專(zhuān)利名稱(chēng)：可吸收的微顆粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種持續(xù)釋放配合物，該配合物包括固定在可選擇地具有可吸收聚合物包被的可吸收聚合物微顆粒上的一種或多種肽、一種或多種蛋白質(zhì)、或者其組合物。本發(fā)明的微顆粒配合物包括肽(類(lèi))和/或蛋白質(zhì)(類(lèi))，其每個(gè)分子具有至少一個(gè)氨基和/或一個(gè)羧基；且可吸收的聚酯固體微顆粒具有足量的、結(jié)合到肽(類(lèi))和/或蛋白質(zhì)(類(lèi))的表面和次表面的羧基或氨基，以使固定化肽(類(lèi))或蛋白質(zhì)(類(lèi))占微顆粒配合物總量的0.1％-30％。這種具有固定化肽(類(lèi))和/或蛋白質(zhì)(類(lèi))的微顆粒配合物還可以進(jìn)一步用可吸收聚合物選擇地進(jìn)行單個(gè)包裹或按組包裹，以便進(jìn)一步控制固定化肽(類(lèi))和/或蛋白質(zhì)(類(lèi))的釋放。為了進(jìn)一步控制固定化肽(類(lèi))和/或蛋白質(zhì)(類(lèi))的釋放，該包裹微顆加入到具有可吸收膠凝液體的組合物中，在生物環(huán)境中與水接觸后能轉(zhuǎn)化成柔性凝膠或半固體物。
用于在體內(nèi)控制藥物組合物釋放的許多藥物傳送系統(tǒng)已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)、試驗(yàn)和利用。例如，已經(jīng)將聚(DL-乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(ε-己內(nèi)酯)之類(lèi)的聚酯和其它各種共聚物用于釋放生物活性分子，如孕酮；已將它們制成微膠囊、片或棒的形式(M.Chasin和R.Langer，編輯，《作為藥物傳送系統(tǒng)的生物降解聚合物》，Dekker，紐約，1990)。通過(guò)植入聚合物/治療劑組合物，例如皮下或肌內(nèi)植入，這種治療劑可在一段特殊時(shí)期內(nèi)釋放。將這種生物相容性生物降解聚合系統(tǒng)設(shè)計(jì)成允許被截留的治療劑從聚合物基質(zhì)中擴(kuò)散。通過(guò)治療劑的釋放，截去的治療劑在體內(nèi)降解，避免了植入的外科去除。雖然對(duì)截去劑降解起作用的因素不是很清楚，但-般認(rèn)為這種聚酯的降解可以通過(guò)酯鍵易受聚合成分的非酶自動(dòng)催化水解的影響這一特性來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)。
一些EPO公開(kāi)出版物和美國(guó)專(zhuān)利已論述了有關(guān)聚合物基質(zhì)設(shè)計(jì)及其在調(diào)節(jié)治療劑的體內(nèi)釋放速度和程度的問(wèn)題。
例如，Deluca(EPO出版物0467389A2)描述了疏水生物降解聚合物與蛋白質(zhì)或肽之間的物理相互作用。所形成的組合物是治療劑與疏水聚合物的混合物，將這種組合物給患者使用后，可以持續(xù)從該基質(zhì)中分散釋放。
Hutchinson(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,767,628)通過(guò)聚合裝置中的均勻分散來(lái)控制治療劑的釋放。其中公開(kāi)了這種制劑通過(guò)以下兩個(gè)階段的疊加達(dá)到控制持續(xù)釋放首先，是藥物從制劑表面的分散依賴(lài)性濾除；其次，是通過(guò)由聚合物的降解產(chǎn)生的含水途徑釋放。
在Dunn等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,278,201(‘201專(zhuān)利)和5,077,049(‘049專(zhuān)利)中描述了其它就地形成的生物降解植入法和其形成方法。Dunn等的專(zhuān)利公開(kāi)了有助于恢復(fù)牙周囊中的牙周組織的方法，和防止牙的根表面周?chē)纳掀ぜ?xì)胞移動(dòng)的方法。該‘049專(zhuān)利公開(kāi)了在與牙表面相鄰處放置一種就地形成的生物降解屏障的方法。這種屏障呈微孔狀，包括各種確定大小的微孔，也可包括生物活性劑。這種屏障是通過(guò)以下方法形成的即將一種生物降解聚合物如聚(dl-丙交酯-共-乙交酯)的液體溶液放在牙周囊中，這種生物降解聚合物在可與水混合的無(wú)毒有機(jī)溶劑如N-甲基吡咯烷酮(即聚合物的濃度達(dá)約50％)中具有可在水中凝固和熱塑的特性。這種有機(jī)溶劑分散在牙周液和生物降解的、可在水中凝固的聚合物中形成一種就地形成的固體生物降解植入。在這種固體生物降解植入中，溶劑的這種分散產(chǎn)生微孔，從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。該‘859專(zhuān)利也公開(kāi)了從生物降解的可治愈的熱固預(yù)聚物、治愈劑和水溶性物質(zhì)如鹽、糖、以及水溶性聚合物的液體混合物形成生物降解屏障的方法。這種可治愈熱固預(yù)聚物被稱(chēng)作末端為丙烯酸酯的可吸收聚合物。
另外，文獻(xiàn)中公開(kāi)了許多控制生物活性化合物在不同部位的傳送的系統(tǒng)。例如，F(xiàn)ujioka等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,011,692公開(kāi)了一種持續(xù)脈沖樣釋放藥物制劑，它包括含藥物的聚合物質(zhì)層。這種聚合物質(zhì)層僅僅含有微量藥物、或者不含藥物。整個(gè)表面沿垂直于平面層的方向延伸，并且被不溶于水的聚合物質(zhì)涂覆。這些類(lèi)型的脈沖樣釋放藥劑適用于皮膚下包埋。
Chesterfield等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,366,756描述了制備多孔、可生物吸收的外科植入的物質(zhì)的方法。這種方法包括提供一定量的可生物吸收的植入物質(zhì)的顆粒和具有至少一種生長(zhǎng)因子的可生物吸收的植入物質(zhì)的包被顆粒。該植入物也可含有抗菌劑。
Yamhira等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,385,738公開(kāi)了一種持續(xù)釋放注射系統(tǒng)，其包括一種用于注射的粉末懸浮液，這種懸浮液含有存在于粘性溶劑(如植物油、聚乙二醇、丙二醇、硅油和中鏈脂肪酸甘油三酯)中的活性成分和藥物上可接受的生物降解屏障(如蛋白質(zhì)、多糖和合成的高分子化合物，優(yōu)選膠原蛋白、不全膠原蛋白、明膠、及其混合物)。藥物制劑中的這種活性成分是以下列狀態(tài)式加入到在生物降解屏障中的(ⅰ)活性成分與屏障基質(zhì)化學(xué)結(jié)合；(ⅱ)活性成分通過(guò)分子間作用與屏障結(jié)合；(ⅲ)活性成分被物理包圍在屏障基質(zhì)中。
而且，前面文獻(xiàn)例如Dunn等(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,938,763)所述的這些系統(tǒng)，指導(dǎo)了通過(guò)聚合物溶液在有機(jī)溶劑如N-甲基-吡咯烷酮中的凝固、從而在生物體內(nèi)就地形成可生物降解的微孔固體植入物。然而，使用包括那些低分子有機(jī)溶劑在內(nèi)的溶劑可促進(jìn)溶液從應(yīng)用部位的移動(dòng)，從而導(dǎo)致對(duì)活體組織的破壞，包括細(xì)胞脫水和壞死。溶劑的大量丟失可引起凝固物萎縮和與周?chē)M織分離。
美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,612,052描述了使由帶羧基的聚酯鏈形成的陽(yáng)離子交換微顆粒固定，該聚酯鏈上含有基本活性劑，以提供一種含有可吸收的膠凝液體聚酯的控制釋放系統(tǒng)。美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,612,052的內(nèi)容在此引作參考。在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,672,659和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,665,702等現(xiàn)有技術(shù)中記載了羧酸體與堿性多肽的離子共軛作用。但是，這些配合物是可溶性化學(xué)體，它是通過(guò)各自溶液中的單個(gè)堿性成分和羧酸成分的分子反應(yīng)形成的，生成一種確定的離子共軛體，其作為一種具有理化特性的新化學(xué)體。與本發(fā)明的區(qū)別之處在于，本發(fā)明的配合物是在包括初級(jí)表面配合物形成的多相系統(tǒng)中形成的。
本發(fā)明涉及一種結(jié)合微顆粒，它包括一種可吸收雜鏈聚合物核心及其固定在所述的可吸收雜鏈聚合物核心上的一種或多種肽、一種或多種蛋白質(zhì)或其混合物。
其中每一種肽分別選自由以下所組成的組生長(zhǎng)激素釋放肽(GHRP)、促黃體素釋放激素(LHRH)、抑生長(zhǎng)素、鈴蟾肽、胃泌素釋放肽(GRP)、降鈣素、緩激肽、galanin、促黑激素(MSH)、生長(zhǎng)激素釋放因子(GRF)、糊精、速激肽、胰泌素、甲狀旁腺素(PTH)、腦啡呔、內(nèi)皮素、降鈣素基因釋放肽(CGRP)、神經(jīng)調(diào)節(jié)肽、甲狀旁腺素相關(guān)蛋白質(zhì)(PTHrP)、胰高血糖素、神經(jīng)降壓肽、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、YY肽(PYY)、胰高血糖素釋放肽(GLP)、血管活性腸肽(VIP)、垂體腺苷酸酯環(huán)化酶活性肽(PACAP)、促胃動(dòng)素、P物質(zhì)、神經(jīng)肽Y(NPY)、促甲狀腺激素以及其類(lèi)似物和片段或其藥物上可接受的鹽；和其中每一種蛋白質(zhì)分別選自由以下所組成的組生長(zhǎng)激素、促紅細(xì)胞生成素、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子和干擾素。
剛才前面所述的一種優(yōu)選的結(jié)合微顆粒稱(chēng)作B組，其中所述的肽、蛋白質(zhì)或其混合物或其藥物上可接受的鹽占該結(jié)合微顆?？偭康?.1％-30％。
剛才前面所述的一種優(yōu)選的結(jié)合微顆粒稱(chēng)作C組，其中所述的可吸收雜鏈聚合物核心包括甘醇酸酯單元。
剛才前面所述的一種優(yōu)選的結(jié)合微顆粒稱(chēng)作D組，其中所述的可吸收雜鏈聚合物核心進(jìn)一步包括檸檬酸酯殘余物、酒石酸酯殘余物或蘋(píng)果酸酯殘余物。
剛才前面所述的一種優(yōu)選的結(jié)合微顆粒稱(chēng)作E組，其中甘醇酸酯單元與檸檬酸酯殘余物、酒石酸酯殘余物或蘋(píng)果酸酯殘余物的比例為約7-1∶約20-1。
C組另一種優(yōu)選的結(jié)合微顆粒是其中所述的甘醇酸酯單元的末端具有羧基部分的微顆粒。
