用于組織再生的包含膠原和prp的組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】 [0001] 和【背景技術(shù)】
[0002] 本發(fā)明，在其一些實(shí)施方案中，涉及用于組織再生并且，更特別地，但不完全用于 軟組織再生的包含膠原和富血小板血漿（PRP)的組合物。
[0003] 富血小板血漿（PRP)是富集血小板的血漿。作為自體血小板的濃縮來(lái)源，PRP含 有（并且通過(guò)脫粒釋放）幾種不同的生長(zhǎng)因子和刺激骨和軟組織愈合的其它細(xì)胞因子。
[0004] 隨著血小板通過(guò)經(jīng)由α-顆粒脫粒釋放局部作用生長(zhǎng)因子而引發(fā)傷口修復(fù)，PRP 起到組織封閉劑和藥物遞送系統(tǒng)的作用。血小板的α-顆粒中所含的分泌蛋白包括血小板 源生長(zhǎng)因子（PDGF-AA、BB和ΑΒ異構(gòu)體）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、血小板因子4 (PF4)、 白細(xì)胞間素-l(IL-l)、血小板源血管生成因子（PDAF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)、上皮生 長(zhǎng)因子（EGF)、血小板源內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（PDEGF)、上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ECGF)、胰島素樣生長(zhǎng) 因子（IGF)、骨鈣素（0c)、骨粘連蛋白（On)、纖維蛋白原（Ff)、玻連蛋白（Vn)、纖連蛋白 (Fn)和血小板反應(yīng)蛋白-l(TSP-l)。這些生長(zhǎng)因子通過(guò)吸引新形成的基質(zhì)中的未分化細(xì)胞 并觸發(fā)細(xì)胞分裂而幫助愈合。PRP可抑制細(xì)胞因子釋放并限制炎癥，與巨噬細(xì)胞相互作用以 提高組織愈合和再生，促進(jìn)新毛細(xì)血管生長(zhǎng)，并加速慢性傷口中的上皮形成。
[0005] PRP中的血小板通過(guò)生成吸引巨噬細(xì)胞的信號(hào)蛋白在傷口部位的宿主防御機(jī)制 中也起作用；PRP也可含有少量合成作為非特異性免疫反應(yīng)的一部分的白細(xì)胞間素的白細(xì) 胞。
[0006] PRP向損傷部位的遞送和滯留由于其液體狀態(tài)并且因此物質(zhì)可能向周?chē)M織損失 而仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。凝血酶（主要為牛源性）是用于凝塊形成和增加PRP膠凝化的常見(jiàn)血 小板活化因子。凝血酶的使用具有幾個(gè)缺點(diǎn)。凝血酶在人類(lèi)中具有不良免疫反應(yīng)。另外，體 外研究已顯示出對(duì)細(xì)胞增殖和活力的抑制（LawsonJH.SeminThrombHemost，2006 ;32(增 刊 1)98-110;MurrayMM等，JOrthopRes. 2007 35(1)第 81-91 頁(yè)）。
[0007] 發(fā)現(xiàn)天然介入內(nèi)在凝血級(jí)聯(lián)的I型膠原是用于血小板活化的凝血酶的有吸引力 的替代物。除了是哺乳動(dòng)物結(jié)締組織中的主要蛋白組分外，I型膠原是研究最多的用于再 生醫(yī)學(xué)和組織工程學(xué)的天然支架。
[0008] 幾項(xiàng)體外研究調(diào)查了從受凝血酶或膠原活化的PRP凝塊的細(xì)胞因子釋放以便表 征其釋放曲線(xiàn)（TsayRC等，JOralMaxillofacSurg，2005 63 第 521-528 頁(yè)；FufaD等， JOralMaxillofacSurg，2008 66(4)第684-690頁(yè)）。經(jīng)證實(shí)呈不同物理狀態(tài)、可溶或原 纖維的I型膠原在幾天內(nèi)刺激TGF、PDGF和VEGF的釋放與凝血酶一樣有效。培育經(jīng)凝血酶 或I型膠原活化的PRP的培養(yǎng)物長(zhǎng)達(dá)15天并且證實(shí)基于膠原的凝塊在大部分基于凝血酶 的凝塊降解時(shí)保持其初始形狀和尺寸。
[0009] Laci等，YaleJBiolMed. 2010March;83(1) :1 -9 教導(dǎo)稱(chēng)氯化鈣可用于活化PRP 凝塊。
[0010] 美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第20120201897號(hào)教導(dǎo)了用于活化PRP凝塊的氯化鈣和I型膠原的 組合。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了一種包含交聯(lián)膠原、富血小板血漿 (PRP)和無(wú)機(jī)鹽的物質(zhì)組合物。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了一種包含膠原、富血小板血漿（PRP) 和無(wú)機(jī)鹽的物質(zhì)組合物，其在37°C下培育10天后能夠釋放超過(guò)4000pg/ml的血小板源生長(zhǎng) 因子（TOGF)。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了一種在有需要的受試者中治療傷口 或誘導(dǎo)組織再生的方法，其包括向所述受試者施用治療有效量的本文所述的物質(zhì)組合物， 從而治療所述傷口或誘導(dǎo)組織再生。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的一個(gè)方面，提供了一種生成用于治療傷口或誘導(dǎo)組織 再生的物質(zhì)組合物的方法，其包括：
[0015] (a)生成膠原和無(wú)機(jī)鹽的混合物；并且
