一種組織工程皮膚及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及組織工程領(lǐng)域，特別涉及一種組織工程皮膚及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 皮膚是人體抵御外界損傷的第一道屏障，皮膚是人體最大、最復(fù)雜的器官，也是燒 傷創(chuàng)傷過程中最易受損的器官，大面積皮膚缺損會引起體液喪失，水電解質(zhì)紊亂及低蛋白 血癥、嚴(yán)重感染等，而皮膚移植是解決這一問題的關(guān)鍵，但由于自體與異體皮膚來源和應(yīng)用 在某些情況下受到限制，人們一直在尋找理想的皮膚替代物。皮膚組織工程為有希望解決 這一問題的途徑之一。皮膚組織工程是一門新興的邊緣學(xué)科，是目前最接近成功的組織學(xué) 產(chǎn)品。它是利用生物學(xué)和工程學(xué)原理研宄，構(gòu)建出用于修復(fù)、維持和改善損傷組織功能的組 織替代物。其核心是創(chuàng)造出一種三維生長支架，將由機(jī)體分離出的表皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞 進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng)，形成人工再生的真皮等同物或皮膚等同物，移植于需要修復(fù)、重建的皮 膚病損處。用組織工程化皮膚是解決大面積皮膚缺損的根本方法，目前已有較大的發(fā)展。
[0003] 種子細(xì)胞、支架材料以及細(xì)胞與支架材料相互作用的方式是構(gòu)建組織工程皮膚 的3個基本要素。從組織工程學(xué)的觀點(diǎn)來看，人工皮膚主要有三類：①表皮替代物，即培養(yǎng) 表皮片；②真皮替代物，即膠原凝膠、膠原海綿合成膜、透明質(zhì)酸膜及殼聚糖膜等構(gòu)成的人 工真皮；③具有雙層結(jié)構(gòu)的人工皮膚，包括：活性皮膚替代物、脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（Acellular dermal matrix，ADM)和人工網(wǎng)膜上培養(yǎng)的表皮片構(gòu)成的復(fù)合皮。
[0004] ADM是異體或異種皮膚經(jīng)過化學(xué)手段進(jìn)行脫細(xì)胞制備而成的真皮基質(zhì)，ADM具有 完整的基底膜結(jié)構(gòu)，可以促進(jìn)表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和分化，是理想的支 架材料。Alloderm是目前臨床上應(yīng)用較多的商品化ADM，具有良好的應(yīng)用前景。劉坡等檢測 了異體脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的組織相容性，結(jié)果顯示其機(jī)性與正常皮膚接近，組織相容性較好， 免疫排斥反應(yīng)較小。脫細(xì)胞異體真皮的缺點(diǎn)是來源有限、可能傳播病毒等。異種真皮的缺 點(diǎn)雖然來源方便，但存在免疫反應(yīng)，也限制了其臨床應(yīng)用。
[0005] 種子細(xì)胞的研宄一直是組織工程研宄的焦點(diǎn)之一，理想的種子細(xì)胞應(yīng)具有以下特 點(diǎn)：①具有高增殖能力和多種分化潛能；②獲取容易，對取材者損傷?。虎郢@取的種子細(xì)胞 能夠在體外大量擴(kuò)增等。組織工程中種子細(xì)胞的研宄是限制組織工程迅速發(fā)展的瓶頸，選 擇何種細(xì)胞作為皮膚種子細(xì)胞已成為當(dāng)前研宄的關(guān)鍵。目前用于構(gòu)建組織工程皮膚的種子 細(xì)胞有人表皮干細(xì)胞、真皮成纖維細(xì)胞等。
[0006] 表皮干細(xì)胞為皮膚的組織特異性干細(xì)胞，在胎兒期主要集中于初級表皮嵴，至成 人時呈片狀分布在表皮基底層。研宄表明，表皮干細(xì)胞占表皮基層細(xì)胞1 %~10%，在維持 皮膚生理性新陳代謝中起重要作用。隨著年齡增大，干細(xì)胞數(shù)量減少，這也是小兒皮膚創(chuàng)傷 愈合好于成年人的重要原因之一。表皮細(xì)胞培養(yǎng)在國外已應(yīng)用于臨床，但存在培養(yǎng)周期長， 創(chuàng)面愈合后瘢痕嚴(yán)重，不能達(dá)到功能康復(fù)，后來人們又研制出自體表皮加異體脫細(xì)胞真皮 或人工真皮聯(lián)合移植的方法，但因成活率較低、人工皮降解速度過快等原因目前仍不盡人 〇
[0007] 成纖維細(xì)胞作為真皮中重要的細(xì)胞組成部分，可分泌多種細(xì)胞因子，如肝細(xì)胞生 長因子、角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子、類胰島素生長因子、TGF-β 1、前列腺素等，對表皮細(xì)胞的 生長、移行和分化均有促進(jìn)作用。真皮成纖維細(xì)胞作為種子細(xì)胞可以促進(jìn)表皮干細(xì)胞的增 殖與分化，有利于創(chuàng)面的愈合，但修復(fù)皮膚創(chuàng)傷的效果有限。在組織工程領(lǐng)域，如何更好的 修復(fù)皮膚創(chuàng)傷成為了研宄的熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 有鑒于此，本發(fā)明提供了一種組織工程皮膚及其應(yīng)用。該組織工程皮膚將臍帶間 充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，極大提高了種子細(xì)胞的數(shù)量和增殖能力，并與ADM結(jié)合，充分發(fā) 揮兩者對皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)作用，組成一個具有修復(fù)皮膚創(chuàng)傷功能的組織工程皮膚。相比其 他來源的MSC或其他細(xì)胞，人臍帶MSC與ADM結(jié)合能夠更加有效地修復(fù)皮膚創(chuàng)傷。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0010] 本發(fā)明提供了一種組織工程皮膚，其構(gòu)建方法為：采用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞作為種 子細(xì)胞，以ADM作為支架，構(gòu)建獲得組織工程皮膚。
