專利名稱：一種血栓靶向性溶栓融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA重組，尤其是關(guān)于一種Annexin V與低分子量尿激酶融合蛋白，該融合蛋白具有血栓靶向性溶栓作用。
溶栓治療已成功的用于臨床血栓性疾病如急性心肌梗塞的治療。目前臨床應(yīng)用的溶栓藥物主要有尿激酶、鏈激酶和組織型纖溶酶原激活物等，但是它們在臨床應(yīng)用過程中存在一定的局限性，如一些病人的血栓對纖溶藥物的裂解有抵抗性、血栓溶解后血栓的再形成及纖溶藥物引起的系統(tǒng)性出血等副作用等。因此，目前人們主要致力于提高溶栓藥物的效率及安全性的研究，其中包括以血栓特異的單克隆抗體為載體構(gòu)建血栓靶向性的溶栓藥物的研究。所用的單克隆抗體主要有抗纖維蛋白單克隆抗體、抗血小板特異抗原如糖蛋白IIb/IIIa的單克隆抗體等(Bode C.et al.，1991，Circulation，84805；Runge MS.et al.，Pro Natl Acad Sci USA，8810337)。這些血栓靶向性的溶栓藥物雖然在體內(nèi)提高了溶栓效率，但是由于所用的單克隆抗體多為鼠源性的，具有免疫原性，因而臨床應(yīng)用具有一定的局限性。尋找新型的載體發(fā)展血栓靶向性的溶栓藥物就顯得十分重要。
Annexin V是Annexin蛋白家族中含量最豐富的一種鈣結(jié)合蛋白。它對磷脂酰絲氨酸(PS)有高親和力。通常情況下，細(xì)胞膜兩側(cè)磷脂的分布是不均一的，PS主要分布于膜的內(nèi)側(cè)(Op den Kamp JA.，1979，Ann RevBiochem，4847)。但是在某些特殊情況下如血小板活化時，PS就暴露于膜的外側(cè)，因此Annexin V對活化血小板具有高親和力。每個活化血小板表面約有20萬個Annexin V的結(jié)合位點，大約是抗血小板糖蛋白IIb/IIIa單克隆抗體結(jié)合位點的10倍(Shattil SJ.et al.，1985，J Biol Chem，26011107)。動物實驗表明，同位素標(biāo)記的Annexin V靜脈注射后主要聚集于主動脈血栓部位(Tait J.F.，et al.1994，Thromb Res.，75491)；99mTc標(biāo)記的Annexin V可用于心內(nèi)血栓的顯像(Stratton J.R.，et al.1995，Circulation.，923113)。由于Annexin V對血栓具有靶向性，因此可以其為載體發(fā)展血栓靶向性的溶栓藥物。以Annexin V為載體發(fā)展的靶向溶栓藥物至少具有兩方面的優(yōu)點一是Annexin V本身具有抗凝活性，可預(yù)防血栓溶解后血栓的再形成；二是Annexin V為人體蛋白，不具有免疫原性；低分子量尿激酶(scu-PA-32K)是單鏈尿激酶(scu-PA)的一種衍生物，由scu-PA的144-411位氨基酸殘基組成，具有與scu-PA相似的溶栓性質(zhì)，引起系統(tǒng)出血副作用小，即有一定的溶栓選擇性。近年來，國外已有人用化學(xué)法獲取了Annexin V與尿激酶B鏈的偶聯(lián)產(chǎn)物(Tanaka.J.etal.，1996，Biochemistry.，35922)，但化學(xué)法存在操作繁瑣、產(chǎn)物不均一等缺點。若能用基因融合的方法構(gòu)建Annexin V與scu-PA-32K的融合蛋白，此蛋白分子將具有血栓靶向性的溶栓活性，對臨床提高療效、降低出血副作用具有重要意義。
桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是近年來發(fā)展起來的一種新型真核表達(dá)系統(tǒng)。利用該系統(tǒng)可在昆蟲細(xì)胞及蟲體中高效表達(dá)外源基因，同時該系統(tǒng)還具有較完善的翻譯后加工體系，如二硫鍵配對、糖基化修飾等，因此在基因工程藥物生產(chǎn)中較細(xì)菌、酵母、哺乳動物細(xì)胞等體系更具潛在的優(yōu)勢(Karl M.etal.，1994，Insect Cell Biotechnology，CRC press)。Bac to Bac昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是1993年由Luckow等人發(fā)展的一種高效、快速的昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Luckow V.A.et al.