專利名稱：用于治療急性血栓疾病的地龍溶栓酶針劑及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于治療急性血栓疾病的地龍溶栓酶針劑及制備方法。
血栓性疾病如腦血栓、心肌梗塞、血栓性靜脈炎以及冠心病是對(duì)人類危害極大的疾病，發(fā)病率及死亡率都很高，目前，臨床上主要采用溶栓藥物治療，西藥如尿激素、鏈激酶、組織型纖維酶原激活劑以及蝮蛇抗栓酶，這些藥物有的治療效果較差，復(fù)通率低，再栓率高；有的對(duì)富血小板血栓或富纖維蛋白血栓溶栓作用不很明顯，也有的易產(chǎn)生出血副作用，有的藥物原料來源困難，制備工藝復(fù)雜，價(jià)格昂貴；中藥如用有纖維活性的地龍粗提物制成的口服制劑，但該制劑起效慢。
本發(fā)明的目的正是為了克服上述已有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足而提供一種以地龍粉為原料的經(jīng)過提取將具有溶栓活性的組分制成靜脈注射針劑的用于治療急性血栓疾病的地龍溶栓酶針劑，從而可大大提高藥效，提高治愈率。
本發(fā)明還涉及該針劑的制備方法。
本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)∶用于治療急性血栓性疾病的地龍溶栓酶針劑，其特征在于該針劑含有分子量為1.0-3.0萬或2.5-4.0萬或3.5-5.0萬，等電點(diǎn)為3.6-4.4的地龍溶栓酶，每針劑2ml注射水含量為2-5mg。
地龍溶栓酶針劑制備方法，其特征在于它按下步驟進(jìn)行a)將地龍粉用PH=4-10的0.02M緩沖液進(jìn)行攪拌溶解，其重量濃度為5-20％，經(jīng)離心分離取上清，用硫酸銨進(jìn)行初級(jí)沉淀，其最終飽和度為20-30％，離心分離取上清，再用硫酸銨進(jìn)行二級(jí)沉淀，其最終飽和度為40-70％，離心取沉淀，用水溶解沉淀，在PH=4-10的緩沖液中充分透析除去硫酸銨，得到粗級(jí)混合地龍溶栓酶溶液；
b)再將(a)項(xiàng)粗級(jí)混合，地龍溶栓酶溶液，用陰離子交換劑交換，進(jìn)樣前，用PH=4-10的0.02M緩沖液平衡交換劑，進(jìn)樣吸附后，用前述緩沖液淋洗后，再用含氯化鈉的前述緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集三種具有溶栓活性的地龍溶栓酶峰液，得到用于提取分子量分別為1.0-3.0萬、2.5-4.0萬、3.5-5.0萬三種地龍溶栓酶粗級(jí)產(chǎn)品，依次命名為FⅠ、FⅡ、FⅢ。
c)將b)項(xiàng)的FⅠ、FⅡ、FⅢ分別進(jìn)行超濾濃縮，濃縮比為5∶1-20∶1的體積；d)再將濃縮后的FⅠ、FⅡ、FⅢ分別用疏水層析劑進(jìn)行疏水層析，進(jìn)樣前，用含硫酸銨的PH=4的0.02M緩沖液平衡層析劑，進(jìn)樣后，用前述平衡緩沖液淋洗后，再用含硫酸銨的PH=4-10的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，分別收集具有溶栓活性的地龍溶栓酶峰液，得到FⅠ、FⅡ、FⅢ的純化產(chǎn)品；e)再將(d)項(xiàng)三種純化產(chǎn)品分別進(jìn)行超濾、濃縮，濃縮比30∶1-50∶1，用分子篩過濾層析，進(jìn)樣前，用PH=6-8的0.2M緩沖液平衡，層析劑，進(jìn)樣后，用上述緩沖液淋洗，分別收集具有溶栓活性的地龍溶栓酶峰液，得到進(jìn)一步純化的FⅠ、FⅡ、FⅢ產(chǎn)品。
f)最后將(e)項(xiàng)中三種地龍溶栓酶液分別用親和層析劑進(jìn)行親和層析，進(jìn)樣前用PH=6-9的0.02M緩沖液平衡親和層析劑，進(jìn)樣吸附后，用上述緩沖液淋洗后，改用PH=4-10的0.1M-1M的精氨酸溶液洗脫，分別收集具有溶栓活性的組份，分別透析，除菌過濾，最終制成分子量為1.5-3.0萬、3.5-4.0萬、3.5-5.0萬的三種液體。