[0011] 在本發(fā)明中，將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，極大提高了種子細(xì)胞的數(shù)量和 增殖能力，并與ADM結(jié)合，充分發(fā)揮兩者對皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)作用，組成一個具有修復(fù)皮膚創(chuàng) 傷功能的組織工程皮膚。
[0012] 作為優(yōu)選，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞為人源臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0013] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，構(gòu)建方法具體為：
[0014] 采用明膠溶液包被ADM，浸泡于干細(xì)胞專用培養(yǎng)基，去除干細(xì)胞專用培養(yǎng)基，獲得 預(yù)處理后的ADM ;
[0015] 將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞種植于所述預(yù)處理后的ADM，加入干細(xì)胞專用培養(yǎng)基，用針插 ADM制孔，孵育培養(yǎng)，獲得組織工程皮膚。
[0016] 為了提高細(xì)胞的種植效率，將明膠溶液包被于ADM，有利于細(xì)胞的種植。作為優(yōu)選， 明膠溶液的濃度為〇· 1~100mg/mL。
[0017] 優(yōu)選地，明膠溶液的濃度為1~10mg/mL。
[0018] 更優(yōu)選地，明膠溶液的濃度為3~9mg/mL。
[0019] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，明膠溶液的濃度為7mg/mL。
[0020] 作為優(yōu)選，包被的時間為10~60min。
[0021] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，包被的時間為30min。
[0022] 作為優(yōu)選，浸泡的時間為1~3h。
[0023] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，浸泡的時間為2h。
[0024] 作為優(yōu)選，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的密度為0.1 X IO6~100 X 10 6/mL。
[0025] 優(yōu)選地，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的密度為IX IO6~10 X 10 6/mL。
[0026] 更優(yōu)選地，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的密度為5X 106/mL。
[0027] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞懸液的加入量為使ADM表面充 滿液體即可。
[0028] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，種植的次數(shù)為1~5次。
[0029] 作為優(yōu)選，種植的次數(shù)為3次。
[0030] 作為優(yōu)選，種植的時間間隔為1~2h。
[0031] 作為優(yōu)選，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞種植完畢與加入干細(xì)胞專用培養(yǎng)基的時間間隔為 1 ~2h〇
[0032] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，孵育培養(yǎng)的時間為3~5天，溫度為37°C。
[0033] 作為優(yōu)選，孵育培養(yǎng)的時間為3天。
[0034] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)代數(shù)為Pl~P5代。
[0035] 本發(fā)明還提供了一種修復(fù)皮膚創(chuàng)傷的方法，采用本發(fā)明提供的組織工程皮膚移植 于皮膚創(chuàng)傷部位；
[0036] 該組織工程皮膚的構(gòu)建方法為：采用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，以ADM作 為支架，構(gòu)建獲得組織工程皮膚；具體為：采用明膠溶液包被ADM，浸泡于干細(xì)胞專用培養(yǎng) 基，去除干細(xì)胞專用培養(yǎng)基，獲得預(yù)處理后的ADM ;將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞種植于所述預(yù)處理 后的ADM，加入干細(xì)胞專用培養(yǎng)基，用針插ADM制孔，孵