，1993，J Virol.，674566)。他們利用細(xì)菌的Tn7轉(zhuǎn)座子，構(gòu)建了桿狀病毒的穿梭載體Bacmid，它是一種既可在大腸桿菌中復(fù)制又可在昆蟲細(xì)胞中復(fù)制的重組桿狀病毒，原來的多角體蛋白基因被卡那霉素抗性基因、LacZ基因、Tn7轉(zhuǎn)座子的靶位點miniaatTn7和復(fù)制子mini-F所代替，由于有mini-F的存在，Bacmid可以在細(xì)菌中低拷貝復(fù)制。同時，又在pBluescript的基礎(chǔ)上構(gòu)建了供體質(zhì)粒，供體質(zhì)粒含有Tn7的左右兩臂，兩臂之間有Ph啟動子和polylinker區(qū)，還含有慶大霉素的抗性基因供轉(zhuǎn)位后的篩選。用供體質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化已帶有Bacmid和輔助質(zhì)粒(Tet+)的感受態(tài)細(xì)胞，輔助質(zhì)粒提供反式作用發(fā)生轉(zhuǎn)座，將外源基因轉(zhuǎn)到Bacmid的attTn7位置，并使LacZ基因失活，在含有卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素的平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選含有外源基因的重組Bacmid，轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞即得重組病毒，與重組病毒的空斑法篩選相比，其快速有效，可在短時間內(nèi)獲得重組病毒。
本發(fā)明的目的是提供一種血栓靶向性溶栓融合蛋白，是通過基因工程方法構(gòu)建以水蛭素12肽為連接肽的Annexin V與scu-PA-32K(低分子量尿激酶)的融合基因，重組入Bac to Bac昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的供體質(zhì)粒中，在粉蚊夜蛾細(xì)胞Tn-5B1-4中表達(dá)Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白，該融合蛋白具有血栓靶向性的溶栓作用。
本發(fā)明提供一種血栓靶向性溶栓融合蛋白。首先是通過PCR拼接的方法構(gòu)建以水蛭素12肽為連接肽的Annexin V與scu-PA-32K的融合基因。為了使Annexin V與低分子量尿激酶融合蛋白各自能保持正確的空間結(jié)構(gòu)，本發(fā)明以具有抗凝活性的水蛭素12肽作為連接肽，根據(jù)低分子量尿激酶及水蛭素12肽的核苷酸序列，設(shè)計了一對引物P1和P2P15’GGCCATGGAATTAAAATTTCAGTGTGGCAAAAGAC3’P25’GGCTCGAGTAAATATTCTTCTGGAATTTCTTCGAAATCGCCGAGGGCCAGGCCATTCTC3’P1為低分子量尿激酶N端的核苷酸序列，并引進(jìn)NcoI酶切位點；P2為低分子量尿激酶C末端及水蛭素12肽核苷酸序列的互補(bǔ)序列，并引進(jìn)XhoI酶切位點。以含有尿激酶原cDNA質(zhì)粒pUC-PUK(1-411)為模板，以P1、P2為引物PCR擴(kuò)增低分子量尿激酶與水蛭素融合基因。根據(jù)Annexin V的核苷酸序列，設(shè)計一對引物P3和P4P35’GGCTCGAGATGGCACAGGTTCTCAGAGG 3’P45’GAAAGCTTTTAGTCATCTTCTCCACAGAGC 3’。以含有Annexin V cDNA的質(zhì)粒pSK-ANV為模板，以P3、P4為引物，擴(kuò)增Annexin V的cDNA，在5’及3’端分別引進(jìn)XhoI及HindIII位點。PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1，泳道1為DNA分子量參照，泳道2為Annexin V cDNA的PCR產(chǎn)物，在其5’及3’端分別引入XhoI及HindIH位點，泳道3為scu-PA-32K及其C端連接水蛭素基因的PCR產(chǎn)物，在其5’及3’端分別引入NcoI及XhoI位點，PCR產(chǎn)物經(jīng)測序證明序列完全正確，連接在scu-PA-32K C末端的水蛭素12肽的核苷酸序列(GGCGATTTCGAAGAAATTCCAGAAGAATATCTCGAG)見圖2，證明水蛭素12肽的基因已成功拼接于scu-PA-32K的C末端。NcoI及XhoI雙酶切的拼接水蛭素12肽的scu-PA-32K片段與XhoI及HindIII雙酶切的Annexin V片段連接獲得Annexin V與scu-PA-32K的融合基因，序列見圖3，在其兩端分別引進(jìn)了NcoI及HindIII位點。
