0044](5)將復(fù)合壓縮支架轉(zhuǎn)入Trans-well細(xì)胞培養(yǎng)板上，在角膜基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中連續(xù)培養(yǎng)I周(小分子營養(yǎng)物質(zhì)可自由穿透壓縮膠原支架及PVA電紡膜，營養(yǎng)包埋在支架中的細(xì)胞)，收集備用。
[0045]實(shí)施例二:非定向PVA納米纖維膜，接種其他類型細(xì)胞，如皮膚基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞，構(gòu)建組織工程皮膚。
[0046]具體制備方法包括以下步驟:
[0047](1)、利用圖1所示的靜電紡絲設(shè)備制備非定向，膜厚可控，且厚度可到毫米級(jí)的PVA納米纖維膜片(即聚乙烯醇電紡膜片)，并在膜片上成型若干小孔。具體如下:
[0048]將聚乙烯醇固體顆粒在80°C蒸餾水中攪拌4h，配制成質(zhì)量濃度10%的PVA溶液，置于20mL的注射器中，與注射泵相連，注射器針頭為23G(內(nèi)徑0.34mm);
[0049]設(shè)置靜電紡絲設(shè)備的參數(shù)為:溶液流速為0.6mL/h，電壓為15KV，注射器針尖與收集裝置之間的距離為145mm，電紡時(shí)間為12h。上述參數(shù)下得到的PVA納米纖維支架厚度為700 μ m ；
[0050]利用激光器在PVA膜片上均勻打孔，孔的直徑為60 μ m，孔間距為160 μ m。
[0051](2)、配制含基質(zhì)細(xì)胞的膠原溶液，裝入模具，塑形，制得含基質(zhì)細(xì)胞的膠原支架。具體的，參照?qǐng)D2，將無菌I型膠原溶液(2.06mg/mL)、10MEM培養(yǎng)液、基質(zhì)細(xì)胞懸液(2.0 XlOVmL)充分混合，混合液體積1.8mL，調(diào)整溶液pH值至中性，將溶液移入預(yù)先定制的金屬模具9中，置于培養(yǎng)箱中塑形20min，得到600 μ m厚的膠原凝膠(膠原支架)10，使用相同的方法，得到另一個(gè)相同的含基質(zhì)細(xì)胞的膠原凝膠。
[0052](3)、在金屬模具中，以上述制備的兩個(gè)膠原凝膠分別做底層和頂層，以制備的PVA納米纖維膜做中間層，得到含基質(zhì)細(xì)胞的膠原凝膠-PVA電紡膜-膠原凝膠的復(fù)合支架，復(fù)合支架厚度為1900 μ m。
[0053](4)、將復(fù)合支架壓縮至指定厚度。具體的，如圖3所示，將上述復(fù)合支架轉(zhuǎn)移到無菌吸水濾紙上，復(fù)合支架的上下表面都鋪上無菌濾紗(主要起保護(hù)作用)，在上層濾紗表面置蓋玻片，在蓋玻片上置重物壓縮塑形好的復(fù)合支架至1000 μ m，移去重物、蓋玻片及濾紗，收集制作好的復(fù)合壓縮支架。
[0054](5)將復(fù)合壓縮支架轉(zhuǎn)入Trans-well細(xì)胞培養(yǎng)板上，在皮膚基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中連續(xù)培養(yǎng)I周(小分子營養(yǎng)物質(zhì)可自由穿透壓縮膠原支架及PVA電紡膜，營養(yǎng)包埋在支架中的細(xì)胞)，收集備用。
[0055]上述實(shí)施例中，定向纖維的收集可以通過定向纖維收集裝置中兩個(gè)薄碟之間的電場來實(shí)現(xiàn)；非定向纖維的收集可以通過纖維沉淀在兩個(gè)薄碟的平面上實(shí)現(xiàn)。
[0056]上述靜電紡絲設(shè)備的纖維收取裝置(圖中未示出)是將定向纖維收集裝置收集的定向纖維從懸空狀態(tài)收取下來，收集到方形塊(纖維收取裝置)上。通過控制方形塊的周期性轉(zhuǎn)動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)角度，即可收集到單層纖維定向排列，層與層纖維間成角度交錯(cuò)排列的PVA納米纖維膜。通過電紡時(shí)間的控制，即可收集到膜厚可控，且厚度可到毫米級(jí)的PVA納米纖維支架(PVA電紡膜片)，從而可以根據(jù)病患特點(diǎn)定制定厚膜片。
[0057]通過本發(fā)明方法制備的復(fù)合支架至少具有以下特點(diǎn):
