小分子非編碼RNAmiR-100在制備用于治療腫瘤包繞型血管類型肝癌的藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及小分子非編碼RNA miR-100及其在制備VETC血管類型肝癌治療藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其中50%發(fā)生于中國，且發(fā)病率和致死率逐年上升，嚴(yán)重危害我國人民的健康。眾所周知，易于發(fā)生轉(zhuǎn)移是癌癥難以根治并導(dǎo)致病人死亡的主要原因。一般認(rèn)為，腫瘤中微血管密度越高，腫瘤越易于發(fā)生血行轉(zhuǎn)移。但是，肝癌的微血管密度與肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系仍存在爭議。最近我們發(fā)現(xiàn):除毛細(xì)管狀血管，肝癌中還廣泛存在VETC(Xessels thatencapsulate tumor fluster，腫瘤包繞型血管)類型血管，它們相連成網(wǎng)，將腫瘤塊包繞分隔開。具備VETC血管類型的肝癌病人通常術(shù)后復(fù)發(fā)率更高，生存時間更短。更為重要的是，VETC能夠通過與癌旁血管融合釋放被VETC分隔的腫瘤塊，從而幫助腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移。這提示:VETC血管結(jié)構(gòu)對腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移具有重要的影響，因此制備針對VETC血管類型肝癌的治療藥物具有重要的應(yīng)用價值。
[0003]Sugino等于2002年最早報道了腫瘤中類似VETC的血管結(jié)構(gòu)的存在，他們觀察到乳腺癌細(xì)胞移植瘤中血管發(fā)展成融合的血竇樣結(jié)構(gòu)，并包繞腫瘤團(tuán)塊;隨后，該課題組在人肝癌、腎癌和甲狀腺癌中都觀察到融合的血竇樣結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。我們之前的報道首次證明了VETC結(jié)構(gòu)是肝癌獨(dú)立的預(yù)后不良預(yù)測因素，與肝癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。至今，關(guān)于VETC形成的潛在分子機(jī)制知之甚少。分別有兩個研究小組發(fā)現(xiàn):乳腺癌細(xì)胞株過表達(dá)SLPI和黑色素瘤過表達(dá)VEGFA可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞株成瘤組織中VETC結(jié)構(gòu)血管的形成，但是具體機(jī)制不明。最近，我們首次揭示了 Ang-2是誘導(dǎo)VETC形成的關(guān)鍵分子，在腫瘤細(xì)胞中敲低Ang-2的表達(dá)能夠顯著破壞VETC的形成，并最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)移率下降。
[0004]Ang-2是血管重塑的重要調(diào)控分子，能夠通過結(jié)合其受體Tie-2，激活下游信號通路，下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中粘附分子VE-Cad的表達(dá)，增加血管的通透性，并抑制周細(xì)胞的募集，從而阻礙血管成熟。缺少周細(xì)胞保護(hù)的不成熟血管通常處于一種不穩(wěn)定的狀態(tài)，它們通過感受外部信號，決定是出芽還是凋亡。在缺乏促血管生成信號的情況下，Ang-2高表達(dá)會導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)生血管衰退;然而在富含VEGF等促血管生成信號的腫瘤中，Ang-2會促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞接受促血管生成信號，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和迀移，引起血管生成。研究表明，Ang-2在多種腫瘤組織中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與患者的生存時間顯著負(fù)相關(guān)。多個基于動物模型的研究表明，抑制Ang-2的活性不僅能夠增加腫瘤血管上周細(xì)胞的覆蓋，使得血管正?；?，還顯著抑制了移植瘤的血管生成以及腫瘤生長。我們的前期結(jié)果表明，抑制肝癌細(xì)胞中Ang-2的表達(dá)不僅能夠抑制VETC的形成，還能夠抑制轉(zhuǎn)移。由此可見，Ang-2主要起到促腫瘤的作用，是一個重要的抗血管藥物潛在的靶分子。
[0005]microRNA(miRNA)是一類保守的小分子非編碼RNA，通過識別靶基因的3’非編碼區(qū)域(3’UTR)抑制mRNA翻譯或促進(jìn)蛋白降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白編碼基因的表達(dá)。miRNA的異常調(diào)控已被證實參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。由于一個miRNA通常能夠識別多個蛋白編碼基因，同時調(diào)控多種生物學(xué)功能，包括增殖、凋亡、血管生成和轉(zhuǎn)移等等，因此在腫瘤中過表達(dá)miRNA是一種潛在的抗腫瘤治療策略。然而，國內(nèi)外文獻(xiàn)中至今未見有關(guān)miRNA參與VETC血管類型調(diào)控的研究報道。因此，研究miRNA在VETC類型血管生成中的作用及其在肝癌診治中的應(yīng)用，對于制備高效的抗腫瘤血管生成藥物以及腫瘤個體化治療意義重大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種抑制腫瘤細(xì)胞Ang-2表達(dá)和形成VETC血管，進(jìn)而治療肝癌的小分子非編碼RNA。