C組另一種優(yōu)選的結(jié)合微顆粒是其中所述的甘醇酸酯單元的末端為胺部分的微顆粒。
另一方面，本發(fā)明提供了一種包裹微顆粒，它包括一種或多種包裹在可吸收包裹聚合物中的結(jié)合微顆粒。
其中所述的結(jié)合微顆粒包括可吸收雜鏈聚合物核心及其固定在所述的吸收雜鏈聚合物核心上的一種或多種肽、一種或多種蛋白質(zhì)或其混合物。
其中每一種肽分別選自由以下所組成的組生長(zhǎng)激素釋放肽(GHRP)、促黃體素釋放激素(LHRH)、抑生長(zhǎng)素、鈴蟾肽、胃泌素釋放肽(GRP)、降鈣素、緩激肽、galanin、促黑激素(MSH)、生長(zhǎng)激素釋放因子(GRF)、糊精、速激肽、胰泌素、甲狀旁腺素(PTH)、腦啡呔、內(nèi)皮素、降鈣素基因釋放肽(CGRP)、神經(jīng)調(diào)節(jié)肽、甲狀旁腺素相關(guān)蛋白質(zhì)(PTHrP)、胰高血糖素、神經(jīng)降壓肽、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、YY肽(PYY)、胰高血糖素釋放肽(GLP)、血管活性腸肽(VIP)、垂體腺苷酸酯環(huán)化酶活性肽(PACAP)、促胃動(dòng)素、P物質(zhì)、神經(jīng)肽Y(NPY)、促甲狀腺激素及其類(lèi)似物和片段或其藥物上可接受的鹽；每一種蛋白質(zhì)分別選自由以下所組成的組生長(zhǎng)激素、促紅細(xì)胞生成素、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子和干擾素；和其中上述的可吸收雜鏈聚合物核心包括甘醇酸酯單元。
一種剛才所述優(yōu)選的包裹微顆粒是，其中所述的肽、蛋白質(zhì)或其混合物或其藥物上可接受的鹽占該結(jié)合微顆?？偭康?.1％-30％，且其中所述的可吸收的雜鏈聚合物核心進(jìn)一步包括檸檬酸酯殘余物、酒石酸酯殘余物或蘋(píng)果酸酯殘余物。
一種剛才所述優(yōu)選的包裹微顆粒稱(chēng)作F組，其中甘醇酸酯單元與檸檬酸酯殘余物、酒石酸酯殘余物或蘋(píng)果酸酯殘余物的比例為約7-1∶約20-1，且所述的甘醇酸酯單元的末端為羧基部分或胺部分。
一種剛才所述優(yōu)選的包裹微顆粒是，其中所述的可吸收包裹聚合物包括(a)l-丙交酯基本單元和乙交酯基本單元，(b)d,l-丙交酯基本單元和乙交酯基本單元，(c)d,l-丙交酯基本單元，或(d)l-丙交酯基本單元和d,l-丙交酯基本單元。
一種剛才所述優(yōu)選的包裹微顆粒是，其中l(wèi)-丙交酯基本單元與乙交酯基本單元的比例為約75-25∶約90-10,l-丙交酯基本單元與d,l-丙交酯基本單元的比例為約80-20，且d,l-丙交酯基本單元與乙交酯基本單元的比例為約75-25∶約90-10。
F組的一種優(yōu)選的包裹微顆粒是，其中所述的可吸收包裹聚合物占該包裹微顆粒總量的5％-70％。
剛才前面所述一種優(yōu)選的包裹微顆粒是，其中所述可吸收包裹聚合物占該包裹微顆?？偭康?0-60％。
剛才前面所述一種優(yōu)選的包裹微顆粒是，其中所述的可吸收包裹聚合物占該包裹微顆?？偭康?0-50％。
另一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，它包括上述結(jié)合微顆粒和藥物上可接受的載體。
另一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，它包括上述結(jié)合微顆粒、一種非水可吸收膠凝液體聚酯和任一藥物上可接受的載體。
另一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，它包括上述包裹微顆粒和藥物上可接受的載體。
另一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，它包括上述包裹微顆粒、一種非水可吸收膠凝液體聚酯和任一藥物上可接受的載體。
D組另一種優(yōu)選的結(jié)合微顆粒稱(chēng)作G組，其中可吸收雜鏈聚合物核心包括檸檬酸酯殘余物，且肽是LHRH類(lèi)似物。
剛才前面所述的一種優(yōu)選的結(jié)合微顆粒是，其中甘醇酸酯單元與可吸收雜鏈聚合物核心的檸檬酸酯殘余物的比例為約7-1∶約20-1，其中LHRH類(lèi)似物為p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2。
D組另一種優(yōu)選的結(jié)合微顆粒稱(chēng)作H組，其中可吸收雜鏈聚合物核心包括酒石酸酯殘余物，且肽是LHRH類(lèi)似物。
剛才前面所述一種優(yōu)選的結(jié)合微顆粒是，其中甘醇酸酯單元與酒石酸酯殘余物的比例為約7-1∶約20-1，且LHRH類(lèi)似物為p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2。
D組另一種優(yōu)選的結(jié)合微顆粒稱(chēng)作I組，其中可吸收雜鏈聚合物核心包括檸檬酸酯殘余物，且肽是抑生長(zhǎng)素類(lèi)似物。
剛才前面所述一種優(yōu)選的結(jié)合微顆粒是，其中甘醇酸酯單元與檸檬酸酯殘余物的比例為約7-1∶約20-1，且抑生長(zhǎng)素類(lèi)似物為H-β-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2，其中兩個(gè)Cys通過(guò)二硫鍵連接；N-羥乙基哌嗪基-乙?；?D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2，其中兩個(gè)Cys通過(guò)二硫鍵連接；或N-羥乙基哌嗪基-乙磺?；?Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2，其中兩個(gè)Cys通過(guò)二硫鍵連接。
D組另一種優(yōu)選的結(jié)合微顆粒稱(chēng)作J組，其中可吸收雜鏈聚合物核心包括酒石酸酯殘余物，且肽是抑生長(zhǎng)素類(lèi)似物。
剛才前面所述一種優(yōu)選的結(jié)合微顆粒是，其中甘醇酸酯單元與酒石酸酯殘余物的比例為約7-1∶約20-1，且抑生長(zhǎng)素類(lèi)似物為H-β-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2，其中兩個(gè)Cys通過(guò)二硫鍵連接；N-羥乙基哌嗪基-乙?；?D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2，其中兩個(gè)Cys通過(guò)二硫鍵連接；或N-羥乙基哌嗪基-乙磺?；?Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2，其中兩個(gè)Cys通過(guò)二硫鍵連接。
一種優(yōu)選的本發(fā)明包裹微顆粒是包括G組的一種或多種包裹在可吸收包裹聚合物中的結(jié)合微顆粒，其中所述的可吸收包裹聚合物包括(a)l-丙交酯基本單元和乙交酯基本單元，(b)d,l-丙交酯基本單元和乙交酯基本單元，(c)d,l-丙交酯基本單元，或(d)l-丙交酯基本單元和d,l-丙交酯基本單元。
剛才前面所述一種優(yōu)選的包裹微顆粒是，其中甘醇酸酯單元與可吸收聚合物核心的檸檬酸酯殘余物的比例為約7-1∶約20-1,LHRH類(lèi)似物為p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2，其中(a)l-丙交酯基本單元與乙交酯基本單元的比例為約75-25∶約90-10,
(b)d,l-丙交酯基本單元與乙交酯基本單元的比例為約75-25∶約90-10，和(c)l-丙交酯基本單元與d,l-丙交酯基本單元的比例為約80-20。
另一種優(yōu)選的包裹微顆粒包括H組的一種或多種包裹在可吸收包裹聚合物中的結(jié)合微顆粒，其中所這的可吸收的包裹聚合物包括(a)l-丙交酯基本單元和乙交酯基本單元，(b)d,l-丙交酯基本單元和乙交酯基本單元，(c)d,l-丙交酯基本單元，或(d)l-丙交酯基本單元和d,l-丙交酯基本單元。
剛才前面所述一種優(yōu)選的包裹微顆粒是，其中甘醇酸酯單元與可吸收聚合物核心的酒石酸酯殘余物的比例為約7-1∶約20-1,LHRH類(lèi)似物為p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2，其中(a)l-丙交酯基本單元與乙交酯基本單元的比例為約75-25∶約90-10,(b)d,l-丙交酯基本單元與乙交酯基本單元的比例為約75-25∶約90-10,(c)l-丙交酯基本單元與d,l-丙交酯基本單元的比例為約80-20。
另一種優(yōu)選的包裹微顆粒包括I組的一種或多種包裹在可吸收包裹聚合物中的結(jié)合微顆粒，其中所述的可吸收包裹聚合物包括(a)l-丙交酯基本單元和乙交酯基本單元，(b)d,l-丙交酯基本單元和乙交酯基本單元，(c)d,l-丙交酯基本單元，或(d)l-丙交酯基本單元和d,l-丙交酯基本單元。
剛才前面所述另一種優(yōu)選的包裹微顆粒是，其中甘醇酸酯單元與可吸收聚合物核心的檸檬酸酯殘余物的比例為約7-1∶約20-1，抑生長(zhǎng)素類(lèi)似物為H-β-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2，其中兩個(gè)Cys通過(guò)二硫鍵連接；N-羥乙基哌嗪基-乙?；?D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2，其中兩個(gè)Cys通過(guò)二硫鍵連接；或N-羥乙基哌嗪基-乙磺?；?Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2，其中兩個(gè)Cys通過(guò)二硫鍵連接，且其中(a)l-丙交酯基本單元與乙交酯基本單元的比例為約75-25∶約90-10,(b)d,l-丙交酯基本單元與乙交酯基本單元的比例為約75-25∶約90-10,(c)l-丙交酯基本單元與d,l-丙交酯基本單元的比例為約80-20。
另一種優(yōu)選的包裹微顆粒包括J組的一種或多種結(jié)合微顆粒和可吸收包裹聚合物，所述的可吸收包裹聚合物包括(a)l-丙交酯基本單元和乙交酯基本單元，(b)d,l-丙交酯基本單元和乙交酯基本單元，(c)d,l-丙交酯基本單元，或(d)l-丙交酯基本單元和d,l-丙交酯基本單元。
剛才前面所述一種優(yōu)選的包裹微顆粒是，其中甘醇酸酯單元與可吸收聚合物核心的酒石酸酯殘余物的比例為約7-1∶約20-1，抑生長(zhǎng)素類(lèi)似物為H-β-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2，其中兩個(gè)Cys通過(guò)二硫鍵連接；N-羥乙基哌嗪基-乙?；?D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2，其中兩個(gè)Cys通過(guò)二硫鍵連接；或N-羥乙基哌嗪基-乙磺酰基-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2，其中兩個(gè)Cys通過(guò)二硫鍵連接，且其中(a)l-丙交酯基本單元與乙交酯基本單元的比例為約75-25∶約90-10,(b)d,l-丙交酯基本單元與乙交酯基本單元的比例為約75-25∶約90-10,(c)l-丙交酯基本單元與d,l-丙交酯基本單元的比例為約80-20。