本發(fā)明還構(gòu)建了含有Annexin V與scu-PA-32K的融合基因的Bac toBac昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的重組供體質(zhì)粒pFastBacHTUKAV及在昆蟲細(xì)胞中高效表達(dá)Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白的重組病毒BacUKAV。將經(jīng)NcoI/HindIII雙酶切的Annexin V與scu-PA-32K的融合基因片斷與經(jīng)NcoI-HindIII雙酶切消化的供體質(zhì)粒pFastBacHTa連接，構(gòu)建了含有Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白基因的重組供體質(zhì)粒pFastBacHTUKAV(圖4)。將重組供體質(zhì)粒pFastBacHTUKAV轉(zhuǎn)化鈣細(xì)胞HB10B，在含有Blue-gal及IPTG的平板上(卡那霉素50μg/ml，四環(huán)素10μg/ml，慶大霉素50μg/ml)，經(jīng)兩輪篩選后，挑取一個白色克隆接種于3ml的LB培養(yǎng)基中。培養(yǎng)24小時后，提取重組Bacmid。以Lipofectin法共轉(zhuǎn)染Sf21細(xì)胞。三天后收集含有重組病毒的共轉(zhuǎn)染上清，其病毒滴度約為2×107pfu/ml。重組病毒BacUKAV以PCR方法鑒定，分別以scu-PA-32K和Annexin V的兩對引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，可擴(kuò)增出840bp及980bp的DNA片段，與相應(yīng)供體質(zhì)粒擴(kuò)增出的DNA片段相一致，證明本發(fā)明獲得的重組病毒BacUKAV的確含有scu-PA-32K和Annexin V基因(圖5)。
重組病毒BacUKAV感染粉蚊夜蛾細(xì)胞Tn-5B1-4獲得Annexin V-scu-PA-32K的融合蛋白。重組病毒上清分別以MOI＝10感染昆蟲細(xì)胞Sf21及Tn-5B1-4，72小時后收集細(xì)胞，用于SDS-PAGE及Western blot分析，結(jié)果見圖6和圖7。圖6的結(jié)果表明，Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白在Tn細(xì)胞中得到高效表達(dá)，表達(dá)量占細(xì)胞總蛋白的20％左右，其分子量為70kD，與計算的分子量相一致，而Sf21細(xì)胞的表達(dá)量較低，SDS-PAGE圖譜上未見明顯的表達(dá)條帶。Western blot分析表明，Tn-5B1-4細(xì)胞中的表達(dá)蛋白與抗尿激酶單克隆抗體及抗Annexin V的多抗有特異的免疫反應(yīng)，說明表達(dá)蛋白為低分子量尿激酶與Annexin V的融合蛋白。
本發(fā)明還利用Ni-NTA親和層析對昆蟲細(xì)胞表達(dá)的Annexin V-scu-PA-32K的融合蛋白進(jìn)行了純化。由于在融合蛋白的N端融合了6Xhis，所以可用Ni-NTA親和層析來純化目的蛋白。重組病毒感染昆蟲細(xì)胞72小時后收集細(xì)胞，以液氮中反復(fù)凍溶裂解細(xì)胞，15000rpm離心20分鐘，收集上清，直接上以結(jié)合緩沖液平衡的Ni-NTA樹脂，流速為10ml/hr，分別以6倍及4倍柱體積的結(jié)合緩沖液及洗滌緩沖液洗去雜蛋白，最后以6倍柱體積的洗脫緩沖液洗脫6Xhis的融合蛋白，純化的融合蛋白的純度達(dá)90％以上(圖8)。