也可將地龍溶栓酶液體，用凍干方法制成干粉，再按每針劑2.5mg裝瓶；緩沖液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、三羥甲基胺基甲烷-鹽酸、醋酸-醋酸鈉緩沖劑；陰離子交換劑為DEAE Sepharose FastFlow、DEAE Sephacel、QSepharose Fast Flow；疏水層析劑為Phenyl-Sepharose 6 Fast Folw(low Sub),Phenyl-Sepharose 6Fast Folw(high Sub),Octyl-Sepharose Fast Flow；分子篩過濾層析劑為Sephadex G-75,Sephacryl S-200；親和層析劑為Benzamide-Sepharose；離子交換的線性梯度洗脫為梯度洗脫時(shí)間為0.5-10小時(shí)，氯化鈉濃度由0M線性遞增至0.5M；疏水層析的線性梯度洗脫為梯度洗脫時(shí)間為0.5-5小時(shí)，硫酸銨濃度由1.5M線性遞減至0M。
本發(fā)明所使用的離子交換劑、疏水層析劑、分子篩層析劑、親和層析劑均由瑞典Pharmacia公司生產(chǎn)。
本發(fā)明的藥物進(jìn)行了毒理及藥效實(shí)驗(yàn)觀察，其結(jié)果如下a)主要藥效實(shí)驗(yàn)1)實(shí)驗(yàn)性腦血栓模型的建立方法地鼠麻醉后，揭去頭蓋骨，暴露腦膜，股靜脈注射腺血卟啉后，激光照射腦血管形成血栓后，股靜脈給藥，觀察溶栓起效時(shí)間和效果。血栓形成、血栓溶解過程可用錄像觀察。
2)用地鼠40只，分實(shí)驗(yàn)組(20只)和對(duì)照組(20只)，按上述方法建立腦血栓模型后，實(shí)驗(yàn)組股靜脈滴注本發(fā)明中的地龍溶栓酶，劑量為2-10mg/kg體重，對(duì)照組股靜脈滴注尿激酶或重組鏈激酶，觀察溶栓效果。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組給藥0.5小時(shí)后，血栓開始出現(xiàn)溶解，1-2小時(shí)，血流再通，有1只(5％)出現(xiàn)出血現(xiàn)象。而對(duì)照組有4只(20％)地鼠溶栓的同時(shí)伴有出血現(xiàn)象。顯示出按本發(fā)明方法制備的地龍溶栓酶在地鼠體內(nèi)具有溶血栓的作用。
3)對(duì)大鼠體內(nèi)凝血系統(tǒng)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠尾靜脈注射本發(fā)明的地龍溶栓酶后，對(duì)血小板聚集有抑制作用并能增強(qiáng)體內(nèi)纖溶活性，表現(xiàn)為優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間(EIT)縮短，血清纖維蛋白的裂解物(FDPS)升高和血漿纖維蛋白原含量降低，提示按本發(fā)明方法制備的地龍溶栓酶在地鼠體內(nèi)具有良好的抗栓作用。
b)毒理實(shí)驗(yàn)急性毒性實(shí)驗(yàn)，分實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組尾靜脈注射本發(fā)明的地龍溶栓酶，對(duì)照組尾靜脈注射生理鹽水，結(jié)果表明該地龍溶栓酶LD50為85mg/Kg體重。這說明該地龍溶栓酶具有較好的安全性。
c)質(zhì)量檢測(cè)為確保該地龍溶栓酶的質(zhì)量，建立了與療效密切相關(guān)的質(zhì)控指標(biāo)。
1)地龍溶栓酶體外溶栓活性測(cè)定
按照衛(wèi)生部制定頒發(fā)的尿激酶瓊脂糖-纖維蛋白平板法。本發(fā)明制備的地龍溶栓酶比活為每毫克相當(dāng)于1000-5000尿激酶單位。