另一方面，本發(fā)明提供了一種用于制備上述的包裹微顆粒的方法，其包括用可吸收包裹聚合物包裹結(jié)合微顆粒的步驟。
前面所述的一種優(yōu)選方法是，其中所述結(jié)合微顆粒在溶液中的分散包括將所述的可吸收包裹聚合物和溶劑滴在預(yù)冷卻的介質(zhì)上，其中所說(shuō)的介質(zhì)不是所述的可吸收包裹聚合物的溶劑。
前面所述的一種優(yōu)選方法是，其中可吸收包裹聚合物溶液包裹約5％-30％可吸收包裹聚合物，預(yù)冷卻介質(zhì)是具有兩個(gè)或多個(gè)碳原子的醇，且介質(zhì)的溫度為室溫至約-80℃。
前面所述的一種優(yōu)選方法是，其中預(yù)冷卻介質(zhì)的溫度為約-60℃--80℃，且介質(zhì)為異丙醇。
此外，另一方面，本發(fā)明提供了一種用于制備上述的包裹微顆粒的方法，它包括采用乳化技術(shù)、用可吸收包裹聚合物包裹結(jié)合微顆粒的步驟。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“可吸收的”意指不溶于水的物質(zhì)如聚合物，其經(jīng)過(guò)生物環(huán)境中的鏈離解作用變成可溶于水的副產(chǎn)物。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“微顆?！币庵缚晌盏木埘ヮw粒，其中優(yōu)選實(shí)際上為球形者。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“結(jié)合微顆?！币庵妇哂幸噪x子形式固定在微顆粒上的一種或多種肽和/或一種或多種蛋白質(zhì)的微顆粒。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“包裹微顆粒”意指具有聚合物包被的結(jié)合微顆粒，這種聚合物包被不是必須完全閉合。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“聚合物核心”，是表示微顆粒的另一種方式。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“包裹聚合物”意指用于包裹結(jié)合微顆粒的聚合物。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“膠凝液體聚酯”意指吸收水之類(lèi)的溶劑、進(jìn)行相轉(zhuǎn)化和維持能產(chǎn)生可逆形變的三維網(wǎng)絡(luò)的物質(zhì)。
本發(fā)明用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)的三個(gè)縮寫(xiě)字母來(lái)表示氨基酸，例如，Ala=丙氨酸。
本發(fā)明的微顆粒是結(jié)晶微顆粒，由可吸收的聚酯形成，例如在單鏈上具有一個(gè)或多個(gè)羧基的聚乙交酯，其可在微顆粒的表面和微顆粒的瞬間次表面上形成足夠濃度的羧基，以對(duì)具有一個(gè)或多個(gè)堿性基團(tuán)的肽(類(lèi))和/或蛋白質(zhì)(類(lèi))進(jìn)行絡(luò)合和離子固定?；蛘撸缈赏ㄟ^(guò)二胺、優(yōu)選伯胺或仲胺或其混合物，使聚乙交酯的羧基酰胺化，其中所述的胺形成一種對(duì)具有一個(gè)或多個(gè)酸性基團(tuán)的肽(類(lèi))和/或蛋白質(zhì)(類(lèi))進(jìn)行離子固定的配合物。由于這種微顆粒的表面不必均勻，因此術(shù)語(yǔ)“次表面”是指在微顆粒表面發(fā)現(xiàn)的裂隙，等等。這種結(jié)合微顆粒提供了一種控制肽(類(lèi))和/或蛋白質(zhì)(類(lèi))在病人身上的釋放的方法。為了進(jìn)一步控制固定化肽(類(lèi))和/或蛋白質(zhì)(類(lèi))的釋放，可用可吸收聚合物包被對(duì)結(jié)合微顆粒進(jìn)行單個(gè)包裹或按組包裹。這種結(jié)合微顆?？墒闺?類(lèi))和/或蛋白質(zhì)(類(lèi))在病人身上釋放約兩天至三個(gè)月的時(shí)間，優(yōu)選約一周至三個(gè)月。這種包裹微顆?？墒闺?類(lèi))和/或蛋白質(zhì)(類(lèi))在病人身上釋放約三天至六個(gè)月，優(yōu)選約兩周至五個(gè)月的時(shí)間。
可固定在微顆粒上的肽的典型例子包括但不限于生長(zhǎng)激素釋放肽(GHRP)、促黃體素釋放激素(LHRH)、抑生長(zhǎng)素、鈴蟾肽、胃泌素釋放肽(GRP)、降鈣素、緩激肽、galanin、促黑激素(MSH)、生長(zhǎng)激素釋放因子(GRF)、糊精、速激肽、胰泌素、甲狀旁腺素(PTH)、腦啡呔、內(nèi)皮素、降鈣素基因釋放肽(CGRP)、神經(jīng)調(diào)節(jié)肽、甲狀旁腺素相關(guān)蛋白質(zhì)(PTHrP)、胰高血糖素、神經(jīng)降壓肽、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、YY肽(PYY)、胰高血糖素釋放肽(GLP)、血管活性腸肽(VIP)、垂體腺苷酸酯環(huán)化酶活性肽(PACAP)、促胃動(dòng)素、P物質(zhì)、神經(jīng)肽Y(NPY)、促甲狀腺激素、及其類(lèi)似物和片段。可固定在微顆粒上的蛋白質(zhì)的例子有生長(zhǎng)激素、促紅細(xì)胞生成素、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子和干擾素。
微顆粒可以由基于丙交酯的聚合物或固體半結(jié)晶聚內(nèi)酯如聚乙交酯制成，這種固體半結(jié)晶聚內(nèi)酯可通過(guò)帶有酸的羥基的引發(fā)劑如乙醇酸、乳酸、蘋(píng)果酸酯、酒石酸酯和檸檬酸酯的開(kāi)環(huán)聚合作用而形成。本發(fā)明的微顆?？赏ㄟ^(guò)下列方法合成。將基于單體和/或內(nèi)酯如乙交酯和酸引發(fā)劑如酒石酸、蘋(píng)果酸或檸檬酸置于反應(yīng)容器中混合。將反應(yīng)容器加熱至約35-45℃，優(yōu)選40℃，在真空中放置約20-60分鐘，優(yōu)選30分鐘。將反應(yīng)容器溫度升至約105-115℃，優(yōu)選110℃。一旦達(dá)到這一溫度，則將該容器放在無(wú)氧氮?dú)庵?，并攪拌混合物。一旦混合物熔化后，立即加入催化量的適用于開(kāi)環(huán)聚合作用的有機(jī)金屬催化劑，例如非質(zhì)子溶劑如加入甲苯的2-乙基-己酸亞錫酯溶液。再使用約30-90秒真空，以去除甲苯，但不會(huì)明顯去除單體。經(jīng)約5-10分鐘使該混合物的溫度升至約115-125℃，優(yōu)選120℃。然后將該混合物的溫度進(jìn)一步升至145-150℃，在不斷的機(jī)械攪拌下，使這一溫度保持約3-5小時(shí)，優(yōu)選4小時(shí)。
使用Knife通過(guò)研磨機(jī)初步研磨使得到的聚合物成為微小顆粒。然后，用加壓干氮?dú)饬鳌⒃贏ljet Micronizer中將該聚合物微?；?。使用體積分布模型和用200/5 cS硅油作為分散劑，在Malvern Mastersizer/E中對(duì)平均顆粒直徑大小進(jìn)行分析。
純化該聚合物，并通過(guò)將微?；酆衔锓稚⒃诒?，再在超聲發(fā)生器中放置，優(yōu)選約30分鐘，這樣得到該聚合物鈉鹽。在此期間，也可用均化器在約8,000-24,000rpm，優(yōu)選9,500rpm的速度下使分散體均化。經(jīng)超聲處理/均化步驟后，優(yōu)選經(jīng)約30分鐘將分散體在離心機(jī)中以約3,000-7,000rpm的速度離心，優(yōu)選5,000rpm。去掉上清液，將離心餅再次懸浮于新鮮丙酮中，重復(fù)超聲處理/均化步驟。一旦第二次離心結(jié)束，去掉上清液，將該離心餅再次懸浮于去離子水中。然后進(jìn)行最后一次超聲處理/均化步驟，以去除任何殘留的丙酮，將分散體再以約5,000rpm的速度離心約30分鐘。
將離心餅再次懸浮于新鮮的去離子水中，監(jiān)測(cè)分散體的pH。加入足夠體積的弱堿如0.2M碳酸鈉溶液，同時(shí)攪拌，以使pH升至約pH8-pH9之間。在通過(guò)濾紙過(guò)濾之前，將分散體攪拌約30分鐘。進(jìn)一步用去離子水沖洗濾餅，然后將其凍結(jié)和凍干。
用差示掃描量熱法(DSC)，以約5℃/分鐘-15℃/分鐘的加熱速度，優(yōu)選10℃/分鐘，監(jiān)測(cè)純化過(guò)程。
通過(guò)將陽(yáng)離子交換微顆粒在二胺的熱稀釋溶液(約80℃)中溫育可得到陰離子交換微顆粒，所述的胺優(yōu)選可以是兩種伯胺或兩種仲胺或伯胺與仲胺的混合物的這種胺，此胺在惰性氣體如氬中、在二惡烷或THF中的濃度是已知的。通過(guò)酸量滴定法測(cè)定二噁烷或THF中的二胺的濃度。當(dāng)反應(yīng)實(shí)際停止時(shí)，通過(guò)過(guò)濾分離酰胺化的微顆粒、用二惡烷或THF沖洗，并在減壓下干燥。
根據(jù)下列方法可將肽(類(lèi))和/或蛋白質(zhì)(類(lèi))固定在微顆粒上。將微顆粒的鈉鹽分散在含有無(wú)堿、溶于水的肽(類(lèi))和/或蛋白質(zhì)(類(lèi))的溶液中。在濾出結(jié)合微顆粒之前，將分散液在室溫下溫育、并同時(shí)攪拌2小時(shí)。進(jìn)一步用去離子水沖洗濾餅、然后將其凍結(jié)和凍干。然后通過(guò)元素分析來(lái)分析樣本中的氮、以測(cè)定被固定的肽(類(lèi))和/或蛋白質(zhì)(類(lèi))的數(shù)量。
微顆粒的大小可影響肽和/或蛋白質(zhì)的數(shù)量，這種肽和/或蛋白質(zhì)可被微顆粒固定。微顆粒的尺寸越小，微顆粒群則具有更大的表面積，因而每個(gè)微顆粒群可固定更多的肽和/或蛋白質(zhì)。按照上述方法可使微顆粒的直徑大小減至微米或亞微米。微顆粒的直徑范圍可以是約0.5μm至100μm，優(yōu)選1μm至15μm，更優(yōu)選3μm至10μm。
可吸收包裹微顆?？梢允墙Y(jié)晶或非結(jié)晶的丙交酯/乙交酯共聚物、非晶l-丙交酯/d,l-丙交酯共聚物、己內(nèi)酯/乙交酯共聚物或碳酸亞丙基酯/乙交酯共聚物，它們?cè)谙铝辛?xí)用的有機(jī)溶劑中是可溶的，例如氯仿、二氯甲烷、丙酮、乙腈、乙酸乙酯和甲酸乙酯。這些可吸收包裹聚合物的非溶劑包括水、低沸點(diǎn)醇和烴。這些可吸收包裹聚合物可通過(guò)催化內(nèi)酯的開(kāi)環(huán)聚合作用合成；或在鏈引發(fā)劑如羥聚羧酸存在下，通過(guò)環(huán)狀單體的聚合作用合成，這些單體例如有ε-己內(nèi)酯、對(duì)二惡烷酮、碳酸亞丙基酯、1,5-二氧環(huán)雜庚烷-2-酮，或1,4-二氧環(huán)雜庚烷-2-酮。還有另一種方法，即將有機(jī)聚羧酸與預(yù)先形成的聚酯反應(yīng)，這種方法在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,612,052中已公開(kāi)，其內(nèi)容在此引作參考。