本發(fā)明所提供的Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白不僅具有低分子量尿激酶的纖溶活性，而且具有Annexin V的抗凝活性及對活化血小板具有高親和力。血纖維蛋白平板實驗表明，表達(dá)產(chǎn)物具有明顯的纖溶活性，這種纖溶活性可被抗尿激酶單抗所中和，說明表達(dá)產(chǎn)物具有與天然尿激酶相同的纖溶活性，Tn細(xì)胞中尿激酶的表達(dá)量為7600IU/106細(xì)胞?？鼓龑嶒炑芯勘砻?圖9)，表達(dá)的重組蛋白的部分凝血酶原時間(APTT)較對照組明顯延長，說明表達(dá)產(chǎn)物具有明顯的抗凝活性。膜結(jié)合特異性研究表明，隨著競爭物濃度升高，血小板結(jié)合的125I-Annexin V比例逐漸下降，且Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白與Annexin V下降趨勢基本一致，說明Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白對活化的血小板的親和力與Annexin V相當(dāng)(圖10)。
經(jīng)體外實驗證實，Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白具有明顯的抗凝活性且能與活化的血小板特異結(jié)合，有可能成為一種新型血栓靶向性溶栓藥物。同樣思路還可獲得多種溶栓藥物如鏈激酶、組織纖溶酶原激活物、葡激酶、纖維蛋白降解產(chǎn)物與Annexin V融合的多種靶向性溶栓重組蛋白，有望成為一類新型血栓靶向性溶栓藥物。
綜上所述，本發(fā)明的優(yōu)點如下通過基因工程方法構(gòu)建了Annexin V與scu-PA-32K融合基因，并實現(xiàn)其在昆蟲細(xì)胞中的高效表達(dá)。Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白不但能與活化的血小板特異結(jié)合，且具有明顯的抗凝、纖溶活性，可預(yù)防血栓溶解后血栓的再形成，有望成為一種新型血栓靶向性溶栓藥物；本發(fā)明通過昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)實現(xiàn)了Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白在昆蟲細(xì)胞中的高效表達(dá)，表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它表達(dá)系統(tǒng)中尿激酶的表達(dá)量，使得通過基因工程方法生產(chǎn)這種融合蛋白的成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于化學(xué)偶聯(lián)法，這有利于此種融合蛋白的工業(yè)化大量生產(chǎn)。


圖1.低分子量尿激酶及Annexin V cDNA的PCR擴(kuò)增圖譜1，DNA分子量參照；2，Annexin V cDNA的PCR產(chǎn)物；3，低分子量尿激酶的PCR產(chǎn)物。
圖2.連接在scu-PA-32K C末端的水蛭素12肽的核苷酸序列GGCGATTTCGAAGAAATTCCAGAAGAATATCTCGAG。
圖3.Annexin V與scu-PA-32K的融合基因的核苷酸序列。
圖4.重組供體質(zhì)粒pFastBacHTUKAV的結(jié)構(gòu)圖譜。
圖5.重組病毒BacUKAV的PCR鑒定結(jié)果1，DNA分子量參照；2，BacUKAV為模板，Annexin V正反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3，pFastBacHTUKAV為模板，Annexin V正反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；4，BacUKAV為模板，scu-PA-32K正反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；5，pFastBacHTUKAV為模板，scu-PA-32K正反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；6，BacPAK6為模板，Annexin V正反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；7，BacPAK6為模板，scu-PA-32K正反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
