納米細菌感染動物前列腺引起慢性炎癥的動物模型復(fù)制方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種納米細菌感染動物前列腺引起慢性炎癥的動物模型復(fù)制方法。
【背景技術(shù)】
[0002]根據(jù)國際前列腺炎合作網(wǎng)1998年提出的前列腺炎分類方法，前列腺炎共分為四型。I型:急性細菌性前列腺炎，指前列腺急性細菌感染；II型:慢性細菌性前列腺炎，指前列腺慢性復(fù)發(fā)性細菌感染；111型:慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合癥(CP/CPPS)，其定義為病史在3個月以上，骨盆區(qū)疼痛或不適，不同程度的排尿或性交時不適，此型根據(jù)前列腺按摩液、精液中白細胞計數(shù)又分為炎癥性和非炎癥性兩種亞型；IV型無臨床炎癥性前列腺炎，沒有癥狀，只是在病理檢查或檢查其他癥狀時發(fā)現(xiàn)前列腺按摩液中存在白細胞才偶然被診斷。其中I型、II型患者數(shù)量少，IV型前列腺炎因無任何癥狀，勿須處理，亦無重要臨床意義。只有III型前列腺炎患者因常規(guī)檢查及培養(yǎng)未能發(fā)現(xiàn)明確的病原體，病因不明，發(fā)病機制不清，不能進行針對性治療，臨床療效差，而且患者數(shù)量占臨床慢性前列腺炎患者的60%以上。
[0003]研宄發(fā)現(xiàn)納米細菌能分泌鈣化脂多糖生物膜，具有較強的毒性。人體內(nèi)感染的納米細菌，主要經(jīng)泌尿系統(tǒng)排出體外。排尿時尿道高壓可引起尿液返流進入前列腺導(dǎo)管和腺胞內(nèi)，在此過程中，尿液中的納米細菌容易被伴隨轉(zhuǎn)移，進入到前列腺內(nèi)，這可能在納米細菌感染前列腺過程中發(fā)揮主要和積極的作用。此外，前列腺導(dǎo)管細長、彎曲、開口處口徑小，與尿道成直角或斜行向上進入尿道，也有利于尿道病原體進入腺體，不利于腺體炎性滲出物排除和引流，病原體可長期寄生在其中。以上諸多因素為納米細菌在前列腺內(nèi)感染和致病提供了條件和可能。
[0004]關(guān)于納米細菌與III型前列腺炎和前列腺結(jié)石可能存在的病因?qū)W關(guān)系，目前國內(nèi)外只有少數(shù)學(xué)者在臨床方面進行了探索。Jones等最初研宄結(jié)果顯示，前列腺炎患者血清中納米細菌抗原經(jīng)過ELISA分析檢出率顯著高于正常男性及前列腺增生患者。Shoke等通過對頑固性III型前列腺炎伴結(jié)石患者用四環(huán)素抗納米細菌治療后，發(fā)現(xiàn)患者臨床癥狀顯著改善，結(jié)石變小或消失；還有人分別從III型前列腺炎患者的EPS及前列腺結(jié)石中分離、培養(yǎng)出納米細菌細菌，并發(fā)現(xiàn)其中納米細菌具有較高感染率，分別達62.5%、65%。在針對性治療后，EPS中納米細菌陽性率明顯下降。因此推斷納米細菌與III型前列腺炎和前列腺結(jié)石之間存在著較密切關(guān)系，考慮為其重要病因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明實施例的目的在于提供一種納米細菌感染動物前列腺引起慢性炎癥的動物模型復(fù)制方法，旨在探索III型前列腺炎及結(jié)石的病因和發(fā)病機制，解除患者痛苦，減少病患和社會醫(yī)療機構(gòu)的資金支出，節(jié)約更多的醫(yī)療資源。
[0006]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種納米細菌感染動物前列腺引起慢性炎癥的動物模型復(fù)制方法包括:
[0007]步驟一、將經(jīng)鑒定的納米細菌的菌種進行培養(yǎng)并收集培養(yǎng)出的細菌，將所收集的細菌用PH為7.2的PBS液沖洗，用生理鹽水稀釋后，經(jīng)ATB濁度儀比色后配制成
3.0X 108cfu/ml的納米細菌菌液混懸液備實驗用。
[0008]步驟二、大鼠分組處理:
[0009]將40只大鼠平均隨機分為5組，被分養(yǎng)在5個籠中，能自由獲取食物和水，在使用之前，適應(yīng)新環(huán)境至少一周，其中對照組和模型組各16只，治療組8只，治療組在4周后，予四環(huán)素胃飼，按10mg/(kg 〃 d)劑量灌胃治療4周；