可通過(guò)乳狀液的相分離可實(shí)現(xiàn)結(jié)合微顆粒的包裹。一種可替代的包裹方法必須使用超聲噴霧器，在此可吸收包裹聚合物溶液中的結(jié)合微顆粒的分散體以微液滴的形式滴在冷卻的非溶劑介質(zhì)中。采用傳統(tǒng)的固體顆粒的微囊化或包被技術(shù)如乳液蒸發(fā)方法，用丙交酯和乙交酯的可吸收包裹共聚物包裹結(jié)合微顆粒，這種乳劑蒸發(fā)方法是H.Demian和S.W.Shalaby在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)USSN:08/467,361中所公開(kāi)的用于使硫酸鋇微顆粒微囊化的方法，其內(nèi)容在此引作參考；或者通過(guò)以下方法包裹結(jié)合微顆粒，即凝固包裹在聚合物溶液中的固體微顆粒、并將它通過(guò)超聲噴霧器(霧化器)傳送至液體介質(zhì)中，這種液體介質(zhì)是包裹聚合物的非溶劑，但這種非溶劑液體介質(zhì)能萃取關(guān)于包裹固體微顆粒的包裹聚合物溶液中的溶劑。根據(jù)用于包裹微顆粒的聚合物溶液的濃度的不同，在包裹微顆粒中的初始結(jié)合微顆粒數(shù)量是可以從1至數(shù)百不等，其中包裹微顆粒的平均直徑為0.5μm-100μm。
下面的方法是有關(guān)通過(guò)霧化作用來(lái)制備載肽和/或載蛋白質(zhì)(以下稱(chēng)載肽)的包裹陽(yáng)離子交換劑。將該包裹共聚物按10-30％(W/W)之間的濃度溶解在溶劑中，例如這種溶劑可以是乙腈、乙酸乙酯或甲酸乙酯。將足夠量的這種溶液用于載肽CE的分散，以使載肽CE與包裹共聚物的重量比范圍為約30∶70-約80∶20。通過(guò)高速均化達(dá)到分散。以1ml/分鐘至10ml/分鐘的流速將分散體送入頻率可變的超聲霧化噴嘴中，該頻率可在12kHz至35kHz的范圍內(nèi)變化，較高的頻率可允許較快的流速，同時(shí)可保持顆粒的特性。因此將分散體置于收集池中霧化，該收集池由含足量干冰球(通常每升IPA含干冰0.5-1kg)的1-10倍過(guò)量的異丙醇或乙醇(與所用的包裹聚合物溶劑的體積相比)組成，以便整個(gè)霧化過(guò)程中使?jié){液的溫度保持在-70℃--80℃之間。根據(jù)漿液的體積的不同，以300-700rpm的速度將其攪拌。在乙腈作溶劑的情況下，霧化液滴與漿液接觸時(shí)立即將液滴凍結(jié)。霧化結(jié)束后，在真空過(guò)濾之前，立即將整個(gè)分散體在規(guī)定的10℃至室溫的溫度下使其自身熔化。用去離子水沖洗濾餅，以去除過(guò)剩的非溶劑。在主要為d,l-丙交酯包裹共聚物的情況下，所得到的顆粒呈平滑的微球體；當(dāng)這種包裹共聚物主要是基于l-丙交酯時(shí)，該包裹共聚物會(huì)出現(xiàn)輕微皺褶。
微顆粒離子交換劑的結(jié)合容量可按下述方法測(cè)定。例如，對(duì)于陽(yáng)離子交換劑微顆粒，用已知當(dāng)量濃度的碳酸鈉的稀釋冷水溶液，在預(yù)定的微顆粒體中來(lái)中和可獲得的羧基。通過(guò)過(guò)濾來(lái)分離這種中和的微顆粒，并用冷的去離子水徹底沖洗，再空氣干燥。然后將固體微顆粒在已知濃度的毛果蕓香堿鹽酸鹽的稀釋溶液中培養(yǎng)，以便得到從結(jié)合容量數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)的稍過(guò)量的堿性藥物。對(duì)剩余的毛果蕓香堿鹽酸鹽在含水介質(zhì)中的濃度進(jìn)行一段時(shí)間監(jiān)測(cè)，直至記錄到在微顆粒所吸附的堿中不出現(xiàn)顯著變化。從得出的數(shù)據(jù)測(cè)定微顆粒上的固定堿的百數(shù)，然后通過(guò)元素分析來(lái)檢驗(yàn)氮。
通過(guò)以下方法測(cè)定陰離子交換劑(酰胺化顆粒)的結(jié)合容量(1)氮的元素分析和(2)通過(guò)用HPLC測(cè)定稀釋溶液中萘普生的去除程度而決定的與萘普生結(jié)合的程度。后者可通過(guò)用已知濃度的氫氧化鈉稀釋溶液的固定萘普生的釋放來(lái)證實(shí)。
本發(fā)明的結(jié)合微顆粒或包裹微顆?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的給藥途徑對(duì)患者給藥，例如通過(guò)腸胃外給藥、口服給藥或局部給藥。優(yōu)選以粉劑或經(jīng)鼻內(nèi)途徑的懸浮液或通過(guò)呼吸系統(tǒng)吸入的方式給藥。當(dāng)腸胃外給藥時(shí)，優(yōu)選以等滲含水介質(zhì)的形式、或以描述在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,612,052中的可吸收的膠凝非水液體聚酯中的分散體的形式給藥，其內(nèi)容在此引作參考。本發(fā)明含結(jié)合微顆粒和/或包裹微顆粒的制劑還可包括各種可選擇的成分。這些成分包括(但不限于此，)表面活性劑、粘度調(diào)節(jié)劑、藥用試劑、細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、染料、配位劑、抗氧化劑、其它聚合物如羧甲基纖維素、樹(shù)膠如瓜耳樹(shù)膠、蠟/油如蓖麻油、甘油、鄰苯二甲酸二丁酯和鄰苯二甲酸二(2-7基己基)酯，等等。使用時(shí)，這類(lèi)可選擇性成分占總制劑的約0.1％-約20％，優(yōu)選約0.5％-約5％。
結(jié)合微顆粒或包裹微顆粒用于患者的有效劑量可以由主治醫(yī)師或獸醫(yī)來(lái)確定，它也有賴(lài)于肽(類(lèi))和/或蛋白質(zhì)(類(lèi))的合適劑量和固定在微顆粒上的肽(類(lèi))和/或蛋白質(zhì)(類(lèi))的數(shù)量來(lái)決定。這些劑量可以是已知的，或也可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)決定。
在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,612,052中公開(kāi)了膠凝劑的制備，其內(nèi)容在此引作參考。膠凝劑的具體例子如下所述。
60/40亞丙基碳酸酯/乙交酯和聚乙二醇-400(GF-1)的80/20(重量比)嵌段共聚物的制備將聚乙二醇-400(0.299mole,119.5g)、辛酸亞錫(0.2M的甲苯溶液，4,700ml,0.946mmole)、乙交酯(1.78mole,206.5g)和碳酸亞丙基酯(2.65mole,270g)加入裝有機(jī)械攪拌器和氮?dú)馊肟诘幕鹧娓蓸?shù)脂鍋中。用氬沖洗反應(yīng)器數(shù)次，然后加熱熔化，再加熱，在150℃下攪拌約12小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束時(shí)，降低溫度，同時(shí)保持流動(dòng)，并在減壓下去除過(guò)量的單體。用紅外線和NMR分析所得到的聚合物中的組合物，并通過(guò)凝膠滲透色譜分析其分子量。
按上述GF-1的方法合成60/40亞丙基碳酸酯/乙交酯和聚乙二醇-400(GF-2)的15/85(重量比)嵌段共聚物，但使用的是聚乙二醇-400(1.063mole,425g)、辛酸亞錫(0.2M的甲苯溶液，1,760ml,0.35mmole)、乙交酯(0.279mole,32.4g)和碳酸亞丙基酯(0.418mole,42.6g)，攪拌約9小時(shí)。
按上述GF-1的方法合成90/10碳酸亞丙基酯/乙交酯和聚乙二醇-1500(GF-3)的80/20(重量比)嵌段共聚物，但使用的是聚乙二醇-1500(0.267mole,400g)、辛酸亞錫(0.2M的甲苯溶液，1,200ml,0.247mmole)、乙交酯(0.097mole,11.2g)和碳酸亞丙基酯(0.87mole,88.7g)，攪拌約13小時(shí)。
實(shí)施例Ⅰ用作陽(yáng)離子交換劑(CE)的、以檸檬酸酯起始的聚(乙醇酸)共聚物(PGCA)的制備、微?；图兓瘜?shí)施例Ⅰ(a):7/1 PGCA-將242.63g乙交酯(Purac生化，Arkelsedijk，荷蘭)和57.37g檸檬酸酯(Aldrich,Gillingham,Dorset,聯(lián)合國(guó))加入500ml玻璃反應(yīng)器中。將檸檬酸酯通過(guò)Abderhalden裝置(Aldrich,St.Louis,Missouri，美國(guó))中的硅膠(Fisher Scientific,Loughborough,Leics.，聯(lián)合國(guó))進(jìn)一步干燥。將反應(yīng)器浸在約40℃的油浴器中，并置于真空(0.04mbar)約30分鐘。然后降低浴器，將其溫度升至約110℃。一旦達(dá)到此溫度，則將反應(yīng)器置于無(wú)氧氮?dú)庵?，再浸漬。用Heidolph攪拌器(Heidolph Elektro GmbH,kelheim，德國(guó))以約100rpm的速度攪拌反應(yīng)器中的內(nèi)容物。反應(yīng)器中的內(nèi)容物熔化后，立即加入(化學(xué)計(jì)量比50ppm)1.09ml的0.1M 2-乙基己酸亞錫(Sigma,St.Louis Missouri，美國(guó))的甲苯(Riedel de-Haen,Seelze，德國(guó))溶液。通過(guò)一種液氮阱再使用真空約30秒，以去除甲苯，但不會(huì)明顯去除單體。在將油浴溫度升至150℃之前，將該油洛溫度升至約120℃，保持5分鐘，然后將該油浴溫度升至150℃，接著在約100rpm的恒定機(jī)械攪拌下保持該溫度約4小時(shí)。得到標(biāo)題聚合物。
實(shí)施例Ⅰ(b):10/1 PGCA-按實(shí)施例Ⅰa所述的方法得到標(biāo)題聚合物，但使用的是257.40g乙交酯、42.60g檸檬酸酯和1.10ml的0.1M 2-乙基己酸亞錫的甲苯溶液(化學(xué)計(jì)量比50ppm)。
實(shí)施例Ⅰ(c):15/1 PGCA-15/1 PGCA-將乙交酯(2.586mole,300g)、無(wú)水檸檬酸酯(0.172mole,33g)和辛酸亞錫(0.2M的甲苯溶液，862ml,0.172mmole)加入裝有機(jī)械攪拌器和氬氣入口的火焰干樹(shù)脂鍋中。用干氬沖洗聚合反應(yīng)器及其內(nèi)容物數(shù)次。聚合原料熔化后，將反應(yīng)物加熱、并在約160℃下攪拌直至聚合物開(kāi)始從熔化物沉淀出來(lái)。部分沉淀后不久，停止攪拌，在約160℃繼續(xù)反應(yīng)約2小時(shí)。聚合反應(yīng)結(jié)束時(shí)，將溫度降至低于120℃，并在減壓下去除過(guò)量的單體。用紅外線和NMR光譜檢驗(yàn)被分離的聚合物中的組合物。
微?；饔?用Knife研磨機(jī)(IKA,Staufen，德國(guó))將實(shí)施例Ⅰ(a)、Ⅰ(b)和Ⅰ(c)的每個(gè)聚合物初步研碎。然后使用加壓干氮?dú)饬髟贏ljet粉碎機(jī)(Fluid Engery Aljet,Plumsteadsville,Pennsylvania，美國(guó))中將它們粉碎。采用體積分布模型和200/5 cS硅油(Dow Corning,Seneffe，比利時(shí))作為分散劑、通過(guò)Malvern Mastersizer/E(Mavern,Worcs.，聯(lián)合國(guó))中的分析，實(shí)施例Ⅰ(a)的平均顆粒直徑大小為24.84μm。粉碎后，實(shí)施例Ⅰ(b)和Ⅰ(c)的平均顆粒直徑大小分別為4.69μm和6.31μm。
