5為細(xì)胞調(diào)亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果(a和b為流式細(xì)胞述檢測miR-506誘導(dǎo)膜腺癌細(xì)胞調(diào)亡結(jié) 果；C和d為過表達(dá)miR-506對吉西他濱的敏感性實(shí)驗(yàn)；e為Western blot檢測示過表達(dá)miR-506 細(xì)胞中 cleaved-PARP 和 caspase-3 表達(dá)情況 ）。
[0023] 圖6為檢測miR-506與SP服1作用（a.正常膜腺細(xì)胞株冊C-Y5和人膜腺癌細(xì)胞株 AsPC-I ,CFPAC-I，Hs766t，PANC-l，BxPC-3的miR-506基因與SPHKl蛋白表達(dá)結(jié)果；b.miR-506 基因與SPHKl蛋白的線性關(guān)系）。
[0024]圖7為雙巧光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果(a.野生型和突變型SP皿13'-UTR序列比對圖；b. 雙巧光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)示巧光表達(dá)情況）。
[00巧]圖8為Western blot檢測PI3K/AKT通路下游相關(guān)分子表達(dá)情況。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體 條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0027] 本發(fā)明中膜腺癌及癌旁組織從第=軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院肝膽外科取得，正常膜腺組 織從器官捐獻(xiàn)者獲取，手術(shù)取出后，組織塊W生理鹽水沖洗干凈，迅速將組織切成小塊，部 分樣品放入2mL凍存管中與液氮中保存?zhèn)溆谩?br>[00%] -、膜腺癌、癌旁組織及正常膜腺組織中miR-506表達(dá)情況
[0029] 首先根據(jù)miR-506基因序列：71-uaaggcacc州ucugaguaga-91(SEQ ID NO. 1)，設(shè)計(jì) 檢測miR-506的引物，具體引物序列如下：5'-taaggcacccttctgagtaga-3'（SEQ ID N0.2)， 然后分別取膜腺癌、癌旁組織及正常膜腺組織，提取總RNA，反轉(zhuǎn)為cDNA后獲得的cDNA為模 板，SEQ ID NO.2所示引物為模板進(jìn)行RT-qPCR檢測miR-506表達(dá)情況，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果 顯示，與癌旁組織相比，miR-506在膜腺癌中低表達(dá)（圖1中a);與正常膜腺癌組織相比，miR-506 在膜腺癌中低表達(dá)(n=84)( 圖1 中b);進(jìn)一步臨床生存分析表明miR-506 低表達(dá)患者較 miR-506高表達(dá)患者預(yù)后差（圖1中C)。上述結(jié)果表明miR-506可W作為區(qū)分膜腺癌與正常膜 腺組織W及膜腺癌患者預(yù)后標(biāo)志物。
[0030] 其中提取總RNA方法如下：取約IOOmg組織放于玻璃研磨器內(nèi)，先加0.2ml的化izol (I^KaRa，大連)溶液，研磨組織后，倒1.5m化P管中，再在研磨器內(nèi)加入0.8ml的化iZOl溶液 洗，后全部再倒入EP管中；顛倒混勻10下，室溫（18~25°C)靜置5分鐘。分離階段：每1ml 化izol中加0.2ml氯仿，蓋緊樣品管蓋，用手用力搖晃試管15秒，使其充分混勻，室溫（18~ 25°C)靜置5分鐘后12000rmp離屯、15分鐘；然后將上層水相轉(zhuǎn)入新的1.5mlEP管中（約400-SOOjil)，加入0.5ml異丙醇，混勻后放于室溫（18~25°C)3分鐘后ISOOOrmp離屯、10分鐘；小屯、 倒掉上清，留取沉淀，加 Iml現(xiàn)配的75%的乙醇(預(yù)冷)振蕩洗涂RNA沉淀一次，后7500rmp離 屯、5分鐘，小屯、倒掉上清，取沉淀置超凈工作臺開風(fēng)機(jī)吹干（約20分鐘，此時(shí)RNA沉淀變透 明）；操作時(shí)不能讓RNA沉淀完全干燥(會(huì)極大地降低它地可溶性），再在管中加20iU的DEPC 水溶解，在55-60°C下解育10分鐘助溶。RNA的保存提取的RNA保存于-70°C超低溫冰箱中，或 立即用于逆轉(zhuǎn)錄。
[0031 ] RT-qPCR檢測方法如下：miRNA反轉(zhuǎn)錄應(yīng)用PrimeScript RT reagent kit (hKaRa)，WcDNA為模板，使用miR-506特定的引物及SYBR Premix Ex hq II(TaKaRa)試 劑盒的PCR體系，在Stratagene Mx3000P PCR儀（Agilent Technologies,San1:a Clara,CA, USA)上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:95°C30s;95°C5s、60°C30s，共40個(gè)循環(huán)，并WU6作內(nèi)參，正向 引物序列：5'-。1:。邑。1:1:。邑邑。曰邑。曰。曰-3'（56〇10^.6);反向弓|物序列：5'-aacgcttcacgaatttgcgt-3'（沈Q ID N0.7)。
[0032] 二、檢測miR-506啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)
[0033] 為探索了miR-506低表達(dá)的機(jī)制，采用亞硫酸氨鹽轉(zhuǎn)化焦憐酸測序的方法檢測膜 腺癌、癌旁組織及正常膜腺組織中miR-506啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)。焦憐酸測序按上 海生工生物技術(shù)有限公司試驗(yàn)方法參照說明書進(jìn)行，基本流程通過亞硫酸氨鹽處理基因組 DNA，使其中未甲基化的C轉(zhuǎn)變成T后，運(yùn)用特異性引物擴(kuò)增目的區(qū)段，然后用焦憐酸測序技 術(shù)測定目標(biāo)位點(diǎn)中C/T的比率，W此判斷目標(biāo)位點(diǎn)的甲基化程度。其中擴(kuò)增引物如下：正向 5'一t曰邑t曰t邑邑11邑曰t邑邑t邑邑t邑邑t曰一3'（SEQ ID NO.3)，& S 5'一biOtin- actcaataataaatcaactcatacaacc-3'（SEQ ID 則.4);測]序弓|物：5'-gtggtggtattgattattt1:aat-3'（沈Q ID N0.5)，檢測結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，miR-506啟 動(dòng)子在癌組織中高甲基化，在癌旁及正常膜腺組織中低甲基化（圖2中a和b);然后分析甲基 化與甲基化的相關(guān)性，顯示甲基化水平和miR-506表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（圖2中C和d)。