[0007]首先，本發(fā)明的內(nèi)容小分子非編碼RNA miR-100在制備用于治療VETC血管類型肝癌的藥物中的應(yīng)用，其中所述miR-100的RNA序列為:
[0008]miR-100，5’-AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3 ’；
[0009]在另一實施方案中，本發(fā)明的小分子非編碼RNAmiR-100抑制腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)形成VETC血管。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的小分子非編碼RNA miR-100抑制腫瘤細(xì)胞中Ang-2的表達(dá)。
[0010]在另一實施方案中，本發(fā)明提供了用于治療VETC血管類型肝癌的藥物，其包含所述小分子非編碼miR-100。
[0011]在另一實施方案中，本發(fā)明提供了用于治療VETC血管類型肝癌的藥物，其包含能表達(dá)miR-100的試劑。在優(yōu)選的實施方案中，所述表達(dá)miR-100的試劑包括RNA擬似物、過表達(dá)miR-100的質(zhì)粒和攜帶有miR-100序列的病毒。
[0012]本發(fā)明的內(nèi)容還包括所述能表達(dá)miR-100的試劑在在制備用于治療VETC血管類型肝癌的藥物中的用途。
[0013]進(jìn)一步，本發(fā)明的內(nèi)容還包括小分子非編碼RNAmiR-100在制備抑制腫瘤細(xì)胞中Ang-2的表達(dá)和抑制腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)形成腫瘤包繞型血管的試劑中的用途。
[0014]本發(fā)明通過免疫組化和實時定量PCR檢測了人肝癌組織標(biāo)本，表明肝癌病人組織標(biāo)本中miR-100的低表達(dá)與病人組織腫瘤包繞型血管類型以及Ang-2的高表達(dá)顯著相關(guān);小鼠成瘤實驗的結(jié)果表明恢復(fù)miR-100的表達(dá)可顯著抑制肝癌細(xì)胞表達(dá)Ang-2、形成VETC類型血管和轉(zhuǎn)移的能力。因此，miR-100均可用于制備治療形成VETC血管類型的肝癌病人的藥物，具有很好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0015]圖1為肝癌組織標(biāo)本miR-100的表達(dá)水平與包繞型血管VETC的相關(guān)性統(tǒng)計圖。圖1是實施例1的實驗結(jié)果。
[0016]圖2為小鼠移植瘤實驗結(jié)果圖，檢測在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-100對血管形態(tài)和轉(zhuǎn)移的影響。其中，圖2A是免疫組化檢測人原代肝癌細(xì)胞VETC-2小鼠移植瘤中包繞型血管的代表圖和血管指數(shù)統(tǒng)計圖，代表圖下方標(biāo)示對應(yīng)的每組發(fā)生轉(zhuǎn)移的荷瘤小鼠數(shù)目/成瘤小鼠總數(shù)；圖2B是鼠肝癌細(xì)胞Hepal-6移植瘤的包繞型血管指數(shù)統(tǒng)計圖。圖2是實施例2中的實驗結(jié)果。
[0017]圖3為miR-100調(diào)控肝癌細(xì)胞表達(dá)Ang-2的實驗結(jié)果圖。其中，圖3A為在VETC-2或Hepal-6細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá)miR-100后，肝癌細(xì)胞中Ang-2蛋白水平的蛋白質(zhì)印跡檢測圖；圖3B為在VETC-2或Hepal-6細(xì)胞中拮抗內(nèi)源miR-100后，細(xì)胞中Ang-2蛋白水平的蛋白質(zhì)印跡檢測圖。圖3是實施例3中的實驗結(jié)果。
[0018]圖4為檢測VETC-2和Hepal-6形成的小鼠移植瘤中Ang-2表達(dá)的實驗結(jié)果圖。其中，圖4A為免疫組化檢測穩(wěn)定過表達(dá)miR-100或?qū)φ盏腣ETC-2小鼠移植瘤Ang-2表達(dá)的代表圖和其相對表達(dá)量的統(tǒng)計圖；圖4B為免疫組化標(biāo)記穩(wěn)定過表達(dá)miR-100或其對照的Hepal-6小鼠移植瘤Ang-2表達(dá)的統(tǒng)計圖。圖4是實施例3中的實驗結(jié)果。
[0019]圖5為人肝癌組織中miR-100和Ang-2表達(dá)相關(guān)性的統(tǒng)計圖。圖5是實施例3中的實驗結(jié)果。
【具體實施方式】
[0020]以下結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。應(yīng)理解，以下實施例只用于說明本發(fā)明而不以任何形式限制本發(fā)明。
[0021]本發(fā)明所采用的miR-100擬似物由上海吉瑪公司合成，序列從Sanger microRNA序列數(shù)據(jù)庫miRBase Vl 5.0獲得，其雙鏈RNA序列從5 ’端到3 ’端分別為:
[0022]miR-100正義鏈，5’ -AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3’ ；