純化/鈉鹽形成-將每批容量為50g的實(shí)施例Ⅰ(a)、Ⅰ(b)和Ⅰ(c)分散在2L的丙酮(Riedel de-Haen,Seelze，德國(guó))中，并置于近程聲電定位器(Branson Ultrasonics BV,Soest，荷蘭)中約30分鐘。在此期間，用Ultra-turrax T25均化器(IKA,Staufen，德國(guó))以9,500rpm的速度均化該分散體。經(jīng)此超聲處理/均化步驟后，將分散體在Sorvall離心機(jī)(Sorvall,Wilmington,Delaware，美國(guó))中以5,000rpm的速度離心約30分鐘。去掉上清液，將離心餅再懸浮于新鮮丙酮中，重復(fù)超聲處理/均化步驟。一旦第二次離心結(jié)束，去掉上清液，將離心餅再懸浮于去離子水中。然后進(jìn)行最后一次超聲處理/均化步驟，以去除任何剩余的丙酮，并再將分散體以5,000rpm的速度離心約30分鐘。
將離心餅再懸浮于新鮮去離子水中，監(jiān)測(cè)分散體的pH。在每一反應(yīng)箱(帶有攪拌)中加入足夠體積的0.2M碳酸鈉溶液，以使pH升至約pH8致約pH9之間。在經(jīng)Whatman 1號(hào)(直徑24cm)濾紙(Whatman國(guó)際有限公司，Maidstone,Kent，聯(lián)合國(guó))真空過(guò)濾之前，將分散體攪拌約30分鐘。用去離子水進(jìn)一步?jīng)_洗濾餅，將其凍結(jié)，并在Edwards SuperModulyo凍干器(Edwards,Crawley,West Sussex，聯(lián)合國(guó))凍干。
用加熱速率為10℃/分鐘的TA DSC912S(TA儀器，New Castle,Delaware，美國(guó))、通過(guò)差示掃描量熱法(DSC)監(jiān)測(cè)純化過(guò)程。每個(gè)箱中所得到的DSC的溫譜差熱圖沒(méi)有出現(xiàn)任何單體乙交酯的吸熱峰，但實(shí)施例Ⅰ(a)、Ⅰ(b)和Ⅰ(c)分別在176℃、178℃和180℃出現(xiàn)吸熱。
實(shí)施例Ⅱ乙交酯/蘋(píng)果酸酯共聚物PAMA的微顆粒陽(yáng)離子交換劑的制備按實(shí)施例Ⅰ(c)所述的方法合成標(biāo)題微顆粒，但使用的是乙交酯(2.586mole,300g)、無(wú)水蘋(píng)果酸酯(0.172mole,23g)和辛酸亞錫(0.2M的甲苯溶液，862ml,0.172mmole)。差示掃描量熱法用于測(cè)定聚合物的熔化溫度(Tm=206℃)。
用Wiley碾磨機(jī)將固體聚合物粉碎得到平均顆粒直徑約125μm。用具有加壓干氮的噴射式碾磨機(jī)進(jìn)一步將顆粒大小減至直徑約5-10μm。用丙酮沖洗得到的微顆粒以去除微量單體和低分子量低聚物。然后將產(chǎn)品在減壓下于40℃干燥、直至使用。用粒度分析儀測(cè)定干微顆粒的平均直徑。
實(shí)施例Ⅲ用作陽(yáng)離子交換劑(CE)的、以酒石酸酯起始的聚(乙醇酸)共聚物(PGTA)的制備、微?；图兓瘜?shí)施例Ⅲ(a):10/1 PGTA-將264.63g乙交酯(Purac生化，Arkelsedijk，荷蘭)和34.22g L-酒石酸酯(Riedel de-Haen,Seelze,德國(guó))加入到500ml玻璃反應(yīng)器中。將酒石酸酯通過(guò)Abderhalden裝置(Aldrich,St.Louis,MO)中的硅膠(Fisher Scientific,Loughborough,Leics.，聯(lián)合國(guó))進(jìn)一步干燥。將反應(yīng)器浸在約40℃的油浴器中，并置于真空(0.04mbar)約30分鐘。然后降低浴器，將其溫度升至約110℃。一旦達(dá)到此溫度，則將反應(yīng)器置于無(wú)氧氮?dú)庵?，再浸漬。用Heidolph攪拌器(Heidolph Elektro GmbH,kelheim，德國(guó))以約100rpm的速度攪拌反應(yīng)器中的內(nèi)容物。反應(yīng)器中的內(nèi)容物熔化后，立即加入(化學(xué)計(jì)量比50 ppm)1.14ml的0.1M 2-乙基己酸亞錫(Sigma,St.Louis Missouri，美國(guó))的甲苯(Ruedel de-Haen,Seelze，德國(guó))溶液。通過(guò)一種液氮阱再使用真空約30秒，以去除甲苯、但不會(huì)明顯去除單體。在將油浴溫度升至至約120℃、保持5分鐘。然后進(jìn)一步將該油浴溫度升至約150℃，然后在約100rpm的恒定機(jī)械攪拌下保持該溫度約4小時(shí)。得到標(biāo)題聚合物。
微?；饔?用Knife研磨機(jī)(IKA,Staufen，德國(guó))將實(shí)施例Ⅲ(a)的聚合物初步研碎。然后使用加壓干氮?dú)饬髟贏ljet粉碎機(jī)(FluidEngery Aljet,Plumsteadsville,Pennsyivania，美國(guó))中將它們粉碎。采用體積分布模型和200/5 cS硅油(Dow Corning,Seneffe，比利時(shí))作為分散劑，通過(guò)Malvern Mastersizer/E(Mavern,Worcs.，聯(lián)合國(guó))中的分析，得到平均顆粒直徑大小為12.42μm。
純化/鈉鹽形成-將一批50g的實(shí)施例Ⅲ(a)分散在2L的丙酮(Riedel de-Haen)中，并置于近程聲電定位器(Branson UltrasonicsBV,Soest，荷蘭)中約30分鐘。在此期間，用Ultra-turrax T25均化器(IKA,Staufen，德國(guó))以9,500rpm的速度均化該分散體。經(jīng)此超聲處理/均化步驟后，將該分散體在Sorvall離心機(jī)(Sorvall，Wilmington,Delaware，美國(guó))中以約5,000rpm的速度離心約30分鐘。去掉上清液，將離心餅再懸浮于新鮮丙酮中，重復(fù)超聲處理/均化步驟。一旦第二次離心結(jié)束，去掉上清液，將離心餅再懸浮于去離子水中。然后進(jìn)行最后一次超聲處理/均化步驟，以去除任何剩余的丙酮，并再將分散體以約5,000rpm的速度離心約30分鐘。
將離心餅再懸浮于新鮮去離子水中，監(jiān)測(cè)分散體的pH。加入足夠體積的0.2M碳酸鈉溶液以使pH升至約pH8-pH9之間。在經(jīng)Whatman1號(hào)(直徑24cm)濾紙(Whatman國(guó)際有限公司，Maidstone,Kent，聯(lián)合國(guó))真空過(guò)濾之前，將分散體攪拌約30分鐘。用去離子水進(jìn)一步?jīng)_洗濾餅、凍結(jié)、并在Edwards SuperModulyo凍干器(Edwards,Crawley,WestSussex，聯(lián)合國(guó))中凍干。
用加熱速度為約10℃/分鐘的TA DSC912S(TA儀器，New Castle,Delaware，美國(guó))、通過(guò)差示掃描量熱法(DSC)監(jiān)測(cè)純化過(guò)程。所得到的DSC溫譜差熱圖沒(méi)有出現(xiàn)單體乙交酯的任何吸熱峰、但在181℃出現(xiàn)吸熱。
實(shí)施例Ⅲ(b):15/1 PGTA-按實(shí)施例Ⅰ(c)所述的方法合成標(biāo)題聚合物，但使用的是乙交酯(2.586mole,300g)、無(wú)水酒石酸酯(0.172mole,26.8g)和辛酸亞錫(0.2M的甲苯溶液，862ml,0.172mmole)。差示掃描量熱法用于測(cè)定聚合物的熔化溫度(Tm=204℃)。
用Wiley碾磨機(jī)將固體聚合物粉碎得到平均顆粒直徑約125μm。用具有加壓干氮?dú)獾膰娚涫侥肽C(jī)進(jìn)一步將顆粒大小減至直徑約為5-10μm。用丙酮沖洗所得到的微顆粒以去除微量單體和低分子量低聚物。然后將產(chǎn)品在減壓下于約40℃干燥、直至使用。用粒度分析儀測(cè)定干微顆粒的平均直徑。
實(shí)施例Ⅳ基于聚乙交酯的微顆粒陰離子交換劑(AE-1)的制備分兩步完成陰離子交換劑的制備。首先，按實(shí)施例Ⅰ(c)所述的類(lèi)似方法制備低分子量聚乙交酯，但使用的是下列聚合原料乙交酯(1mole,116g)、作為引發(fā)劑的l,3-丙二醇(30mole,2.22g)和辛酸亞錫(0.03mmole)。然后還按實(shí)施例Ⅰ(c)所述的方法降低聚合物的大小和純化聚合物。第二步，在氬氣存在下、將非離子微顆粒置于已知濃度的二胺如己二胺的二惡烷熱稀釋溶液(約80℃)中培養(yǎng)。通過(guò)酸量滴定法測(cè)定二惡烷中的二胺濃度。當(dāng)反應(yīng)實(shí)際上停止時(shí)，通過(guò)過(guò)濾來(lái)分離酰胺化微顆粒，并用二惡烷沖洗，并在減壓下干燥。通過(guò)以下測(cè)定陰離子交換劑(酰胺化顆粒)的結(jié)合容量(1)氮的元素分析和(2)通過(guò)用HPLC測(cè)定從稀釋溶液中去除藥物的程度而決定的與萘普生結(jié)合的程度。后者可通過(guò)具有已知濃度的氫氧化鈉稀釋溶液的固定萘普生的釋放來(lái)證實(shí)。
實(shí)施例Ⅴ用作包裹材料的以丙二醇起始的聚(丙交酯共乙交酯)共聚物(PLGPD)的制備實(shí)施例Ⅴ(a):75/25 P(1)LGPD-將235.01g 1-丙交酯(Purac生化，Arkelsedijk，荷蘭)、63.09g乙交酯(Purac生化，Arkelsedijk,荷蘭)和1.90g丙二醇(Riedel de-haen,Seelze，德國(guó))加入到500ml玻璃反應(yīng)器中，然后加入(化學(xué)計(jì)量比200ppm)3.96ml的0.1M 2-乙基己酸亞錫(Sigma,St.Louis Missouri，美國(guó))的甲苯(Riedel de-Haen,Seelze，德國(guó))溶液。在真空中干燥約1小時(shí)以去除甲苯之后，將反應(yīng)器置于無(wú)氧的氮?dú)庵胁⒔诩s160℃的預(yù)熱油浴器中。用Heidolph攪拌器(Heidolph Elektro GmbH,kelheim，德國(guó))以約100rpm的速度攪拌反應(yīng)器的內(nèi)容物。一旦反應(yīng)器中的內(nèi)容物熔化后，將溫度升至約180℃，并保持該溫度約3小時(shí)。得到一種非晶態(tài)共聚物。采用Wyatt Minidawn光散射檢測(cè)器(Wyatt技術(shù)公司，Santa Barbara，加利福尼亞，美國(guó))上的光散射檢測(cè)，通過(guò)Waters510泵、Waters410差示折光計(jì)(Waters,Milford,Massachusetts，美國(guó))上的凝膠滲透色譜(GPC)，發(fā)現(xiàn)該共聚物的分子量(MW)為約12,5000g/mol。
