妝品和洗臉，間隔15天后連續(xù)使用6次，作為一個療程。
[0070]圖3中是將本發(fā)明的含自體脂肪干細胞生物美容面膜在57歲男性臉部抬頭紋美容圖片。使用縮聚型硅橡膠(德國德萬可公司)印模方法檢測皺紋修復情況，即將初次印模材料兩勺，加入2.5cm催化劑膏體，混合均勻，混合時間大約30秒，用壓舌板或其他工具將混合的材料抹光滑。二次印模材料與催化劑膏體1: 2混合均勻，涂于受試者額頭，硅橡膠硬化后印跡了皮膚紋絡。A圖為美容前抬頭紋印模圖片，B圖為I個療程后抬頭紋得到明顯減少，變淺，皮膚變得細膩有光澤；表明本發(fā)明的本發(fā)明制備生物美容面膜具有良好的祛皺、皮膚修復和抗氧化等作用。
【主權(quán)項】
1.一種含自體脂肪干細胞的自體生物美容面膜的制備方法，其中，所述方法包括通過從自體脂肪中培養(yǎng)獲取自體脂肪干細胞，并從自體外周血中得到富含血小板的血漿；取瓊脂糖加入生理鹽水后加熱溶解，待溫度降至40°c加入富含血小板的血漿，混勻后加入自體脂肪干細胞從而制備成生物美容面膜； 其中，所述自體脂肪干細胞經(jīng)流式細胞儀檢測，高表達⑶29+ ^ 90%、⑶44+ > 90%和CD105+ 彡 90%，低表達 CD34+ ( 10%、CD45+ 彡 10%和 CD14+ 彡 10%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述面膜中還添加營養(yǎng)因子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項所述的方法，其特征在于，所述自體脂肪干細胞由腹部抽脂獲得脂肪組織液，用IXPBS沖洗5次，去除吸脂手術(shù)中所用藥物、油及血細胞；用質(zhì)量體積比0.1 % I型膠原酶37°C消化60分鐘，間隔10分鐘用Iml移液槍反復吹打；消化后1000轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘，吸棄上層脂肪后，加入IXPBS混勻，用200目細胞篩過濾；所獲得的細胞懸液1000轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘，細胞沉淀用IXPBS洗滌I次，加入含體積分數(shù)10%胎牛血清的a-MEM培養(yǎng)液重懸，苔盤蘭染色計數(shù)后按1-10 X 16細胞/ml加入到25cm 2的細胞培養(yǎng)瓶中，于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中生長48小時； 培養(yǎng)48小時后對脂肪干細胞換液，用5ml移液管吸棄培養(yǎng)液，加入含體積分數(shù)10%胎牛血清的a -MEM培養(yǎng)液，25cm2培養(yǎng)瓶繼續(xù)放置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，間隔2天用新鮮培養(yǎng)液進行換液I次； 脂肪干細胞在25cm2培養(yǎng)瓶中生長融合達到80%以上，用5ml移液管吸棄培養(yǎng)液，取5ml I X PBS洗滌一次培養(yǎng)瓶底，加入0.5ml、質(zhì)量體積比為0.25 %胰酶到培養(yǎng)瓶中，放置370C ,5% CO2培養(yǎng)箱中消化2-3分鐘；消化后加入200 μ I胎牛血清終止消化，再加入5ml的生理鹽水，用5ml移液管吹打，吸至15ml離心管中，再用5ml的生理鹽水洗滌一次，加入到同一個15ml離心管中，1000轉(zhuǎn)每分鐘離心5分鐘收集脂肪干細胞；離心后用Iml新鮮培養(yǎng)液重懸，計數(shù)，用5ml移液管加入1ml新鮮的含體積分數(shù)10%胎牛血清的a -MEM培養(yǎng)液，加入到I瓶75cm2培養(yǎng)瓶中繼續(xù)在37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中生長，每隔2天換一次新鮮培養(yǎng)液；待脂肪干細胞生長融合達到80%以上時，按上述經(jīng)胰酶消化收集脂肪干細胞，連續(xù)傳代3代培養(yǎng)，獲得4X 17以上的脂肪干細胞，用4ml生理鹽水重懸，苔盤蘭染色計數(shù)，即獲得脂肪干細胞，放置冰箱4°C存放備用； 部分脂肪干細胞用40%脂肪干細胞培養(yǎng)液、10%二甲基亞砜和50%胎牛血清組成的凍存液，儲存在_196°C液氮罐中，以備今后復蘇后使用； 取苔盼蘭染色計數(shù)后的3 X 16脂肪干細胞，分三組，第一組分別添加到有20 