[0058](I)生物相容性好:膠原蛋白是組織基質(zhì)層最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，是制作組織支架的最佳天然材料；
[0059](2)仿生性好:PVA電紡膜用于模擬正常組織定向板層結(jié)構(gòu)，由多個(gè)單層纖維定向?qū)优c層纖維成一定角度的板層結(jié)構(gòu)組成或非定向結(jié)構(gòu)；基質(zhì)細(xì)胞分布于板層支架中，且保持較高的細(xì)胞活力；在PVA膜片上激光打孔，便于膠原支架中的細(xì)胞及細(xì)胞分泌成分穿透PVA膜片，從而使膠原支架和PVA膜更有效地融為一體；
[0060](3)方便個(gè)性化構(gòu)建:PVA膜的板層結(jié)構(gòu)可控，壓縮膠原支架的細(xì)胞密度及膜片厚度可控，因此可根據(jù)臨床需求個(gè)性化構(gòu)建進(jìn)行個(gè)性化治療；
[0061](4)降解速度可控:通過調(diào)節(jié)膠原支架及PVA膜片的厚度比例或在膠原溶液中添加生物活性材料，從而改變膜片的組成成份，進(jìn)而影響到膜片的降解速度，滿足臨床不同降解速度需求。
[0062]本發(fā)明制備的壓縮膠原-PVA電紡膜-壓縮膠原復(fù)合支架可用于構(gòu)建人工組織植片，進(jìn)行移植手術(shù)，為臨床組織移植提供材料，在臨床組織再生領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種壓縮膠原-靜電紡絲膜-壓縮膠原復(fù)合支架，其特征在于:該復(fù)合支架由一個(gè)聚乙烯醇電紡膜片和兩個(gè)壓縮膠原支架組成，所述聚乙烯醇電紡膜片上均勻設(shè)置若干小孔，所述若干小孔的直徑為10-80 μ m，孔間距為50-200 μ m，所述兩個(gè)壓縮膠原支架相對(duì)應(yīng)地設(shè)置在所述聚乙烯醇電紡膜片的兩個(gè)表面，與所述聚乙烯醇電紡膜片構(gòu)成三層結(jié)構(gòu)的復(fù)合支架，壓縮膠原支架含有基質(zhì)細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的壓縮膠原-靜電紡絲膜-壓縮膠原復(fù)合支架，其特征在于:所述聚乙烯醇電紡膜片由多層納米纖維構(gòu)成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的壓縮膠原-靜電紡絲膜-壓縮膠原復(fù)合支架，其特征在于:構(gòu)成所述聚乙烯醇電紡膜片的多層納米纖維，在單層中纖維定向排列，不同層的纖維成角度交錯(cuò)排列。
4.一種壓縮膠原-靜電紡絲膜-壓縮膠原復(fù)合支架的制備方法，其特征在于，該制備方法包括以下步驟: 制備聚乙烯醇電紡膜片，并在膜片上成型若干小孔； 配制含基質(zhì)細(xì)胞的膠原溶液，裝入模具，塑形，制得含基質(zhì)細(xì)胞的膠原支架； 在模具中，以所述聚乙烯醇電紡膜片為中間層，兩個(gè)含基質(zhì)細(xì)胞的膠原支架分別為頂層和底層，構(gòu)成復(fù)合支架；以及 將復(fù)合支架壓縮至指定厚度。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的壓縮膠原-靜電紡絲膜-壓縮膠原復(fù)合支架的制備方法，其特征在于，該制備方法還包括: 在所述的將復(fù)合支架壓縮至指定厚度的步驟之后，將復(fù)合支架置于基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中一段時(shí)間，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的步驟。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的壓縮膠原-靜電紡絲膜-壓縮膠原復(fù)合支架的制備方法，其特征在于，所述的制備聚乙烯醇電紡膜片，并在膜片上成型若干小孔的步驟中，采用具有平行雙薄碟定向纖維收集裝置和纖維收取裝置的靜電紡絲設(shè)備制備聚乙烯醇電紡膜片，具體包括: 配制質(zhì)量濃度為8% -12%的聚乙烯醇溶液，注入靜電紡絲設(shè)備的注射器中； 設(shè)置靜電紡絲設(shè)備的參數(shù)為:溶液流速為0.4-0.8mL/h，電壓為12-18KV，注射器針尖與收集裝置之間的距離為140-190mm ;以及 控制所述纖維收集裝置、纖維收取裝置以及電紡時(shí)間，制得所述聚乙烯醇電紡膜片。