實(shí)施例Ⅴ(b):90/10 P(l)LGPD-按實(shí)施例Ⅴ(a)所述的方法合成標(biāo)題產(chǎn)品，但使用的是274.31g 1-丙交酯、24.55g乙交酯、1.14g丙二醇和3.89ml的0.1M 2-乙基己酸亞錫的甲苯溶液(化學(xué)計(jì)量比200ppm)。得到結(jié)晶共聚物。通過(guò)GPC發(fā)現(xiàn)該共聚物的分子量為約20,780g/mol。
實(shí)施例Ⅴ(c):90/10 P(d.I)LGPD-按實(shí)施例Ⅴ(a)所述的方法合成標(biāo)題產(chǎn)品，但使用的是274.31g d,l-丙交酯、24.55g乙交酯、1.14g丙二醇和3.86ml的0.1M 2-乙基己酸亞錫的甲苯溶液(化學(xué)計(jì)量比200ppm)。得到非晶態(tài)共聚物。通過(guò)GPC發(fā)現(xiàn)該共聚物的分子量為約20,650g/mol。
實(shí)施例Ⅴ(d)用作包裹材料r以丙二醇起始的聚(l-丙交酯共d,l-乙交酯)共聚物(PLGPD),80/20 P(l)L(d,l)LPD按實(shí)施例Ⅴ(a)所述的方法合成標(biāo)題產(chǎn)品，但加入(化學(xué)計(jì)量比200ppm)的是239.09g l-丙交酯、59.77g d,l-丙交酯(Purac生化，Arkelsedijk，荷蘭)、1.14g丙二醇和3.96ml的0.1M 2-乙基己酸亞錫的甲苯溶液。得到非晶態(tài)共聚物。通過(guò)GPC發(fā)現(xiàn)該共聚物的分子量(Mw)為22,320g/mol。通過(guò)DSC在48℃出現(xiàn)玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變。
純化-在與循環(huán)浴器相連的6L套層反應(yīng)器中，通過(guò)30％(W/W)的乙腈(Labscan,Dublin，愛(ài)爾蘭)溶液以8ml/分鐘的速度在冷卻至約2℃的去離子水中霧化，來(lái)分別沖洗實(shí)施例Ⅴ(a)、Ⅴ(b)和Ⅴ(c)的共聚物，并用用Heidolph攪拌器(Heidolph Elektro GmbH,kelheim，德國(guó))以約350rpm的速度攪拌。用Masterflex泵(Cole Parmer儀器公司，Niles,Illionois，美國(guó))將該溶液注入Vibra-Cell VC50霧化噴嘴(Bioblock,Illkirch，法國(guó))中，并使用12kHz的超聲頻率實(shí)現(xiàn)霧化。通過(guò)Whatman 1號(hào)(直徑24cm)濾紙(Whatman國(guó)際有限公司，Maidstone,Kent，聯(lián)合國(guó))過(guò)濾該分散體，再用去離子水沖洗濾餅，將其凍結(jié)并在Edwards SuperModulyo凍干器(Edwards,Crawley,West Sussex，聯(lián)合國(guó))中凍干。
用加熱速度為10℃/分鐘的TA DSC912s(TA儀器，New Castle,Delaware，美國(guó))，通過(guò)DSC測(cè)定純度，結(jié)果顯示了實(shí)施例Ⅴ(a)、Ⅴ(b)、Ⅴ(c)和Ⅴ(d)分別在44℃、49℃、45℃和48℃的玻璃化轉(zhuǎn)變(Tg)。
實(shí)施例Ⅵ載肽陽(yáng)離子交換劑的制備實(shí)施例Ⅵ(a)載有A肽(p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2，一種LHRH類(lèi)似物)-將實(shí)施例Ⅰ(a)、Ⅰ(b)、Ⅰ(c)和Ⅱ(a)的每一種鈉鹽4g分別分散在含1.33g溶解在70ml去離子水中的無(wú)堿A肽(Kinerton有限公司，Dublin，愛(ài)爾蘭)的溶液中。在經(jīng)直徑9cm的Whatman1號(hào)濾紙(Whatman國(guó)際有限公司，Maidstone,Kent，聯(lián)合國(guó))過(guò)濾之前，將分散體在室溫培養(yǎng)并同時(shí)攪拌約2小時(shí)。用去離子水進(jìn)-步?jīng)_洗濾餅，將其凍結(jié)，并在Edwards SuperModulyo凍干器(Edwards,Crawley,WestSussex，聯(lián)合國(guó))中凍干。然后通過(guò)元素分析來(lái)分析樣本中的氮，從而測(cè)定被結(jié)合的A肽的數(shù)量。得到以下結(jié)果
實(shí)施例Ⅵ(b)載有B肽(H-β-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2，兩個(gè)Cys通過(guò)二硫鍵連接，一種抑生長(zhǎng)素類(lèi)似物)-按實(shí)施例Ⅵ(b)所述的方法，使用實(shí)施例Ⅰ(a)、Ⅰ(b)、Ⅰ(c)和Ⅱ(a)的每一種鈉鹽4g、以及1.33 g無(wú)堿B肽(Kinerton有限公司，Dublin，愛(ài)爾蘭)。得到實(shí)施例Ⅰ(a)、Ⅰ(b)、Ⅰ(c)和Ⅱ(a)的固定有B肽的結(jié)合微顆粒。通過(guò)元素分析來(lái)分析樣本中的氮含量，從而測(cè)定被結(jié)合的B肽的數(shù)量。所得結(jié)果如下所示
實(shí)施例Ⅶ通過(guò)霧化作用制備載多肽的包裹陽(yáng)離子交換劑將載多肽陽(yáng)離子交換劑分散于包裹共聚物的乙腈(Labscan,Dublin，愛(ài)爾蘭)溶液中，如下所述。通過(guò)用U1tra-turrax T25均化器(IKA,Staufen，德國(guó))以約9,500rpm的速度均化約5分鐘來(lái)完成分散。包裹共聚物/乙腈溶液的濃度范圍為12.5％-25％(W/W)，包裹共聚物與載多肽陽(yáng)離子交換劑的重量比為1∶1至1.3∶1。
分散后，用陶瓷活塞泵(FMI,Oyster Bay，紐約，美國(guó))將該分散體注入超聲頻率為16kHz、流速為2ml/分鐘的Vibra-Cell VC50霧化噴嘴(Bioblock,Illkirch，法國(guó))中。當(dāng)達(dá)到該噴嘴時(shí)，通過(guò)加入干冰球(A.I.G.,Dublin，愛(ài)爾蘭)使分散體在冷卻至約-80℃的異丙醇(IPA)(Labscan,Dublin，愛(ài)爾蘭)中霧化。IPA用作收集非溶劑，用Heidolph攪拌器(Heidolph Elektro GmbH,kelheim，德國(guó))以約300rpm的速度攪拌。一旦霧化結(jié)束，將全部分散體熔化，直至溫度為約10℃至約室溫。然后通過(guò)Whatman 1號(hào)濾紙(Whatman國(guó)際有限公司，Maidstone,Kent，聯(lián)合國(guó))真空過(guò)濾來(lái)收集包裹的微顆粒。用去離子水沖洗濾餅，將其凍結(jié)，并在Edwards SuperModulyo凍干器(Edwards,Crawley,West Sussex,聯(lián)合國(guó))中凍干。用吐溫20的1％水溶液作為分散劑、使用MalvernMastersizer/E(Mavern,Worcs.，聯(lián)合國(guó))分析所得到的包裹微顆粒的大小。通過(guò)元素分析法分析包裹微顆粒中的氮含量，從而測(cè)定肽含量。
下表表示所進(jìn)行的各種包裹實(shí)驗(yàn)
在進(jìn)行體內(nèi)和/體外試驗(yàn)前將所有樣品經(jīng)180μm篩子(Bioblock,Illkirch，法國(guó))篩分。
可以通過(guò)下列方法在體外對(duì)結(jié)合微顆?；虬㈩w粒進(jìn)行試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)結(jié)合肽或結(jié)合蛋白質(zhì)的釋放速率。將重約50mg的等分結(jié)合微顆?；虬㈩w粒置于連續(xù)的流動(dòng)池系統(tǒng)中，于pH約7.2和約37℃下的緩沖磷酸鹽溶液以約45ml/小時(shí)的速度流經(jīng)整個(gè)結(jié)合微顆粒或包裹微顆粒。在約4℃收集含被釋放藥物的緩沖掖樣品，間隔一天或兩天時(shí)分析肽或蛋白質(zhì)的濃度。過(guò)兩周后，測(cè)定每個(gè)微顆粒的釋放分布圖?？梢酝ㄟ^(guò)下列方法在體內(nèi)系統(tǒng)對(duì)結(jié)合微顆粒或包裹微顆粒進(jìn)行試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)結(jié)合肽或結(jié)合蛋白質(zhì)的釋放速率。將樣品通過(guò)肌內(nèi)注射到Wistar雄性大鼠(Bioresources,Trinity大學(xué)，Dublin，愛(ài)爾蘭)的大腿，以對(duì)其給藥。懸浮液介質(zhì)含3％羧甲基纖維素和吐溫20的1％鹽水溶液。對(duì)于載A肽樣品，有效的當(dāng)量劑量為40μg/kg/天。對(duì)于載B肽樣品的該劑量為1mg/kg/天。通過(guò)心臟穿刺取出樣品，并通過(guò)對(duì)A肽和B肽有特異性的放射免疫測(cè)定法(RIA)來(lái)監(jiān)測(cè)血漿肽水平。在載A肽樣品(A肽為一種LHRH類(lèi)似物)中，睪酮RIA也可用于監(jiān)測(cè)睪酮抑制。作為懸浮介質(zhì)的替代，某些情況下可使用膠凝劑。結(jié)果如下表A和表B所示。
表A
表B
實(shí)施例Ⅷ實(shí)施例Ⅷ(a)用乙腈作為溶劑和室溫IPA作為非溶劑時(shí)的霧化作用將約1.06g實(shí)施例Ⅰ(c)的陽(yáng)離子交換劑(未與多肽結(jié)合)分散于實(shí)施例Ⅴ(a)的包裹共聚物的25.24％(W/W)乙腈(Labscan,Dublin，愛(ài)爾蘭)溶液中，以使陽(yáng)離子交換劑與包裹共聚物的重量比為約1.03∶1。通過(guò)用Ultra-turrax T25(IKA,Staufen，德國(guó))以約9,500rpm的速度均化約5分鐘而完成此分散。
分散后，用陶瓷活塞泵(FMI,Oyster Bay，紐約，美國(guó))將該分散體注入超聲頻率為16kHz、流速為2ml/分鐘的Vibra-Cell V.C50霧化噴嘴(Bioblock,Illkirch，法國(guó))中。當(dāng)達(dá)到該噴嘴時(shí)，使分散體于室溫(17-22℃)的異丙醇(IPA)(Labscan,Dublin，愛(ài)爾蘭)中霧化。該IPA用作收集非溶劑，用Heidolph攪拌器(Heidolph Elektro GmbH,kelheim，德國(guó))以約300rpm的速度攪拌。一旦霧化結(jié)束，將分散體于室溫再攪拌約60分鐘，然后通過(guò)Whatman 1號(hào)濾紙(Whatman國(guó)際有限公司，Maidstone,Kent，聯(lián)合國(guó))真空過(guò)濾來(lái)回收被包裹的顆粒。用去離子水沖洗濾餅，將其凍結(jié)，并在Edwards SuperModulyo凍干器(Edwards,Crawley,West Sussex，聯(lián)合國(guó))中凍干。用吐溫20的1％水溶液作為分散劑、使用Malvern Mastersizer/E(Mavern,Worcs.，聯(lián)合國(guó))分析所得到的顆粒的大小。所得到的顆粒的平均顆粒大小(d(0.5))為84.75μm。