2)地龍溶栓酶的純度及含量測(cè)定采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，本發(fā)明方法制備的三個(gè)地龍溶栓酶在SDS-PAGE均主要表現(xiàn)為均一的條帶，采用薄層掃描進(jìn)行定量，純度達(dá)90％以上。三個(gè)地龍溶栓酶的分子量分別為1-3萬、2.5-4.0萬、3.5-5.0萬，等電點(diǎn)為3.6-4.4。
3)微生物與熱源的測(cè)定按照中華人民共和國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，經(jīng)檢測(cè)無微生物及熱源。
本發(fā)明與已有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)及效果a)本發(fā)明的藥物制備方法采用中藥西制，得到三個(gè)有效地龍溶栓酶成分在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳上主要表現(xiàn)為均一的條帶，薄層掃描純度達(dá)90％以上，可直接靜脈注射，充分發(fā)揮地龍溶栓酶的溶栓效果；b)原料來源廣，制備方法簡(jiǎn)單，成本低；c)溶栓效果好，毒副作用小，尤其對(duì)急性血栓疾病治療效果更為明顯。
實(shí)施例l取10g地龍粉與PH=4的0.02M醋酸-醋酸鈉緩沖液進(jìn)行攪拌溶解，經(jīng)離心分離取上清，用硫酸銨進(jìn)行初級(jí)沉淀，其最終飽和度為20％，再用硫酸銨進(jìn)行二級(jí)沉淀，其最終飽和度為40％，離心取沉淀，用水溶解沉淀，在PH=4的上述緩沖液中充分透析除硫酸銨，得到粗級(jí)混合地龍溶栓酶溶液，然后用瑞典進(jìn)口的DEAE Sephrose Fast Tlow陰離子交換劑進(jìn)行離子交換，在進(jìn)樣前用PH=4的0.02M前述緩沖液平衡交換劑，進(jìn)樣吸附后，用前述緩沖劑洗滌5個(gè)柱床體積后，再用含氯化鈉的前述緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，梯度洗脫時(shí)間0.5小時(shí)，氯化鈉濃度由0M線性遞增至0.5M收集三種具有活性的地龍溶栓酶峰液.得到用于提取分子量分別為1.0-3.0萬、2.5-4.0萬、3.5-5.0萬的三種地龍溶栓酶粗級(jí)產(chǎn)品依次命名為FⅠ、FⅡ、FⅢ，再將上述三種產(chǎn)品分別進(jìn)行超濾濃縮，濃縮比為5∶1的體積后，再分別用Phenyl-Sepharase 6 FastFlow(low sub)疏水層析劑進(jìn)行疏水層析，進(jìn)樣前用含硫酸銨的PH=4的0.02M的緩沖液平衡層析劑，進(jìn)樣后，用前述平衡緩沖液洗滌5個(gè)柱床體積后，用含硫酸銨的PH=4的0.02M前述緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，梯度洗脫時(shí)間0.5小時(shí)，硫酸銨濃度由1.5M線性遞減至0M，收集具有溶栓活性的地龍溶栓酶峰液，分別得到FⅠ、FⅡ、FⅢ的純化產(chǎn)品，再將上述純化產(chǎn)品超濾濃縮，濃縮比為30∶1后，用分子篩過濾層析，分子篩過濾層析劑為Sephadex G-75，進(jìn)樣前，用PH=6的0.02M磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液平衡層析劑，進(jìn)樣后，用上述緩沖液淋洗，分別收集具有溶栓活性的地龍溶栓酶峰液，得到進(jìn)一步純化的FⅠ、FⅡ、FⅢ產(chǎn)品，最后再將上述產(chǎn)品分別用親和層析劑Benzamide-sepharose進(jìn)行親和層析，進(jìn)樣前用PH=6的0.02M磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液平衡親和層析劑，進(jìn)樣吸附后，用上述緩沖液淋洗后，改用PH=4的0.1M精氨酸溶液洗脫，分別收集具有溶栓性的組份，分別透析，除菌，過濾，分裝，最后制成液體針劑，每2ml注射水含量為2mg。
