一種附骨癰模型兔的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種屬于實驗動物領(lǐng)域，尤其涉及一種附骨癰模型兔的制備，以及采 用該模型進行附骨癰骨不連治療作用評價的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨損傷合并感染疾病在骨外科高發(fā)，以細菌感染所致的附骨疽常見。附骨疽/癰 (BoneAbscess,BA),現(xiàn)代醫(yī)學稱之為慢性骨髓炎（ChronicOsteomyelitis,CO),其臨床 特點為病程長、反復(fù)發(fā)作、長期不愈，骨不連發(fā)生率達10-15%，因而致殘率高。目前臨床采用 手術(shù)清創(chuàng)聯(lián)合抗生素局部緩釋系統(tǒng)給藥達到局部抗感染作用，已取得一定進展，降低了復(fù) 發(fā)率。但骨愈合時間較長，骨修復(fù)重建困難，導(dǎo)致骨延遲愈合（即骨不連）發(fā)生率高，部分患 者需二次手術(shù)，嚴重者甚至導(dǎo)致運動功能喪失或障礙。
[0003] 中醫(yī)將慢性骨髓炎歸為"附骨疽"、"附骨疽"、"骨癰"范疇，而骨不連屬"骨痹"、"骨 萎"范疇，中醫(yī)對附骨癰的認識記載有《外科正宗》云："夫附骨疽者，乃陰寒入骨之病也。但 人之氣血生平壯實，雖遇寒冷則邪不入骨。凡入者，皆由體虛之人，寒氣乘虛入里，遂成斯疾 也。"即是對本病病因病機的論述，"虛"是其本，而寒濕邪、病毒侵襲營血，導(dǎo)致氣滯血瘀，髓 海瘀滯而髓死骨枯為外因。簡單說邪毒雍遏附骨，經(jīng)絡(luò)阻塞，氣血凝滯是發(fā)病初期的主要病 機，邪毒化熱腐肌傷骨，是病情的進一步發(fā)展，正虛邪實是附骨癰的病機關(guān)鍵。因此內(nèi)外兼 治，正確處理驅(qū)邪和扶正的關(guān)系是中醫(yī)治療該病的原則。
[0004] 近些年，國內(nèi)外在建立慢性骨髓炎的動物模型上已有很多報道。大多以大鼠和兔 作為實驗?zāi)Ｐ蛯ο?，采用脛骨鉆孔接種金葡菌造成局部感染，或采用截骨形成開放性骨折 制備模型。由于大鼠骨骼較細不易操作，鉆孔易造成骨折，動物行動不便。由于兔的抗感染 能力較強，脛骨較大，便于鉆孔和金黃色葡萄球菌的接種，且接種量易于控制。但是根據(jù)文 獻報道，采用兔作為骨髓炎造模動物，在金黃色葡萄球菌濃度方面，往往采用每只動物注射 一定劑量的菌混懸液，加上動物體重的差異，造模過程造成動物感染程度不一，死亡率高， 造模成功率低；而采用開放截骨，與臨床實際情況存在差異，且創(chuàng)傷較大，制備模型后動物 難以恢復(fù)。另一方面，基于附骨癰發(fā)生發(fā)展的中醫(yī)理論基礎(chǔ)，正虛邪實是其病機關(guān)鍵，而寒 濕邪入侵發(fā)病初始的誘因，該方面的動物模型未見文獻及專利報道。
[0005] 因此，本發(fā)明建立的局部物理刺激結(jié)合金黃色葡萄球菌感染的附骨癰兔模型，造 模前增加了物理刺激(冰敷）處理過程，模擬寒濕邪入侵；其次對接種細菌的濃度及接種量 進行了優(yōu)化。手術(shù)創(chuàng)傷小，造模成功率高，致死率低，造模動物活動及進食情況較好，能成功 制備附骨癰兔模型，且遵循附骨癰發(fā)生發(fā)展的中醫(yī)理論，符合附骨癰的發(fā)病機制。該模型的 成功制備能夠為附骨癰的病理機制研究，以及具有促進骨愈合的藥物對附骨癰骨不連的治 療作用研究提供動物實驗?zāi)Ｐ秃驮u價指標。經(jīng)文獻檢索，目前采用物理刺激結(jié)合細菌感染 制備附骨癰兔模型的方法以及其在附骨癰骨不連治療作用評價等方面的應(yīng)用，未見文獻報 道及專利公開。