實(shí)施例Ⅷ(b)用乙酸乙酯作為溶劑和室溫下的IPA作為非溶劑時(shí)的霧化作用基本上根據(jù)實(shí)施例Ⅷ(a)所述的方法進(jìn)行霧化，但用約0.99g實(shí)施例Ⅰ(c)的陽(yáng)離子交換劑(未與多肽結(jié)合)分散于實(shí)施例Ⅴ(a)的包裹共聚物的24.88％(W/W)乙酸乙酯(Riedel-de Haen,Seelze，德國(guó))溶液中，以使陽(yáng)離子交換劑與包裹共聚物的重量比為約0.96∶1。所得到的顆粒的平均顆粒大小(d(0.5))為100.56μm。
實(shí)施例Ⅷ(c)使用乙酸乙酯作為溶劑和高頻率探測(cè)劑的霧化作用用約1.02g實(shí)施例Ⅰ(c)的陽(yáng)離子交換劑(未與多肽結(jié)合)分散于實(shí)施例Ⅴ(a)的包裹共聚物的15.14％(W/W)乙酸乙酯(Riedel-de Haen)溶液中，以使陽(yáng)離子交換劑與包裹共聚物的重量比為約1.05∶1。通過(guò)用Ultra-turrax T25(IKA,Staufen，德國(guó))以約9,500rpm的速度均化約5分鐘來(lái)完成此分散。
分散后，用陶瓷活塞泵(FMI,Oyster Bay，紐約，美國(guó))將該分散體注入超聲頻率為約34.6kHz、流速為5ml/分鐘的Martin Walter 400GSIP霧化器(Sodeva,Le Bouget du Lac，法國(guó))中。當(dāng)達(dá)到噴嘴時(shí)，通過(guò)加入干冰球(A.I.G.,Dublin，愛(ài)爾蘭)使分散體在冷卻至約-77℃的異丙醇(IPA)(Labscan,Dublin，愛(ài)爾蘭)中霧化。該IPA用作收集非溶劑，用Heidolph攪拌器(Heidolph Elektro GmbH,kelheim，德國(guó))以300rpm的速度攪拌。一旦霧化結(jié)束，通過(guò)Whatman 1號(hào)濾紙(Whatman國(guó)際有限公司，Maidstone,Kent，聯(lián)合國(guó))真空過(guò)濾來(lái)回收被包裹的顆粒。用去離子水沖洗該濾餅，將其凍結(jié)，并在Edwards SuperModulyo凍干器(Edwards,Crawley,West Sussex，聯(lián)合國(guó))中凍干。用吐溫20的1％水溶液作為分散劑，通過(guò)Malvern Mastersizer/E(Mavern,Worcs.，聯(lián)合國(guó))分析所得到的顆粒的大小。所得到的顆粒的平均顆粒大小(d(0.5))為95.69μm。
實(shí)施例Ⅸ與陽(yáng)離子交換劑的結(jié)合和抑生長(zhǎng)素類(lèi)似物C肽和D肽的隨后的包裹實(shí)施例Ⅸ(a)載有C肽將約1.01g分散于含0.25g無(wú)堿C肽的溶液中的實(shí)施例Ⅰ(c)的鈉鹽溶解在40ml去離子水中，上述C肽的結(jié)構(gòu)為N-羥乙基哌嗪基-乙?；?D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2，其中兩個(gè)Cys殘余物通過(guò)二硫鍵連接(Kinerton有限公司，Dublin，愛(ài)爾蘭)。將該分散體溫育，再攪拌約2小時(shí)，然后通過(guò)直徑為9cm的Whatman 1號(hào)濾紙(Whatman國(guó)際有限公司，Maidstone,Kent，聯(lián)合國(guó))過(guò)濾。用去離子水進(jìn)一步?jīng)_洗該濾餅，將其凍結(jié)，并在Edwards SuperModulyo凍干器(Edwards,Crawley,West Sussex，聯(lián)合國(guó))中凍干。然后對(duì)樣品進(jìn)行氮的分析以，測(cè)定肽的結(jié)合量，其為20.21％。
實(shí)施例Ⅸ(b)載有D肽采用實(shí)施例Ⅸ(a)的方法，但將分散于含0.51g無(wú)堿D肽的溶液中的實(shí)施例Ⅰ(c)的約2.04g鈉鹽溶解在80ml去離子水中，上述D肽的結(jié)構(gòu)為N-羥乙基哌嗪基-乙磺?；?Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2，其中兩個(gè)Cys殘余物通過(guò)二硫鍵連接(Kinerton有限公司，Dublin，愛(ài)爾蘭)。然后對(duì)樣品進(jìn)行氮的分析以測(cè)定肽的結(jié)合量，其為19.53％。
實(shí)施例Ⅹ按實(shí)施例Ⅶ所述的方法包裹實(shí)施例Ⅸ(a)和Ⅸ(b)的結(jié)合微顆粒，得到下列結(jié)果
實(shí)施例Ⅺ膠凝劑制劑的制備使用微型機(jī)械混合器，將實(shí)施例Ⅶ(a)的被包裹微顆粒(0.3g)與液體膠凝劑(2.0mL實(shí)施例Ⅰ的成分“A”和實(shí)施例Ⅲ的成分C的50/50混合物，這兩種成分在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,612,052中公開(kāi))在5mL注射器筒內(nèi)，以約20rpm的速度混合約10分鐘。通過(guò)干燥加熱將膠凝劑預(yù)消毒，并用已消毒的攪拌器在層流通風(fēng)櫥中進(jìn)行混合。制劑從5mL注射器(插入柱塞后)流入較小的注射器中，這就是用于給藥的制劑。用光學(xué)顯微鏡檢測(cè)制劑的均勻度。將小注射器收集儲(chǔ)存在干的口袋中、并保持4℃，直至使用。
權(quán)利要求
1．一種結(jié)合微顆粒，它包括一種可吸收雜鏈聚合物核心以及將其固定在所述的可吸收雜鏈聚合物核心上的一種或多種肽、一種或多種蛋白質(zhì)或其混合物，其中每一種肽分別選自由以下所組成的組生長(zhǎng)激素釋放肽(GHRP)、促黃體素釋放激素(LHRH)、抑生長(zhǎng)素、鈴蟾肽、胃泌素釋放肽(GRP)、降鈣素、緩激肽、galanin、促黑激素(MSH)、生長(zhǎng)激素釋放因子(GRF)、糊精、速激肽、胰泌素、甲狀旁腺素(PTH)、腦啡呔、內(nèi)皮素、降鈣素基因釋放肽(CGRP)、神經(jīng)調(diào)節(jié)肽、甲狀旁腺素相關(guān)蛋白質(zhì)(PTHrP)、胰高血糖素、神經(jīng)降壓肽、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、YY肽(PYY)、胰高血糖素釋放肽(GLP)、血管活性腸肽(VIP)、垂體腺苷酸酯環(huán)化酶活性肽(PACAP)、促胃動(dòng)素、P物質(zhì)、神經(jīng)肽Y(NPY)、促甲狀腺激素及其類(lèi)似物和片段或其藥物上可接受的鹽；和其中每一種蛋白質(zhì)分別選自由以下所組成的組生長(zhǎng)激素、促紅細(xì)胞生成素、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子和干擾素。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合微顆粒，其中所述的肽、蛋白質(zhì)、或其混合物、或其藥物上可接受的鹽占所述的結(jié)合微顆粒總量的0.1％-30％。
3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的結(jié)合微顆粒，其中所述的可吸收雜鏈聚合物核心包括甘醇酸酯單元。
4．根據(jù)權(quán)利要求3所述的結(jié)合微顆粒，其中所述的可吸收雜鏈聚合物核心進(jìn)一步包括檸檬酸酯殘余物。
5．根據(jù)權(quán)利要求4所述的結(jié)合微顆粒，其中甘醇酸酯單元與檸檬酸酯殘余物的比例約為7-1∶約20-1。
6．根據(jù)權(quán)利要求3所述的結(jié)合微顆粒，其中可吸收的聚合物核心進(jìn)一步包括酒石酸酯殘余物。
7．根據(jù)權(quán)利要求6所述的結(jié)合微顆粒，其中甘醇酸酯單元與酒石酸酯殘余物的比例約為7-1∶約20-1。
8．根據(jù)權(quán)利要求3所述的結(jié)合微顆粒，其中可吸收的雜鏈聚合物核心進(jìn)一步包括蘋(píng)果酸酯殘余物。
9．根據(jù)權(quán)利要求8所述的結(jié)合微顆粒，其中甘醇酸酯單元與蘋(píng)果酸酯殘余物的比例為約7-1∶約20-1。
10．根據(jù)權(quán)利要求3所述的結(jié)合微顆粒，其中所述的甘醇酸酯單元的末端為羧基部分。
11．根據(jù)權(quán)利要求3所述的結(jié)合微顆粒，其中所述的甘醇酸酯單元的末端為胺部分。
12．一種包裹微顆粒，它包括一種或多種包裹在可吸收包裹聚合物中的結(jié)合微顆粒，其中所述的結(jié)合微顆粒包括一種可吸收雜鏈聚合物核心以及將其固定在所述的吸收雜鏈聚合物核心上的一種或多種肽、一種或多種蛋白質(zhì)或其混合物，其中每一種肽分別選自由以下所組成的組生長(zhǎng)激素釋放肽(GHRP)、促黃體素釋放激素(LHRP)、抑生長(zhǎng)素、鈴蟾肽、胃泌素釋放肽(GRP)、降鈣素、緩激肽、galanin、促黑激素(MSH)、生長(zhǎng)激素釋放因子(GRF)、糊精、速激肽、胰泌素、甲狀旁腺素(PTH)、腦啡呔、內(nèi)皮素、降鈣素基因釋放肽(CGRP)、神經(jīng)調(diào)節(jié)肽、甲狀旁腺素相關(guān)蛋白質(zhì)(PTHrP)、胰高血糖素、神經(jīng)降壓肽、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、YY肽(PYY)、胰高血糖素釋放肽(GLP)、血管活性腸肽(VIP)、垂體腺苷酸酯環(huán)化酶環(huán)化活性肽(PACAP)、促胃動(dòng)素、P物質(zhì)、神經(jīng)肽Y(NPY)、促甲狀腺激素及其類(lèi)似物和片段或其藥物上可接受的鹽；和其中每一種蛋白質(zhì)分別選自由以下所組成的組生長(zhǎng)激素、促紅細(xì)胞生成素、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子和干擾素；且所述的可吸收雜鏈聚全物核心包括甘醇酸酯單元。
13．根據(jù)權(quán)利要求12所述的包裹微顆粒，其中所述的肽、蛋白質(zhì)、或其混合物、或其藥物上可接受的鹽占所述的結(jié)合微顆粒總量的0.1％-30％，且所述的可吸收雜鏈聚全物核心進(jìn)一步包括檸檬酸酯殘余物、酒石酸酯殘余物或蘋(píng)果酸酯殘余物。
14．根據(jù)權(quán)利要求13所述的包裹微顆粒，其中甘醇酸酯單元與檸檬酸酯殘余物、酒石酸酯殘余物或蘋(píng)果酸酯殘余物的比例為約7-1∶約20-1，且所述的甘醇酸酯單元的末端為羧基部分或胺部分。
15．根據(jù)權(quán)利要求14所述的包裹微顆粒，其中所述的可吸收的包裹聚合物包括(a)l-丙交酯基本單元和乙交酯基本單元，(b)d,l-丙交酯基本單元和乙交酯基本單元，(c)d,l-丙交酯基本單元，或(d)l-丙交酯基本單元和d,l-丙交酯基本單元。
16．根據(jù)權(quán)利要求15所述的包裹微顆粒，其中l(wèi)-丙交酯基本單元與乙交酯基本單元的比例為約75-25∶約90-10。
17．根據(jù)權(quán)利要求15所述的包裹微顆粒，其中l(wèi)-丙交酯基本單元與d,l-丙交酯基本單元的比例為約80-20。
18．根據(jù)權(quán)利要求15所述的包裹微顆粒，其中d,l-丙交酯基本單元與乙交酯基本單元的比例為約75-25∶約90-10。