[0016] (b)使所述混合物與PRP接觸，從而生成用于治療傷口或誘導(dǎo)組織再生的所述物 質(zhì)組合物。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述無(wú)機(jī)鹽選自鈉鹽、氯鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、磷酸 鹽、硫酸鹽和羧酸鹽。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述無(wú)機(jī)鹽選自NaCl、KC1、CsCl、CaCl2、CsF、KC104、 NaNOjPCaSO4。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述無(wú)機(jī)鹽為CaCl2。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述物質(zhì)組合物呈液態(tài)。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述物質(zhì)組合物呈半固態(tài)。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述物質(zhì)組合物可縫合。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述膠原包含人膠原。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述膠原包含I型膠原。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述膠原包含原纖化膠原。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述膠原包含重組膠原。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述重組膠原在植物中生成。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述膠原以約10_50mg/ml的濃度存在。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述膠原以約20-30mg/ml的濃度存在。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述氯化鈣以約7_60mM的濃度存在。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述物質(zhì)組合物能夠在37°C下在約6-7分鐘內(nèi)產(chǎn)生 凝塊。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述凝塊可縫合。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述組合物在37°C下培育30天后耐降解。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述受試者具有腱或骨疾病。
[0035] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述組織為腱或骨。
[0036] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述物質(zhì)組合物用于在受試者中治療傷口或誘導(dǎo)組 織再生。
[0037] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述無(wú)機(jī)鹽選自鈉鹽、氯鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、磷酸 鹽、硫酸鹽和羧酸鹽。
[0038] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述無(wú)機(jī)鹽選自NaCl、KC1、CsCl、CaCl2、CsF、KC104、 NaNOjPCaSO4。
[0039] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述方法還包括在所述接觸之前干燥所述混合物。
[0040] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，通過(guò)原纖化重組膠原溶液獲得所述膠原。
[0041] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述方法還包括在所述原纖化之后交聯(lián)所述膠原。
[0042] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述干燥包括冷凍-干燥。
[0043] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述方法還包括在所述接觸之前用水合溶液水合所 述干燥之后的所述混合物。
[0044] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述水合溶液包含貧血小板血漿（PPP)。
[0045] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述交聯(lián)通過(guò)使所述膠原與EDC或DHT接觸而實(shí)現(xiàn)。
[0046] 除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和/或科學(xué)術(shù)語(yǔ)均具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域 中普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。雖然在本發(fā)明實(shí)施方案的實(shí)踐或試驗(yàn)中可使用與 本文所述類(lèi)似或等效的方法和材料，但是下面描述的是示例性方法和/或材料。如有沖突， 以專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)，包括定義為準(zhǔn)。另外，所述材料、方法和實(shí)例僅為說(shuō)明性而非旨在為必要性 限制。
【附圖說(shuō)明】
[0047] 本文僅以舉例的方式，參考附圖描述了本發(fā)明的一些實(shí)施方案?，F(xiàn)詳細(xì)地具體參 考附圖，強(qiáng)調(diào)所示細(xì)節(jié)僅舉例而言并且是為了說(shuō)明性討論本發(fā)明實(shí)施方案的目的。就這一 點(diǎn)而言，隨附圖所做的描述使得對(duì)于本領(lǐng)域中的技術(shù)人員而言可如何實(shí)踐本發(fā)明的實(shí)施方 案顯而易見(jiàn)。
