一種人工角膜的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于技術領域，具體涉及一種人工角膜的制備方法。
【背景技術】
[0002]角膜位于眼球最前端，是光線穿過的第一個屈光間質，其透明度是保證良好的視功能的第一要素。因此，人工角膜不同于其他組織工程產品，通過不同方法制備后，不僅需要保持其細胞外支架良好的力學性能，同時對于支架材料的透明度要求也很高。
[0003]目前已有多種人工角膜的制備方法，但是在實際應用中效果不佳。
[0004]人工角膜最早于I960年代開始在臨床實驗中出現，最初使用玻璃材質將其直接縫于眼表面。雖然這種治療方法可以提高患者的視力，但是由于短時間發(fā)生排斥反應，人工角膜周圍組織溶解，人工角膜脫落，使得手術失敗。隨著材料科學的不斷進步，人工角膜不斷發(fā)展，目前在臨床上使用的人工角膜主要是BostenKPro、AlphaCor和Osteo?Odonto獲得FDA批注進入臨床階段。
[0005]Bosten I型角膜最早應用于臨床的人工角膜，有PMC制備，具有較好的組織相容性和透明度。Bosten II型在I型的基礎上進行改進，優(yōu)化了人工角膜的設計，使得移植手術更簡單，縫合口滲漏幾率下降；增加了鈦合金固定裝置，減少了因排斥反應而導致的人工角膜脫出。
[0006]Osteo ?Odonto ?keratoprosthesis (OOKP)由意大利科學家 Strampelli 首創(chuàng)，利用自體組織(牙齒)作為周邊支架，PMMA作為光學柱鏡，這種骨齒型特殊結構對于增加角膜耐受性，更好的于宿主結合，起到積極作用。有報道稱稱，OOKP在患者體內最長已將近20年。雖然創(chuàng)造性引入自體組織作為角膜的一部分，減少了排斥率，植入后視力恢復也較好，但并發(fā)癥仍不能避免，且手術難度大，費用高，限制其廣泛應用。
[0007]AlphaCor型人工角膜，20世紀90年代澳大利亞L1n眼科研宄所的Chirila等將PHEMA水凝膠制作了一體式人工角膜AlphaCor，并在1998年進行首次人體試驗。AlphaCor具有海綿狀結構的支架和光學柱鏡，由兩部分含水量不同的PHEMA水凝膠組成，互穿網絡結構連接，能夠承受較高的壓力和拉力。由于柱鏡和周邊支架都采用同一種材料，物理和化學性質相似，解決了兩部分結合問題，同時也減少的結合部位發(fā)生感染的風險。Bleckman等將該種人工角膜植入4例患者，6個月后I例患者球結膜裂開，其余患者未出現任何并發(fā)癥。這種角膜的主要并發(fā)癥有角膜表層基質融化、鏡柱出現沉積物以及角膜后膜等，雖然角膜的排斥率在逐漸降低，但是移植術后I年排斥率仍在20%左右。

【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明的目的在于克服現有技術缺陷，提供一種人工角膜的制備方法。
[0009]本發(fā)明的具體技術方案如下:
[0010]一種人工角膜的制備方法，包括如下步驟:
[0011](I)選料:收集適齡豬眼球；
[0012](2)預處理:刮除上述豬眼球的角膜上皮細胞和角膜內皮細胞，保留完整的角膜前彈力層，鉆取指定大小角膜片；
[0013](3)凍融:在常溫常壓下，將步驟(2)獲得的角膜片置于液氮8?35分鐘，取出后在常溫常壓下將角膜片緩慢復溫至室溫，重復4?12次；
[0014](4)超聲:將步驟(3)凍融處理后的角膜片置于生理鹽水中進行常溫常壓下的超聲波清洗，超聲工作頻率20?250kHz，超聲時間15?65分鐘；
[0015](5)酶降解:在常溫常壓下，將超聲處理后的角磨片置于緩沖液中用核酸內切酶酶解角膜基質細胞DNA，即得所述人工角膜，該緩沖液的以培養(yǎng)液為溶劑，還包括0.1?0.5%的非必需氨基酸、2?3%的酸堿調節(jié)劑和10?60mol/L的無機陽離子和10?60mol/L的無機陰離子，pH值為7.0?7.5，滲透壓為330?390m0sm/L，核酸內切酶的濃度為5?55 μ g/mL，酶解時間20?230分鐘。
[0016]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述步驟(I)為:收集4?12月齡豬眼球。
[0017]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述步驟(3)為:在常溫常壓下，將步驟(2)獲得的角膜片置于液氮10?30分鐘，取出后在常溫常壓下將角膜片緩慢復溫至室溫，重復5?10次。
[0018]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述步驟(4)為:將步驟(3)凍融處理后的角膜片置于生理鹽水中進行常溫常壓下的超聲波清洗，超聲工作頻率20?200kHz，超聲時間20?60分鐘ο
[0019]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述步驟(5)為:該緩沖液的以培養(yǎng)液為溶劑，還包括0.1?0.5%的非必需氨基酸、2?3%的酸堿調節(jié)劑、10?50mol/L的無機陽離子和10?50mol/L的無機陰離子，pH值為7.2?7.4，滲透壓為350?380m0sm/L，核酸內切酶的濃度為5?50 μ g/mL,酶解時間20?200分鐘。
[0020]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述核酸內切酶為限制性核酸酶I，限制性核酸酶II或混合型核酸內切酶。
[0021]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述培養(yǎng)液為SFM，MEM, DMEM，BME或HAMF12。
[0022]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述酸堿調節(jié)劑為碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖對、磷酸氫鈉一磷酸二氫鈉緩沖對、HEPES或硼酸一硼砂緩沖對。
[0023]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述無機陽離子為鈉離子、鋰離子、鋁離子、鈣離子和鎂離子中的至少一種，所述無機陰離子為氯離子、氫氧根離子、碳酸根離子、磷酸根離子、磷酸氫根離子和硫酸根離子的至少一種。
[0024]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述非必需氨基酸為甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸、精氨酸和組氨酸中的至少一種。
[0025]本發(fā)明的有益效果是:
[0026]1、本發(fā)明的制備方法去除豬角膜的中活細胞的同時最大程度地保持了天然角膜膠原纖維的排列，保證了角膜的透明。
[0027]2、本發(fā)明的制備方法制備的人工角膜的天然膠原纖維之間的空隙有利于誘導受體角膜細胞的生長和神經纖維的生長，促進供體角膜修復和重建。
【附圖說明】
[0028]圖1為本發(fā)明實施例1制備的角膜片與未經處理的角膜片的對比結果圖；
[0029]圖2為本發(fā)明實施例1制備的人工角膜的HE染色圖；
[0030]圖3為本發(fā)明實施例1制備的人工角膜向新西蘭大白兔進行板層角膜移植術后3月的結果圖；
[0031]圖4為本發(fā)明實施例1中經核酸內切酶處理后的人工角膜的DNA電泳結果圖。
【具體實施方式】
[0032]以下通過【具體實施方式】結合附圖對本發(fā)明的技術方案進行進一步的說明和描述。
[0033]實施例1
[0034](I)選料:收集4?12月齡豬眼球；
[0035](2)預處理:刮除上述豬眼球的角膜上皮