19．根據(jù)權(quán)利要求14所述的包裹微顆粒，其中所述的可吸收包裹聚合物占所述的包裹微顆?？偭康?％-70％。
20．根據(jù)權(quán)利要求19所述的包裹微顆粒，其中所述的可吸收包裹聚合物占所述的包裹微顆?？偭康?0-60％。
21．根據(jù)權(quán)利要求20所述的包裹微顆粒，其中所述可吸收包裹聚合物占該包裹微顆?？偭康?0-50％。
22．一種藥物組合物，它包括權(quán)利要求1所述的結(jié)合微顆粒和藥物上可接受的載體。
23．一種藥物組合物，它包括權(quán)利要求1所述的結(jié)合微顆粒、一種非水可吸收膠凝液體聚酯和任一藥物上可接受的載體。
24．一種藥物組合物，它包括權(quán)利要求12所述的包裹微顆粒和藥物上可接受的載體。
25．一種藥物組合物，它包括權(quán)利要求12所述的包裹微顆粒、一種非水可吸收膠凝液體聚酯和任一藥物上可接受的載體。
26．根據(jù)權(quán)利要求4所述的結(jié)合微顆粒，其中肽是一種LHRH類(lèi)似物。
27．根據(jù)權(quán)利要求26所述的結(jié)合微顆粒，其中甘醇酸酯單元與可吸收雜鏈聚合物核心的檸檬酸酯殘余物的比例為約7-1∶約20-1，其中LHRH類(lèi)似物為p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2。
28．根據(jù)權(quán)利要求6所述的結(jié)合微顆粒，其中肽是一種LHRH類(lèi)似物。
29．根據(jù)權(quán)利要求28所述的結(jié)合微顆粒，其中甘醇酸酯單元與酒石酸酯殘余物的比例為約7-1∶約20-1，且LHRH類(lèi)似物為p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2。
30．根據(jù)權(quán)利要求4所述的結(jié)合微顆粒，其中肽是一種抑生長(zhǎng)素類(lèi)似物。
31．根據(jù)權(quán)利要求30所述的結(jié)合微顆粒，其中甘醇酸酯單元與檸檬酸酯殘余物的比例為約7-1∶約20-1，且抑生長(zhǎng)素類(lèi)似物為H-β-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2，其中兩個(gè)Cys殘余物通過(guò)二硫鍵連接；N-羥乙基哌嗪基-乙?；?D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2，其中兩個(gè)Cys殘余物通過(guò)二硫鍵連接；或N-羥乙基哌嗪基-乙磺?；?Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2，其中兩個(gè)Cys殘余物通過(guò)二硫鍵連接。
32．根據(jù)權(quán)利要求6所述的結(jié)合微顆粒，其中肽是一種抑生長(zhǎng)素類(lèi)似物。
33．根據(jù)權(quán)利要求32所述的結(jié)合微顆粒，其中甘醇酸酯單元與酒石酸酯殘余物的比例為約7-1∶約20-1，且抑生長(zhǎng)素類(lèi)似物為H-β-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2，其中兩個(gè)Cys殘余物通過(guò)二硫鍵連接；N-羥乙基哌嗪基-乙酰基-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2，其中兩個(gè)Cys殘余物通過(guò)二硫鍵連接；或N-羥乙基哌嗪基-乙磺?；?Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2，其中兩個(gè)Cys殘余物通過(guò)二硫鍵連接。
34．一種包裹微顆粒，它包括權(quán)利要求26所述的一種或多種包裹在可吸收包裹聚合物中的結(jié)合微顆粒，所述的可吸收包裹聚合物包括(a)l-丙交酯基本單元和乙交酯基本單元，(b)d,l-丙交酯基本單元和乙交酯基本單元，(c)d,l-丙交酯基本單元，或(d)l-丙交酯基本單元和d,l-丙交酯基本單元。
35．根據(jù)權(quán)利要求34所述的包裹微顆粒，其中甘醇酸酯單元與可吸收聚合物核心的檸檬酸酯殘余物的比例為約7-1∶約20-1,LHRH類(lèi)似物為p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2，且其中(a)l-丙交酯基本單元與乙交酯基本單元的比例為約75-25∶約90-10，(b)d,l-丙交酯基本單元與乙交酯基本單元的比例為約75-25∶約90-10，(c)l-丙交酯基本單元與d,l-丙交酯基本單元的比例為約80-20。
36．一種包裹微顆粒，它包括權(quán)利要求28所述的一種或多種包裹在可吸收包裹聚合物中的結(jié)合微顆粒，所述的可吸收包裹聚合物包括(a)l-丙交酯基本單元和乙交酯基本單元，(b)d,l-丙交酯基本單元和乙交酯基本單元，(c)d,l-丙交酯基本單元，或(d)l-丙交酯基本單元和d,l-丙交酯基本單元。
37．根據(jù)權(quán)利要求36所述的包裹微顆粒，其中甘醇酸酯單元與可吸收聚合物核心的酒石酸酯殘余物的比例為約7-1∶約20-1,LHRH類(lèi)似物為p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2，且其中(a)l-丙交酯基本單元與乙交酯基本單元的比例為約75-25∶約90-10，(b)d,l-丙交酯基本單元與乙交酯基本單元的比例為約75-25∶約90-10，和，(c)l-丙交酯基本單元與d,l-丙交酯基本單元的比例為約80-20。
38．一種包裹微顆粒，它包括權(quán)利要求30所述的一種或多種包裹在可吸收包裹聚合物中的結(jié)合微顆粒，所述的可吸收包裹聚合物包括(a)l-丙交酯基本單元和乙交酯基本單元，(b)d,l-丙交酯基本單元和乙交酯基本單元，(c)d,l-丙交酯基本單元，或(d)l-丙交酯基本單元和d,l-丙交酯基本單元。
39．根據(jù)權(quán)利要求38所述的包裹微顆粒，其中甘醇酸酯單元與可吸收聚合物核心的檸檬酸酯殘余物的比例為約7-1∶約20-1，抑生長(zhǎng)素類(lèi)似物為H-β-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2，其中兩個(gè)Cys殘余物通過(guò)二硫鍵連接；N-羥乙基哌嗪基-乙?；?D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2，其中兩個(gè)Cys殘余物通過(guò)二硫鍵連接；或N-羥乙基哌嗪基-乙磺?；?Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2，其中兩個(gè)Cys殘余物通過(guò)二硫鍵連接，且其中(a)l-丙交酯基本單元與乙交酯基本單元的比例為約75-25∶約90-10，(b)d,l-丙交酯基本單元與乙交酯基本單元的比例為約75-25∶約90-10，和(c)l-丙交酯基本單元與d,l-丙交酯基本單元的比例為約80-20。
40．一種包裹微顆粒，它包括權(quán)利要求32所述的一種或多種結(jié)合微顆粒和可吸收包裹聚合物，所述的可吸收包裹聚合物包括(a)l-丙交酯基本單元和乙交酯基本單元，(b)d,l-丙交酯基本單元和乙交酯基本單元，(c)d,l-丙交酯基本單元，或(d)l-丙交酯基本單元和d,l-丙交酯基本單元。
41．根據(jù)權(quán)利要求40所述的包裹微顆粒，其中甘醇酸酯單元與可吸收聚合物核心的酒石酸酯殘余物的比例為約7-1∶約20-1，抑生長(zhǎng)素類(lèi)似物為H-β-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2，其中兩個(gè)Cys殘余物通過(guò)二硫鍵連接；N-羥乙基哌嗪基-乙?；?D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2，其中兩個(gè)Cys殘余物通過(guò)二硫鍵連接；或N-羥乙基哌嗪基-乙磺酰基-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2，其中兩個(gè)Cys殘余物通過(guò)二硫鍵連接，且其中(a)l-丙交酯基本單元與乙交酯基本單元的比例為約75-25∶約90-10，(b)d,l-丙交酯基本單元與乙交酯基本單元的比例為約75-25∶約90-10，和(c)l-丙交酯基本單元與d,l-丙交酯基本單元的比例為約80-20。
42．一種用于制備權(quán)利要求12所述的包裹微顆粒的方法，其包括用可吸收包裹聚合物包裹結(jié)合微顆粒的步驟。
43．根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述的結(jié)合微顆粒在溶液中的分散包括將所述的可吸收包裹聚合物和一種溶劑滴在預(yù)冷卻的介質(zhì)上，所說(shuō)的介質(zhì)不是所述可吸收包裹聚合物的溶劑。
44．根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中可吸收包裹聚合物的溶液包含約5％至30％可吸收包裹聚合物，預(yù)冷卻介質(zhì)是具有兩個(gè)或更多碳原子的醇，且介質(zhì)的溫度為室溫至約-80℃。
45．根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中預(yù)冷卻介質(zhì)的溫度為約-60℃--80℃，且介質(zhì)為異丙醇。
46．一種制備權(quán)利要求12所述的包裹微顆粒的方法，它包括采用乳化技術(shù)、用可吸收包裹聚合物包裹結(jié)合微顆粒的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種持續(xù)釋放配合物,該配合物含有固定在一種可選擇地具有可吸收聚合物包被的可吸收聚合物微顆粒上的一種或多種肽、一種或多種蛋白質(zhì)或其組合物。本發(fā)明的微顆粒配合物包括:肽(類(lèi))和/或蛋白質(zhì)(類(lèi)),其每個(gè)分子至少具有一個(gè)氨基和/或至少一個(gè)羧基;一種可吸收的聚酯固體微顆粒,其具有足量的、可結(jié)合肽(類(lèi))和/或蛋白質(zhì)(類(lèi))的表面和次表面的羧基或氨基,以使固定化肽(類(lèi))或蛋白質(zhì)(類(lèi))占微顆粒配合物總量的0.1%—30%。這種具有固定化肽(類(lèi))和/或蛋白質(zhì)(類(lèi))的微顆粒配合物還可以進(jìn)一步用可吸收聚合物進(jìn)行單個(gè)包裹或按組包裹,以便進(jìn)一步控制固定化肽(類(lèi))和/或蛋白質(zhì)(類(lèi))的釋放。為了進(jìn)一步控制固定化肽(類(lèi))和/或蛋白質(zhì)(類(lèi))的釋放,將所述的包裹微顆粒加入到具有可吸收膠凝液體的組合物中,所述的可吸收膠凝液體在生物環(huán)境中與水接觸后能轉(zhuǎn)化成柔性凝膠或半固體物。
文檔編號(hào)A61K47/36GK1289256SQ99802517
公開(kāi)日2001年3月28日 申請(qǐng)日期1999年1月20日 優(yōu)先權(quán)日1998年1月29日
發(fā)明者薛勒比·沃赫拜·薛勒比 申請(qǐng)人:波利曼德有限公司