[0048] 圖中：
[0049] 圖1為根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施方案，通過(guò)使用兩個(gè)注射器混合PRP的裝置的照 片。一個(gè)注射器裝有水合膠原的懸浮液。另一個(gè)注射器裝有PRP。通過(guò)用盧爾鎖（luer lock)連接兩個(gè)注射器進(jìn)行混合。
[0050] 圖2A-D為基于凝血酶-PRP的凝塊（A、B)和基于rh膠原-PRP的凝塊（C、D)的 SEM圖像。比例尺10μm?？梢杂^察到血小板細(xì)胞成分形成截留在原纖維成分（纖維蛋白） 之間的細(xì)胞聚塊。rh膠原纖維被截留在纖維蛋白成分中。
[0051] 圖3A-B說(shuō)明了凝塊形成10天后來(lái)自于兩種類(lèi)型的rh膠原制劑（交聯(lián)原纖化膠 原和非交聯(lián)原纖化膠原）相對(duì)于受CaCl2活化的PRP和自活化型PRP(A)及來(lái)自于30mg/ml 交聯(lián)rh膠原相對(duì)于受凝血酶活化、受CaCl2活化的PRP和自活化型PRP(B)的TOGF生長(zhǎng)因 子的體外累積釋放曲線(xiàn)。
[0052] 圖4為與凝血酶+PRP和PBS+CaCl2+PRP的對(duì)照相比基于rh膠原的凝塊的剪應(yīng) 力-應(yīng)變曲線(xiàn)。通過(guò)rh膠原薄片與CaCl2+PRP直接混合（膠原直接混合）或通過(guò)首先用 PBS水合rh膠原薄片，然后與CaCl2+PRP混合（經(jīng)由PBS的rh膠原）獲得兩種類(lèi)型的基于 rh膠原的凝塊。
[0053] 圖5A-B為說(shuō)明2天（圖5A)和12天（圖5B)后與基于凝血酶的凝塊（藍(lán)色圓 圈）相比，基于rh膠原的凝塊的降解測(cè)定的體內(nèi)結(jié)果的照片。可清楚地觀察到基于凝血酶 的凝塊完全降解?；趓h膠原的凝塊在相同時(shí)間段內(nèi)保持穩(wěn)定。
[0054] 圖6A-B說(shuō)明了接種3和7天后nHDF細(xì)胞增殖的結(jié)果。圖6A表示通過(guò)使用WST染 色檢測(cè)到的定量增殖。圖6B展示了對(duì)于30mg/ml原纖維、30mg/ml原纖維交聯(lián)膠原的凝塊 樣品及基于CaCljPPBS+PRP(無(wú)rh膠原）的混合物的凝塊而言，3和7天后在transwell 周?chē)鲋车募?xì)胞的顯微鏡檢查。
【具體實(shí)施方式】
[0055] 本發(fā)明，在其一些實(shí)施方案中，涉及用于組織再生并且，更特別地，但不完全用于 軟組織再生的包含膠原和富血小板血漿（PRP)的組合物。
[0056] 在詳細(xì)解釋本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方案之前，應(yīng)理解本發(fā)明在其應(yīng)用上不一定限 于以下描述中提出或通過(guò)實(shí)施例舉例說(shuō)明的細(xì)節(jié)。本發(fā)明能夠有其它實(shí)施方案或以各種方 式實(shí)踐或?qū)嵤?br>[0057] PRP是具有濃縮血小板的血漿。在PRP中發(fā)現(xiàn)的血小板高度濃縮并且包含生長(zhǎng)因 子，以及大量對(duì)激活和加速組織修復(fù)和再生至關(guān)重要的生物活性蛋白。生物活性蛋白增加 了引發(fā)結(jié)締組織的愈合、骨再生和修復(fù)、新血管的促進(jìn)和傷口愈合過(guò)程的刺激的干細(xì)胞的 產(chǎn)生。
[0058] 除非經(jīng)由凝血機(jī)制實(shí)現(xiàn)膠凝化，否則呈液體形式的PRP施加于傷口部位可伴有 PRP大量損失到周?chē)g隙中。目前使用牛凝血酶實(shí)現(xiàn)膠凝化。
[0059] 雖然牛凝血酶是有效的血小板活化因子，但是也引起抗凝血酶、凝血酶原、因子V 和心磷脂的抗體發(fā)展，及在動(dòng)物研究中作為結(jié)果而發(fā)生的范圍從嚴(yán)重術(shù)后出血到類(lèi)似于狼 瘡的自身免疫綜合征的臨床問(wèn)題。使用牛凝血酶還導(dǎo)致成纖維細(xì)胞通過(guò)膠原-PRP凝塊的 迀移受損，以及凝塊的強(qiáng)度受損。另外，用凝血酶-活化凝塊所見(jiàn)的高度凝縮使其難以用于 傷口-間隙填充應(yīng)用。
[0060] 本發(fā)明人提出使用膠原作為PRP的活化因子，由此配制膠原以便控制生長(zhǎng)因子從 凝塊釋放的速率。例如，如圖3A-B所示，本發(fā)明人證實(shí)與使用非交聯(lián)膠原活化PRP凝塊時(shí) 相比，當(dāng)使用交聯(lián)膠原活化PRP凝塊時(shí)釋放更多的血小板源生長(zhǎng)因子（PDGF)。另外，本發(fā)明 人提出可向制劑中添加氯化鈣以控制凝塊形成所需的時(shí)間。
[0061] 雖然為實(shí)踐而簡(jiǎn)化了本發(fā)明，但是本發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)膠原在PRP凝塊中起填料的 作用，由此膠原纖維被截留在凝塊的纖維蛋白成分中（圖2A-B)。有人提出膠原使纖維蛋白 成分相互連接的能力是造成凝塊強(qiáng)度和可縫合性的原因。
[0062] 因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面提出了一種包含交聯(lián)膠原、富血小板血漿（PRP)和 氯化鈣的物質(zhì)組合物。
[0063] 如本文中所用，短語(yǔ)"富血小板血漿"是指血小板的濃度高于外周血液的血漿。雖 然正常血小板計(jì)數(shù)范圍可從約140, 000至約400, 000個(gè)/微升，但是PRP的一些血小板濃 度可在約500, 000至約1，200, 000/微升或更高的范圍內(nèi)。PRP可由全血形成，并且可使用 自體、異體或混合的血小板和/或血漿來(lái)源獲得。PRP可由多種動(dòng)物來(lái)源，包括人類(lèi)來(lái)源形 成。
[0064] 通常，PRP可含有95%血小板與