實(shí)施例2取10g地龍粉與PH=6的0.02M磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液進(jìn)行攪拌溶解，經(jīng)離心分離取上清，用硫酸銨進(jìn)行初級(jí)沉淀，其最終飽和度為25％，再用硫酸銨進(jìn)行二級(jí)沉淀，其最終飽和度為55％，離心取沉淀，用水溶解沉淀，在PH=6的0.02M上述緩沖液中充分透析除硫酸銨，得到粗級(jí)混合地龍溶栓酶溶液，然后用瑞典進(jìn)口的DEAE Sephacel陰離子交換劑進(jìn)行離子交換，在進(jìn)樣前用PH=6的0.02M上述緩沖液平衡交換劑，進(jìn)樣吸附后上述緩沖液洗滌5個(gè)柱床體積后再用含氯化鈉上述緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，梯度洗脫時(shí)間6小時(shí)，氯化鈉濃度由0M線性遞增0.5M收集三種具有活性的地龍溶栓酶峰液，得到用于提取分子量分別為1.0-3.0萬、2.5-4.0萬、3.5-5.0萬的三種地龍溶栓酶粗級(jí)產(chǎn)品依次命名為FⅠ、FⅡ、FⅢ，再將上述三種產(chǎn)品分別進(jìn)行超濾濃縮，濃縮比為10∶1的體積后，再分別用Octyl-Sepharose Fast Flow疏水層析劑進(jìn)行疏水層析，進(jìn)樣前用含硫酸銨的PH=6的0.02M前述緩沖液平衡層析劑，進(jìn)樣后用前述平衡緩沖液洗滌5個(gè)柱床體積后，用含硫酸銨的PH=6的0.02M前述緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，梯度洗脫時(shí)間2.0小時(shí)，硫酸銨濃度由0.8M線性遞減至0M，收集具有溶栓活性的地龍溶栓酶峰液，得到FⅠ、FⅡ、FⅢ的純化產(chǎn)品，再將上述純化產(chǎn)品超濾濃縮，濃縮比為40∶1后，用分子篩過濾層析，分子篩過濾層析劑為Sephacryl S-200，進(jìn)樣前，用PH=7的0.02M磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液平衡層析劑，進(jìn)樣后，用上述緩沖液淋洗，分別收集具有溶栓活性的地龍溶栓酶峰液，得到進(jìn)一步純化的FⅠ、FⅡ、FⅢ產(chǎn)品，最后再將上述產(chǎn)品分別用親和層析劑Benzamide-sepharose進(jìn)行親和層析，進(jìn)樣前用PH=7的0.02M磷酸氫二鈉-磷酸二氯鈉綬沖液平衡親和析劑，進(jìn)樣吸附后，用上述緩沖液淋洗后，改用PH=6的0.5M精氨酸溶液洗脫，分別收集具有溶栓性的組份，分別透析，除菌，過濾，分裝，最后制成液體，用凍干方法制成干粉，按每針劑5mg裝瓶。
實(shí)施例3取10g地龍粉與PH=10的0.02M三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液進(jìn)行攪拌溶解，經(jīng)離心分離取上清，用硫酸銨進(jìn)行初級(jí)沉淀，其最終飽和度為30％，再用硫酸銨進(jìn)行二級(jí)沉淀，其最終飽和度為70％，離心取沉淀，用水溶解沉淀，在PH=10的0.02M上述緩沖液中充分透析除硫酸銨，得到粗級(jí)混合地龍溶栓酶溶液，然后用瑞典進(jìn)口的QSepharose Fast