[0023]miR-100反義鏈，5’ -AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3’。
[0024]陰性對照組的陰性對照RNA序列(也稱NC)為上海吉瑪公司合成的用于SiRNA實驗的標(biāo)準(zhǔn)陰性對照序列，其RNA序列從5，端到3，端分別為:
[0025]正義鏈，5，-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3，；
[0026]反義鏈，5，-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3，。
[0027]本發(fā)明所采用的慢病毒載體為pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP(簡稱pCDH)，購自System B1sciences;慢病毒包裝體系Lent1-X HTX Packaging Mix購自 Clontech。
[0028]實施例1:人組織標(biāo)本miR-100的表達(dá)肝癌組織血管類型密切相關(guān)
[0029]1.1實時定量?0?(9?00檢測
[0030](I)RNA提取:切取肝癌組織(收集于中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院標(biāo)本庫)，用Trizol裂解，提取RNA;
[0031](2)逆轉(zhuǎn)錄和PCR:利用TaqMan MicroRNA Assay kit試劑盒(購自ABI)提供的反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR JCR反應(yīng)中每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔，得到每個PCR循環(huán)反應(yīng)的Ct值。用核小分子RNA RNU 6 B的表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，得到目標(biāo)m i RNA的表達(dá)值為2—Λ G * ( Δ C t =
Ct革QniR-Ct養(yǎng)翻)ο
[0032]1.2免疫組化檢測
[0033]人肝癌組織的切片由中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院標(biāo)本庫提供。制成4μπι石蠟切片4°C保存。后續(xù)檢測步驟為:
[0034](I)脫蠟以及抗原修復(fù):55°C烤片30min以上，放于二甲苯中脫蠟兩次，1min/次；依次用100%、95%、90%、80%、70%和雙蒸水洗311^11;然后用0.3%的雙氧水處理101^11，滅活內(nèi)源性過氧化物酶;雙蒸水再洗3次，3min/次;浸泡于修復(fù)液中，于1mM檸檬酸鈉修復(fù)液(pH 6.0)中微波修復(fù)1min，室溫冷卻半小時；I XPBS洗3次，3min/次；
[0035](2)抗體孵育及染色:用抗人CD34的抗體(購自Santa Cruz公司)進(jìn)行孵育，4°C過夜;恢復(fù)室溫，棄去抗體液，用I XI3BS洗3次，5min/次;加入二抗，37°C半小時JlX I3BS洗3次，5min/次;加入DAB顯色液進(jìn)行顯色，然后用蘇木精復(fù)染。
[0036](3)計數(shù):根據(jù)⑶34染色鏡下判斷血管類型；視野中若觀察到包繞型結(jié)構(gòu)的血管(VETC)，則定義為VETC+，反之則定義為VETC一。
[0037]1.3結(jié)果分析
[0038]如圖1所示，我們共檢測了106份肝癌組織標(biāo)本，通過染色⑶34標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，再根據(jù)血管形態(tài)分組，發(fā)現(xiàn)所檢測的肝癌組織中有37例(35%)具有VETC血管結(jié)構(gòu)，定義為VETC+標(biāo)本，有69 (65 %)未檢測到VETC血管結(jié)構(gòu)，定義為VETC—標(biāo)本。利用qPCR檢測對應(yīng)肝癌組織標(biāo)本中miR-100的表達(dá)水平，與血管類型進(jìn)行相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)miR-100在VETC+的肝癌組織中表達(dá)顯著低于VETC—組織(P〈0.001，T檢驗)。
[0039]上述結(jié)果顯示，肝癌病人組織miR-100的表達(dá)下調(diào)可能促進(jìn)了 VETC的形成。
[0040]實施例2:miR-100抑制移植瘤形成VETC和發(fā)生轉(zhuǎn)移
[0041]2.1細(xì)胞感染
[0042](I)構(gòu)建表達(dá)miR-100的病毒載體:miR-100的表達(dá)片段以正常人外周血白細(xì)胞的RNA逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物插入pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP(pCDH, System B1sciences ,CA)骨架EcoRI和BamHI的位點
[0043](2)包裝病毒:于24孔板中，用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將0.3yg包裝混合質(zhì)粒和0.3yg表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)至預(yù)先貼好的293T包裝細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后48h收集含有慢病毒的上清。50