一種復(fù)合支架材料的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及組織工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種復(fù)合支架材料。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨缺損是指由于創(chuàng)傷、感染、腫瘤、骨髓炎手術(shù)清創(chuàng)以及各種先天性疾病導(dǎo)致的骨 結(jié)構(gòu)完整性被破壞的疾病，是臨床常見病和多發(fā)病。對于骨缺損的治療主要通過自體骨移 植、異體骨移植、人工骨移植、組織工程骨移植、骨搬運技術(shù)等。其中，使用自體骨和人工骨 的移植術(shù)各有不足。自體骨的來源有限、術(shù)中額外失血及手術(shù)麻醉的時間較長以及可能出 現(xiàn)供區(qū)骨折、骨痛等并發(fā)癥；異體骨或人工骨雖然來源相對比較廣泛，但是只能提供被動的 支架功能，植入后新骨的爬行替代過程緩慢，骨不愈合率相對較高，具有傳播疾病的危險， 存在發(fā)生免疫排斥反應(yīng)的可能性。組織工程骨的發(fā)展，正是解決這個難題的可行方向。
[0003] 組織工程骨技術(shù)自20世紀80年代誕生以來為廣大骨缺損患者的治療帶來新的選 擇，其是利用組織工程的手段，構(gòu)建、培育活的骨組織，以修復(fù)或重建骨的結(jié)構(gòu)。組織工程骨 是一種人工制備的含有活體細胞的骨替代材料，它能形成新的功能性骨組織，可以修復(fù)大 塊骨缺損，它還可按需塑形及大量制備，是理想的骨修復(fù)材料。骨組織工程要求種子細胞應(yīng) 具備較強的增殖能力和良好的成骨功能。目前用的較多的種子細胞即是骨髓間充質(zhì)干細 胞，它的優(yōu)點是取材方便，體外培養(yǎng)擴增后細胞數(shù)量充足，進行自體移植而不存在免疫排斥 問題，目前在臨床中應(yīng)用廣泛，被認為是骨組織工程中較理想的種子細胞。
[0004] 但是骨髓間充質(zhì)干細胞來源有限，含量較低，骨髓的抽取需要骨穿刺才能獲得，對 機體造成的創(chuàng)傷較大，而且骨髓來源有限，其中含有復(fù)雜的細胞成分，干細胞在其中的含量 較低，需要較長的周期在體外擴增培養(yǎng)。因此，骨髓間充質(zhì)干細胞在臨床上應(yīng)用范圍較窄。 同時本研宄發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞存在成骨分化能力較低的問題，與支架材料的復(fù)合能力 差，礦化結(jié)節(jié)困難，這會進一步影響治療骨缺損的效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明提供了一種復(fù)合支架材料。該復(fù)合支架材料采用牙髓干細胞作 為種子細胞，并將其與殼聚糖和I型膠原聯(lián)合制成，通過體外成骨誘導(dǎo)試驗，表明牙髓干細 胞比骨髓干細胞具有更好的成骨分化能力，牙髓干細胞和支架材料能夠緊密結(jié)合，并且牙 髓干細胞在支架材料中生長良好，能夠更好地應(yīng)用于骨缺損的治療。
[0006] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了一種復(fù)合支架材料，其制備方法包括如下步驟：
[0008] 步驟A :將殼聚糖溶液和I型膠原溶液混合，保持pH值酸性，獲得殼聚糖/1型膠 原復(fù)合物；
[0009] 步驟B :將殼聚糖/1型膠原復(fù)合物與交聯(lián)劑混合，冷凍干燥，獲得多孔支架；
[0010] 步驟C :將多孔支架浸泡于無血清培養(yǎng)基中，去除無血清培養(yǎng)基，加入牙髓干細胞 懸液，靜置，加入完全培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)，獲得復(fù)合支架材料。
[0011] 本發(fā)明通過研宄發(fā)現(xiàn)：從乳牙中通過膠原酶消化提取的牙髓干細胞比骨髓干細胞 具有更強的成骨分化能力，將其接種到支架材料中，利用掃描電鏡觀察到其能夠很好的生 長，保持細胞原有的特性，能夠更好地應(yīng)用于骨缺損的治療。
[0012] 作為優(yōu)選，殼聚糖、I型膠原、交聯(lián)劑的質(zhì)量比為（1~5) : (2~8) : (1~3)。
[0013] 優(yōu)選地，殼聚糖、I型膠原、交聯(lián)劑的質(zhì)量比為3 :2 :1。
[0014] 作為優(yōu)選，牙髓干細胞懸液的細胞密度為（I. 0~2. 0) X 105/mL。
[0015] 作為優(yōu)選，牙髓干細胞為乳牙牙髓干細胞。乳牙作為一種自然脫落的人體器官，包 含了一種特殊的干細胞。它不僅有非常易得的組織來源，而且能為大量的臨床需求提供足 夠的細胞；由于是自生組織，不產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，具有較高的安全性。
[0016] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，牙髓干細胞的制備方法為：采用膠原酶對牙髓組 織進行消化，離散細胞團塊，接種，加入表皮生長因子EGF，在37°C、濕度為95%、C0 2條件下 進行細胞培養(yǎng)。
[0017] 作為優(yōu)選，在牙髓干細胞制備方法中，牙髓組織為牙髓組織根尖部Imm的組織。
[0018] 作為優(yōu)選，膠原酶為I型膠原酶。