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的壓縮膠原-靜電紡絲膜-壓縮膠原復(fù)合支架的制備方法，其特征在于，所述的控制所述纖維收集裝置、纖維收取裝置以及電紡時(shí)間，制得所述聚乙烯醇電紡膜片的步驟中，包括: 控制兩個(gè)薄碟之間的電場，實(shí)現(xiàn)纖維的定向收集；和/或 控制纖維收取裝置周期性轉(zhuǎn)動(dòng)并控制轉(zhuǎn)動(dòng)角度，以收集到單層纖維定向排列、不同層的纖維成角度交錯(cuò)排列的多層納米纖維膜；和/或 控制電紡時(shí)間，以獲得相應(yīng)厚度的多層納米纖維膜。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的壓縮膠原-靜電紡絲膜-壓縮膠原復(fù)合支架的制備方法，其特征在于，所述平行雙薄碟定向纖維收集裝置的薄碟的轉(zhuǎn)速介于200-1000rpm之間可調(diào)節(jié)，兩個(gè)薄碟之間的距離介于38-50mm之間可調(diào)節(jié)。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的壓縮膠原-靜電紡絲膜-壓縮膠原復(fù)合支架的制備方法，其特征在于， 所述的配制含基質(zhì)細(xì)胞的膠原溶液，裝入模具，塑形，制得含基質(zhì)細(xì)胞的膠原支架的步驟中，包括:將2.06mg/mL無菌I型膠原溶液、1MEM培養(yǎng)液、以及2.0 X 105/mL基質(zhì)細(xì)胞懸液充分混合，調(diào)整溶液PH值至中性，然后裝入模具，放入培養(yǎng)箱中塑形，制得含基質(zhì)細(xì)胞的膠原支架； 所述的將復(fù)合支架壓縮至指定厚度的步驟中，包括:將復(fù)合支架轉(zhuǎn)移到無菌吸水濾紙上，在復(fù)合支架的上下表面都鋪上無菌濾紗，在上層濾紗表面置蓋玻片，在蓋玻片上置重物壓縮復(fù)合支架，壓縮至指定厚度后移去重物、蓋玻片及濾紗，收集制作好的復(fù)合壓縮支架。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的壓縮膠原-靜電紡絲膜-壓縮膠原復(fù)合支架的制備方法，其特征在于， 所述的配制含基質(zhì)細(xì)胞的膠原溶液，裝入模具，塑形，制得含基質(zhì)細(xì)胞的膠原支架的步驟中，包括:根據(jù)需要調(diào)節(jié)膠原溶液中基質(zhì)細(xì)胞的密度，以最終獲得相應(yīng)細(xì)胞密度的壓縮膠原支架；和/或 所述的制備方法進(jìn)一步還包括:設(shè)置膠原支架及聚乙烯醇電紡膜片的厚度比例或在制備膠原支架的膠原溶液中添加生物活性材料，以控制復(fù)合支架的降解速度。
【專利摘要】本發(fā)明涉及壓縮膠原-靜電紡絲膜-壓縮膠原復(fù)合支架及制備方法，該復(fù)合支架由一個(gè)聚乙烯醇電紡膜片和兩個(gè)壓縮膠原支架組成，所述聚乙烯醇電紡膜片上均勻設(shè)置若干小孔，所述兩個(gè)壓縮膠原支架相對(duì)應(yīng)地設(shè)置在所述聚乙烯醇電紡膜片的兩個(gè)表面，與所述聚乙烯醇電紡膜片構(gòu)成三層結(jié)構(gòu)的復(fù)合支架，壓縮膠原支架含有基質(zhì)細(xì)胞。該制備方法包括：制備聚乙烯醇電紡膜片，并成型若干小孔；配制含基質(zhì)細(xì)胞的膠原溶液，裝入模具，塑形，制得含基質(zhì)細(xì)胞的膠原支架；在模具中用所述聚乙烯醇電紡膜片和含基質(zhì)細(xì)胞的膠原支架構(gòu)成復(fù)合支架；以及將復(fù)合支架壓縮至指定厚度。該復(fù)合支架具有很好的力學(xué)性能和高的仿生性能，可以模擬天然組織的結(jié)構(gòu)與性能。
【IPC分類】A61L27-50, A61L27-44, A61L27-58
【公開號(hào)】CN104841019
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510222532
【發(fā)明人】彌勝利, 孫偉, 孔彬, 吳嘯躍, 陳國詩
【申請(qǐng)人】清華大學(xué)深圳研究生院
【公開日】2015年8月19日
【申請(qǐng)日】2015年5月4日