μ E FITC標記鼠抗人⑶29單抗、20 μ L PE標記鼠抗人⑶44單抗和20 μ L Percp標記鼠抗人⑶34單抗；第二組分別添加到有20 μ L FITC標記鼠抗人⑶45單抗、20 μ L PE標記鼠抗人⑶105單抗和20 μ L Percp標記鼠抗人⑶14單抗；第三組為同型對照，分別添加到有20 μ L FITC標記鼠IgGl、20y L PE標記鼠IgGl和20 μ L PerCP標記鼠IgGl ;置于4°C冰箱染色30分鐘，然后用ImL的IX磷酸鹽緩沖液洗滌三次，最后用0.5mL的IXPBS重懸洗滌后的細胞，所得洗滌后的細胞用FACSCalibur臨床型流式細胞儀檢測；自體脂肪干細胞高表達CD29+ ^ 90%, CD44+ 彡 90 % 和 CD105+ ^ 90%,低表達 CD34+ ^ 10%, CD45+ ( 10 % 和CD14+ ( 10%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述胰酶含質(zhì)量體積比為0.01%的EDTA ；所述PBS的pH值為7.4。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的方法，其特征在于，自體血漿由抽取人50-100mlEDTA抗凝外周血，經(jīng)1000轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘得到的10-80ml血漿，再次3000轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘獲得10-80ml富含血小板血漿，放置4°C冰箱存放備用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于，含自體脂肪干細胞的生物美容面膜的制備方法如下: 取0.1-1克瓊脂糖粉到50ml無菌離心管中，加入0.9%生理鹽水5_50ml，微波爐中加熱充分溶解，待溫度降到40°C，取Iml瓊脂糖溶液加入到制備好的4ml自體富含血小板的血漿，混勻后加入制備好的Iml 1-40 X 16脂肪干細胞液，制備成半凝膠狀的生物美容面膜，放置冰箱4°C中備用。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6任一項所述的方法，其特征在于，含自體脂肪干細胞的生物美容面膜中還添加以下營養(yǎng)因子的一種或多種:表皮生長因子、堿性成纖維生長因子、角蛋白18和海藻酸鈉。
8.—種含自體脂肪干細胞的生物美容面膜，其特征在于，其由如下成分組成: 1)Iml 1-40 X 16權(quán)利要求1_7任一項所述的自體脂肪干細胞； 2)4-10ml自體富含血小板的血漿； 3)1ml、質(zhì)量體積比為2%的瓊脂糖； 4)任選的l-500ng/ml營養(yǎng)因子； 半凝膠狀生物美容面膜裝入1ml無菌的塑料針管中，用蓋子密封包裝，形成產(chǎn)品；該生物面膜產(chǎn)品保存在4°C條件下，保質(zhì)期為48小時。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的生物美容面膜，其特征在于，其優(yōu)選添加了以下營養(yǎng)因子中一種或一種以上:表皮生長因子、堿性成纖維生長因子、角蛋白18和海藻酸胺。
10.一種權(quán)利要求1-9中任一項所述的生物面膜的應用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種含自體脂肪干細胞的生物美容面膜的制備方法，其中，所述方法包括通過從自體脂肪中培養(yǎng)獲取脂肪干細胞，并從自體外周血中得到富含血小板的血漿；取瓊脂糖加入生理鹽水后加熱溶解，待溫度降至40度左右加入富含血小板的血漿，混勻后加入自體脂肪干細胞從而制備成生物美容面膜，同時還可以添加營養(yǎng)因子制備成個性化的生物美容面膜產(chǎn)品，可用于皮膚祛皺、粉刺瘢痕與疤痕修復、除斑和抗氧化等作用。
【IPC分類】A61Q19-08, A61K8-73, A61Q19-00, A61K8-98, A61P17-00, A61P17-02, A61P17-10, A61K8-02
【公開號】CN104622771
【申請?zhí)枴緾N201510014820
【發(fā)明人】陳鎮(zhèn)洲, 寇蕊, 劉兵
【申請人】廣州賽奕德生物技術(shù)有限公司
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年1月13日