[0019] 作為優(yōu)選，以cmVmL計，多孔支架與牙髓干細胞懸液的比例為（0. 05~0. 2) : (2~ 3) 〇
[0020] 為了保證干細胞充分附著于多孔支架，作為優(yōu)選，步驟C中靜置的時間為24~ 72h〇
[0021] 優(yōu)選地，步驟C中靜置的時間為48h。
[0022] 作為優(yōu)選，步驟C中細胞培養(yǎng)的時間為IOd~20d。
[0023] 作為優(yōu)選，細胞培養(yǎng)的時間為14d。
[0024] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，殼聚糖溶液為3%~5%的殼聚糖溶液。
[0025] 作為優(yōu)選，殼聚糖溶液為4%的殼聚糖溶液。
[0026] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，殼聚糖溶液為將殼聚糖溶于鹽酸溶液中形成的溶 液。也可將殼聚糖溶于醋酸溶液中形成殼聚糖溶液。
[0027] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，I型膠原溶液的質(zhì)量體積含量為5~15mg/mL。
[0028] 作為優(yōu)選，I型膠原溶液的質(zhì)量體積含量為10mg/mL。
[0029] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，I型膠原溶液為將I型膠原溶于水中形成的溶液。
[0030] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，步驟B中混合的時間為0. 5h~lh。
[0031] 作為優(yōu)選，步驟B中混合的時間為0. 5h。
[0032] 作為優(yōu)選，步驟C中浸泡的時間為24h~48h。
[0033] 優(yōu)選地，步驟C中浸泡的時間為24h。
[0034] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，牙髓干細胞為Pl~P3代牙髓干細胞。
[0035] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，將殼聚糖溶液和I型膠原溶液混合，保持pH值在 4~5之間，獲得殼聚糖/1型膠原復(fù)合物。
[0036] 本發(fā)明提供了一種復(fù)合支架材料。該復(fù)合支架材料的制備方法包括如下步驟：將 殼聚糖溶液和I型膠原溶液混合，保持PH值酸性，獲得殼聚糖/1型膠原復(fù)合物；將殼聚糖/ I型膠原復(fù)合物與交聯(lián)劑混合，冷凍干燥，獲得多孔支架；將多孔支架浸泡于無血清培養(yǎng)基 中，去除無血清培養(yǎng)基，加入牙髓干細胞懸液，靜置，加入完全培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)，獲得復(fù) 合支架材料。本發(fā)明至少具有如下優(yōu)勢之一：
[0037] 牙髓干細胞成骨分化能力強：通過體外成骨誘導(dǎo)試驗，表明牙髓干細胞比骨髓干 細胞具有更好的成骨分化能力，牙髓干細胞和支架材料能夠緊密結(jié)合，并且牙髓干細胞在 支架材料中生長良好，能夠更好地應(yīng)用于骨缺損的治療；
[0038] 牙髓干細胞來源豐富：6~11歲的小孩自然脫落的牙齒中、成人需要拔掉的智齒 中都含有豐富的牙髓干細胞；
[0039] 牙髓干細胞副作用?。貉浪韪杉毎且环N間充質(zhì)干細胞，具有間充質(zhì)干細胞的通 性，不僅免疫原性低，無須經(jīng)過嚴格配對即可使用，不會引起強烈的排異反應(yīng)，而且還具有 免疫調(diào)節(jié)功能；
[0040] 牙髓干細胞無倫理爭議：因牙髓干細胞取自小孩自然脫落的牙齒及成人的智齒， 屬于廢棄物品，且不損及生命，不存在倫理上的爭議。
【附圖說明】
[0041] 圖1示牙髓干細胞原代細胞培養(yǎng)圖片（100X);其中，I-A示培養(yǎng)Id時的細胞形 態(tài)；I-B示培養(yǎng)3d時的細胞形態(tài)，I-C示培養(yǎng)8d時的細胞形態(tài)；
[0042] 圖2示骨髓干細胞原代細胞培養(yǎng)圖片（100X);其中，2-A示培養(yǎng)Id時的細胞形 態(tài)；2-B示培養(yǎng)4d時的細胞形態(tài)，2-C示培養(yǎng)IOd時的細胞形態(tài)；
[0043] 圖3示牙髓干細胞和骨髓干細胞成骨誘導(dǎo)后細胞形態(tài)變化（100X);其中，3-A示 對照組干細胞培養(yǎng)d的細胞形態(tài)；3-B示牙髓干細胞誘導(dǎo)24d后的細胞形態(tài)；3-C示骨髓干 細胞誘導(dǎo)28d后的細胞形態(tài)；
[0044] 圖4示DMPl的表達情況；
[0045] 圖5示SOST的表達情況；
[0046] 圖6示掃描電鏡觀察支架材料；其中，6-A為支架材料；6-B為含有牙髓干細胞的 支架材料，其中箭頭所指為牙髓干細胞。
【具體實施方式】
[0047] 本發(fā)明公開了 一種復(fù)合支架材料，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進 工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而 易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描 述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本