Flow陰離子交換劑進(jìn)行離子交換，在進(jìn)樣前用PH=10的0.02M上述緩沖液平衡交換劑進(jìn)樣吸附后，用前述緩沖液洗滌5個(gè)柱床體積后，再用含氯化鈉的前述緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，梯度洗脫時(shí)間10小時(shí)，氯化鈉濃度由0M線性遞增0.5M收集三種具有活性的地龍溶栓酶峰液，得到用于提取分子量分別為1.0-3.0萬、2.5-4.0萬、3.5-5.0萬的三種地龍溶栓酶粗級(jí)產(chǎn)品依次命名為FⅠ、FⅡ、FⅢ，再將上述三種產(chǎn)品分別進(jìn)行超濾濃縮，濃縮比為20∶1的體積后，再分別用Phenyl-Sepharose FastFlow(high sub)疏水層析劑進(jìn)行疏水層析，進(jìn)樣前用含硫酸銨的PH=10的0.02M前述緩沖液平衡層析劑進(jìn)樣后，前述平衡緩沖液洗脫，用含硫酸銨的PH=10的0.02M前述緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，梯度洗脫時(shí)間5.0小時(shí)，硫酸銨濃度由0.5M線性遞減至0M，收集具有溶栓活性的地龍溶栓酶峰液，得到FⅠ、FⅡ、FⅢ的純化產(chǎn)品，再將上述純化產(chǎn)品超濾濃縮，濃縮比為50∶1后，用分子篩過濾層析，分子篩過濾層析劑為Sephacrye S-200，進(jìn)樣前，用PH=9的0.02M三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液平衡層析劑，進(jìn)樣后，用上述緩沖液淋洗，分別收集具有溶栓活性的地龍溶栓酶峰液，得到進(jìn)一步純化的FⅠ、FⅡ、FⅢ產(chǎn)品，最后再將上述產(chǎn)品分別用親和層析劑Benzamide-sepharose進(jìn)行親和層析，進(jìn)樣前用PH=9的0.02M三羥甲氨基甲烷-鹽酸緩沖液平衡親和層析劑，進(jìn)樣吸附后，用上述緩沖液淋洗后，改用PH=10的1.0M精氨酸溶液洗脫，分別收集具有溶栓性的組份，分別透析，除菌，過濾，分裝，最后制成液體針劑，每2ml注射水含量為5mg。
權(quán)利要求
1.用于治療急性血栓性疾病的地龍溶栓酶針劑，其特征在于該針劑含有分子量為1.0-3.0萬或2.5-4.0萬或3.5-5.0萬，等電點(diǎn)為3.6-4.4的地龍溶栓酶，每針劑2ml注射水含量為2-5mg。
2.如權(quán)利要求1所述的地龍溶栓酶針劑制備方法，其特征在于它按下步驟進(jìn)行a)將地龍粉用PH=4-10的0.02M緩沖液進(jìn)行攪拌溶解，其重量濃度為5-20％，經(jīng)離心分離取上清，用硫酸銨進(jìn)行初級(jí)沉淀，其最終飽和度為2 0-30％，離心分離取上清，再用硫酸銨進(jìn)行二級(jí)沉淀，其最終飽和度為4 0-70％，離心取沉淀，用水溶解沉淀，在PH=4-10的緩沖液中充分透析除去硫酸銨，得到粗級(jí)混合地龍溶栓酶溶液；b)再將(a)項(xiàng)粗級(jí)混合，地龍溶栓酶溶液，用陰離子交換劑交換，進(jìn)樣前，用PH=4-10的0.02M緩沖液平衡交換劑，進(jìn)樣吸附后，用前述緩沖液淋洗后，再用含氯化鈉的前述緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集三種具有溶栓活性的地龍溶栓酶峰液，得到用于提取分子量分別為1.0-3.0萬、2.5-4.0萬、3.5-5.0萬三種地龍溶栓酶粗級(jí)產(chǎn)品，依次命名為FⅠ、FⅡ、FⅢ。