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是建立一種附骨癰模型兔的制備方法，并采用該方法應(yīng)用于附骨癰 骨不連的治療中，為具有促進附骨癰骨修復(fù)治療作用的藥物評價提供實驗動物模型，并建 立了系統(tǒng)的疾病病理評價指標體系。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明建立了一種采用局部物理冰敷刺激，并結(jié)合金黃色葡 萄球菌感染的方法制備附骨癰兔模型，并采用該模型進行附骨癰骨不連治療的研究，該方 法包括以下的步驟： 1) 動物選擇及飼養(yǎng)條件 新西蘭兔，雄性，體重2. 0-2. 5kg，動物飼養(yǎng)及整體實驗均屏障級實驗動物中心完成； 2) 菌種復(fù)蘇及培養(yǎng) 取金黃色葡萄球菌標準菌株的冷凍干燥菌種，加入營養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基，振蕩，使之溶 解呈懸浮狀，吸取全部菌懸液，移植于營養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基試管中，在37°C有氧條件下，培 養(yǎng)24h，與I. 0麥氏單位濃度的標準比濁管進行比濁，達到統(tǒng)一濃度后，配制成IXIO8Cfu/ mL濃度的菌液，在12h內(nèi)使用； 3) 脛骨局部物理刺激 兔子左下肢采用預(yù)冷的冰帶捆縛，每天刺激3次，每次20min，2次刺激間隔30min，連續(xù) 處理七天； 4) 麻醉 麻醉前測量動物體重，3%戊巴比妥鈉，以50mg/Kg劑量腹腔注射麻醉，給藥同時觀察肌 肉緊張度、角膜反射和對皮膚捏夾的反應(yīng)，當上述反應(yīng)明顯減弱或消失時即完全麻醉； 5) 附骨癰模型制備 兔子固定于手術(shù)臺上，左下肢脛骨至膝關(guān)節(jié)周圍剃毛，聚維酮碘消毒。于脛骨前內(nèi)側(cè)緣 切開皮膚，逐層分離皮下、筋膜、肌肉，剝離骨膜，顯露脛骨上端前內(nèi)側(cè)，用骨鉆鉆孔至髓腔， 抽取骨髓后，向髓腔內(nèi)注射5%魚肝油酸鈉，5min后按體重注射一定濃度的金黃色葡萄球 菌，孔洞用無菌骨蠟封閉，縫合皮膚，3周后對模型進行指標檢測及評價； 6) 術(shù)后觀察及處理 所有動物麻醉清醒后單籠飼養(yǎng)，籠內(nèi)自由活動，統(tǒng)一標準飼養(yǎng)，不使用任何抗菌藥物， 動物均出現(xiàn)患肢跛行，進食量減少等現(xiàn)象； 7) 附骨癰模型評價 大體情況：觀察動物基本情況，包括患肢局部情況，局部皮膚顏色呈暗紅色、步態(tài)蹣跚、 體溫上升、局部腫脹并形成竇道； 血液生化指標檢查：耳緣靜脈取血，進行血常規(guī)、及血清ALP檢查； 微生物學檢查：取髓腔內(nèi)組織，置于無菌牛肉湯24小時后作細菌培養(yǎng)，均證實為金黃 色葡萄球感染菌； 三維重建CT檢查：按照120KV，35mA，0. 14L，DLP4,TI為2. 7s條件進行掃描，經(jīng)三維重 建形成三維圖，精確評估骨缺損面積； 病理學檢查：隨機選取造模成功的動物，處死取材，置10%福爾馬林液中固定48小時， 再沖洗后置復(fù)合脫鈣液脫鈣24小時，脫水、石蠟包埋切片（縱切厚度5ym)，HE染色，光鏡下 觀察新骨形成情況及骨缺損處血管化情況。根據(jù)Lane-Sandhu組織學評分法，對病理組織 HE染色光鏡下所見進行組織學評分； 8)附骨癰模型兔在附骨癰骨不連治療作用評價中的應(yīng)用 取步驟5)造模的動物，經(jīng)過步驟6)與步驟7)的模型評價，得到造模成功的附骨癰兔 模型。造模成功的動物進行分組，分為模型組，抗炎治療組，抗炎+骨修復(fù)治療組，同時設(shè)定 空白對照組和假手術(shù)組?？寡字委熃M于脛骨前內(nèi)側(cè)緣切開皮膚，逐層分離皮下、筋膜、肌肉， 剝離骨膜，顯露脛骨上端前內(nèi)側(cè)，用4_骨鉆鉆孔至髓腔，植入載萬古霉素-硫酸鈣顆粒，縫 合皮膚?？寡?骨修復(fù)治療組植入載萬古霉素-硫酸鈣顆粒后，縫合皮膚，每天口服給予骨 修復(fù)作用藥物。每隔4周隨機挑選動物，通過微生物血檢查，三維重建CT檢查，病理學檢查 等進行骨修復(fù)作用評價。