[0010]步驟三、大鼠前列腺感染模型制作:
[0011]1%戊巴比妥鈉溶液約1.2ml注射入大鼠腹腔全麻后，碘伏消毒大鼠尿道外口和會陰部，隨后插入直徑0.9mm，長2.5cm的無菌潤滑聚乙烯尿管，一個胰島素注射器抽吸0.2ml配制好的I標準麥氏單位的納米細菌懸浮液注入雄性SD大鼠前列腺部尿道，對照組SD大鼠給予生理鹽水同樣方法注入；
[0012]步驟四、標本的收集:
[0013]大鼠尿道被注射細菌為O周，在相同條件下飼養(yǎng)，在4周將對照組和模型組大鼠各處死8只，其余3組動物在第8周后處死，分別稱量大鼠的體重，無菌條件下，切取腹側(cè)和被側(cè)葉前列腺組織，將前列腺包膜完全清除，留下純的前列腺組織，并分別對應(yīng)其稱取重量；
[0014]步驟五、前列腺組織中細胞因子檢測和納米細菌再培養(yǎng)標本的收集。
[0015]進一步，所述的納米細菌的菌種的培養(yǎng)與收集的具體方法為:
[0016]將經(jīng)鑒定的納米細菌的菌種接種于3ml RPMI 1640培養(yǎng)基或含10%熱滅活γ —FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中懸浮，置于37°C、5% C02和95%空氣條件下培養(yǎng)4?5周，整個操作中嚴格遵循無菌技術(shù)；每周觀察標本的生長情況；分別用不加標本的RPMI 1640、含10%熱滅活γ — FBS的不加標本的RPMI 1640、生理鹽水加入RPMI 1640作陰性對照，然后在無菌條件下4°C、2000轉(zhuǎn)速離心30分鐘，收集培養(yǎng)出的細菌，置于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0017]進一步，前列腺組織中細胞因子檢測和納米細菌再培養(yǎng)標本的收集的具體方法為:
[0018](I)在無菌條件下，將每組動物腹側(cè)半葉組織稱重，按重量加入冰鹽水后，分別制成10%組織勻漿，在4°C低溫條件、3000轉(zhuǎn)/分下超速離心15分鐘后，提取上清液1ml，置低溫下(-20 0C )保存?zhèn)錅y;
[0019](2)將離心管內(nèi)的多余的液體移出，剩余管底的組織和液體約Iml用生理鹽水稀釋5倍，經(jīng)0.45 μπι濾器過濾，4°C離心40min(20, OOOXg)，棄上清，留取管底Iml充分混勾，再用無菌生理鹽水稀釋5倍，經(jīng)0.22 μπι濾器過濾，4°C離心40min(20, OOOXg)，棄上清，留取管底Iml充分混勻。加入3ml RPMI 1640培養(yǎng)基或含10%熱滅活γ — FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中懸浮，然后按納米細菌培養(yǎng)的方法進行培養(yǎng)。
[0020]本發(fā)明為研宄納米細菌對前列腺的致病作用的動物實驗提供的實驗材料，對于探索III型前列腺炎及結(jié)石的病因和發(fā)病機制，解除患者痛苦，減少病患和社會醫(yī)療機構(gòu)的資金支出，節(jié)約更多的醫(yī)療資源有重要意義。
【附圖說明】
[0021]圖1是本發(fā)明實施例提供的納米細菌感染動物前列腺引起慢性炎癥的動物模型復(fù)制方法的流程圖。
【具體實施方式】
[0022]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0023]下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進一步描述。
[0024]如圖1所示，本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種納米細菌感染動物前列腺引起慢性炎癥的動物模型復(fù)制方法包括:
[0025]S101、將經(jīng)鑒定的納米細菌的菌種進行培養(yǎng)并收集培養(yǎng)出的細菌，將所收集的細菌用PH為7.2的PBS液沖洗，用生理鹽水稀釋后，經(jīng)ATB濁度儀比色后配制成3.0X 18Cfu/ml的納米細菌菌液混懸液備實驗用；
[0026]S102、大鼠分組處理:
[0027]將40只大鼠平均隨機分為5組，被分養(yǎng)在5個籠中，能自由獲取食物