c)將b)項(xiàng)的FⅠ、FⅡ、FⅢ分別進(jìn)行超濾濃縮，濃縮比為5∶1-20∶1的體積；d)再將濃縮后的FⅠ、FⅡ、FⅢ分別用疏水層析劑進(jìn)行疏水層析，進(jìn)樣前，用含硫酸銨的PH=4的0.02M緩沖液平衡層析劑，進(jìn)樣后，用前述平衡緩沖液淋洗后，再用含硫酸銨的PH=4-10的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，分別收集具有溶栓活性的地龍溶栓酶峰液，得到FⅠ、FⅡ、FⅢ的純化產(chǎn)品；e)再將(d)項(xiàng)三種純化產(chǎn)品分別進(jìn)行超濾、濃縮，濃縮比30∶1-50∶1，用分子篩過濾層析，進(jìn)樣前，用P1=6-8的0.2M緩沖液平衡，層析劑，進(jìn)樣后，用上述緩沖液淋洗，分別收集具有溶栓活性的地龍溶栓酶峰液，得到進(jìn)一步純化的FⅠ、FⅡ、FⅢ產(chǎn)品。f)最后將(e)項(xiàng)中三種地龍溶栓酶液分別用親和層析劑進(jìn)行親和層析，進(jìn)樣前用PH=6-9的0.02M緩沖液平衡親和層析劑，進(jìn)樣吸附后，用上述緩沖液淋洗后，改用PH=4-10的0.1M-1M的精氨酸溶液洗脫，分別收集具有溶栓活性的組份，分別透析，除菌過濾，最終制成分子量為1.5-3.0萬、3.5-4.0萬、3.5-5.0萬的三種液體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于也可將地龍溶栓酶液體，用凍干方法制成干粉，再按每針劑2.5mg裝瓶。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于所述的緩沖液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、三羥甲基胺基甲烷-鹽酸、醋酸-醋酸鈉緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于所述的陰離子交換劑為DEAE Sepharose Fast Flow、DEAE Sephacel、Q Sepharose Fast Flow。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于所述的疏水層析劑為Phenyl-Sepharose 6 Fast Folw(low Sub),Phenyl-Sepharose 6 Fast Folw(high Sub),Octyl-Sepharose Fast Flow。
7.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于所述的分子篩過濾層析劑為Sephadex G-75，Sephacryl S-200。
8.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于所述的親和層析劑為Benzamide-Sepharose。
9.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于所述的離子交換的線性梯度洗脫為梯度洗脫時(shí)間為0.5-10小時(shí)，氯化鈉濃度由OM線性遞增至0.5M。
10.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述制備方法，其特征在于所述的疏水層析的線性梯度洗脫為梯度洗脫時(shí)間為0.5-5小時(shí)，硫酸銨濃度由1.5M線性遞減至0M。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于治療急性血栓疾病的地龍溶栓酶針劑及制備方法,其特征在于將地龍粉經(jīng)溶解、沉淀、離子交換、疏水層析、分子篩層析和親和層析,得到三種具有活性的地龍溶栓酶,制成針劑或凍干制品,該產(chǎn)品純度高,治療效果好,毒副作用小。
文檔編號(hào)A61K38/43GK1225821SQ98126139
公開日1999年8月18日 申請(qǐng)日期1998年12月25日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月25日
發(fā)明者蔣盤宏, 宋金華 申請(qǐng)人:北京化學(xué)試劑研究所