[0008] 作為優(yōu)選，上述的步驟2)中菌種復(fù)蘇及培養(yǎng)如下：取金黃色葡萄球菌標準菌株 (ATCC25923 的冷凍干燥菌種，加入 0.3mL營養(yǎng) 肉汁瓊脂培養(yǎng)基，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀，吸取全部菌懸液，移植于營養(yǎng)肉汁 瓊脂培養(yǎng)基試管中，在37°C有氧條件下，培養(yǎng)24h。取試管置比濁儀中，與I. 0麥氏單位濃 度的標準比濁管進行比濁，達到統(tǒng)一濃度后，用移液槍提取0.lmL，加至Iml的生理鹽水， 配制成IX108cfu/mL濃度的菌液，配制后12h內(nèi)使用。
[0009] 作為優(yōu)選，上述的步驟3)的脛骨局部物理刺激步驟如下：兔子適應(yīng)性喂養(yǎng)一周 后，左下肢用預(yù)冷的，可塑形的冰帶（5cmX15cm)敷于脛骨表面，并用彈性繃帶捆縛，每天刺 激3次，每次20min，2次刺激間隔30min，連續(xù)處理七天。
[0010] 作為優(yōu)選，上述的步驟5)的附骨癰模型制備步驟包括：將兔子固定于手術(shù)臺上， 左下肢脛骨至膝關(guān)節(jié)周圍剃毛，聚維酮碘消毒。于脛骨前內(nèi)側(cè)緣切開皮膚，逐層分離皮下、 筋膜、肌肉，剝離骨膜，顯露脛骨上端前內(nèi)側(cè)，用2mm的骨鉆鉆孔至髓腔，抽取骨髓后，向髓 腔內(nèi)注射0.ImL的5%魚肝油酸鈉，5min后注射4ML/kg體重的IX108Cfu/mL金黃色葡萄球 菌，孔洞用無菌骨蠟封閉，縫合皮膚。
[0011] 作為優(yōu)選，上述的步驟7)附骨癰模型評價中大體情況：觀察動物基本情況，包括 患肢局部情況，局部皮膚顏色呈暗紅色、步態(tài)蹣跚、體溫上升、局部腫脹并形成竇道；血液指 標：堿性磷酸酶（ALP)、白細胞計數(shù)（WBC)、超敏C反應(yīng)蛋白（CRP)模型組與空白對照組相比 顯著升高，假手術(shù)組與空白對照組相比指標顯著提升，且低于模型組；三維重建CT檢查：按 照120KV，35mA，0. 14L，DLP4,TI為2. 7s條件進行掃描，經(jīng)三維重建形成脛骨三維圖，并在 二維層面，精確評估骨缺損面積；病理學檢查：隨機選取造模成功的動物，處死取材，置10% 福爾馬林液中固定48小時，再沖洗后置脫鈣液脫鈣24小時，脫水、石蠟包埋切片（縱切厚度 5ymXHE染色，光鏡下觀察病灶局部，自骨髓外周結(jié)締組織及骨組織至骨髓內(nèi)，均見大量中 性嗜酸性粒細胞呈彌散性浸潤，成骨細胞與破骨細胞均大量分布，破骨細胞周圍有大量深 紫色的炎癥細胞，骨小梁明顯減少，未見新骨形成。
[0012] 本發(fā)明由于采用了上述的技術(shù)方案及步驟，具有以下的特點： 1、理論創(chuàng)新性 本發(fā)明采用局部冰敷物理刺激造成寒濕邪入侵的模型，符合附骨癰的發(fā)病機制。該方 法方便可行，能夠為附骨癰的病理過程以及發(fā)病機制等提供實驗動物模型，開展以中醫(yī)理 論為指導(dǎo)的病理機制及藥物干預(yù)評價研究。
[0013] 2、方法優(yōu)越性 本發(fā)明發(fā)明了一種物理刺激結(jié)合細菌感染制備附骨癰兔模型，目前國內(nèi)的文獻和專利 中未見報道，該方