圖6.被重組病毒BacUKAV感染的Tn-5B1-4細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析1，蛋白分子量參照；2，感染BacPAK6的細(xì)胞總蛋白；3，感染BacUKAV的細(xì)胞總蛋白。
圖7.被重組病毒BacUKAV感染的Tn-5B1-4細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的Westernblot分析1，蛋白分子量參照；2，蛋白質(zhì)印跡條帶。
圖8.親和層析純化的表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析1，蛋白分子量參照；2，純化的融合蛋白。
圖9.表達(dá)產(chǎn)物的抗凝活性分析1，PBS；2，感染BacPAK6的細(xì)胞裂解液；3，感染BacUKAV的細(xì)胞裂解液；4，重組Annexin V蛋白。
圖10.Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白對活化血小板膜親和力的測定1，Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白；2，Annexin V蛋白。
本發(fā)明通過以下實施例進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明的范圍。
實施例1.構(gòu)建Annexin V-scu-PA-32K融合基因在100μl的PCR反應(yīng)總體積中，以10ng含有尿激酶原cDNA質(zhì)粒pUC-PUK(1-411)(本發(fā)明人實驗室提供)為模板，加10μM的P1、P2引物各2μl，10mM dNTP(生工公司)2μl，15mM MgCl210μl，10XPCR緩沖液10μl，Taq酶(生工公司)4個單位，補(bǔ)加雙蒸水至100μl。PCR條件為94℃ 1min，55℃ 1.5min，72℃ 1.5min，共35個循環(huán)，最后一個循環(huán)72℃延伸10min，PCR結(jié)果見圖1(泳道3)，在PCR產(chǎn)物5’及3’端分別引入NcoI及XhoI位點。PCR產(chǎn)物經(jīng)低熔點膠純化后，克隆進(jìn)pSK(+)的EcoRV位點，構(gòu)建質(zhì)粒pSK-UKL，測序證明PCR擴(kuò)增的低分子量尿激酶cDNA序列正確，水蛭素12肽成功拼接于低分子量尿激酶的C末端(圖2)。同樣方法，以10ng含有Annexin V cDNA的質(zhì)粒pSK-ANV(本發(fā)明人實驗室提供)為模板，以P3、P4為引物，同樣PCR條件擴(kuò)增Annexin V的cDNA，結(jié)果見圖1(泳道2)，在PCR產(chǎn)物5’及3’端分別引進(jìn)XhoI及HindIII位點。PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)pSK(+)的EcoRV位點，構(gòu)建質(zhì)粒pSK-ANV2，經(jīng)測序證明其核苷酸序列完全正確。NcoI及XhoI雙酶切的拼接水蛭素12肽基因的scu-PA-32K片段與XhoI及HindIII雙酶切的Annexin V片段連接獲得Annexin V與scu-PA-32K的融合基因，其序列見圖3，在其兩端分別引進(jìn)了NcoI及HindIII位點。
實施例2.重組供體質(zhì)粒pFastBacUKAV的構(gòu)建取3μg質(zhì)粒pSK-UKL，NcoI-XhoI雙酶切后，低熔點膠分離、回收scu-PA-32K基因片段；取3μg質(zhì)粒pSK-ANV2，XhoI-HindIII雙酶切后，低熔點膠分離、回收Annexin V基因片段。將兩個基因片斷與經(jīng)NcoI-HindIII雙酶切消化的質(zhì)粒pFastBacHTa(購自Gibcol，BRL公司)連接，轉(zhuǎn)化、酶切鑒定后獲得含有Annexin V-scu-PA-32k融合蛋白基因的供體質(zhì)粒pFastBacUKAV(圖4)。
實施例3.表達(dá)Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白的重組病毒BacUKAV的獲取取20ng重組供體質(zhì)粒pBacFastUKAV轉(zhuǎn)化鈣細(xì)胞HB10B，在含有Blue-gal及IPTG的平板上(卡那霉素50μg/ml，四環(huán)素10μg/ml，慶大霉素50μg/ml)，經(jīng)兩輪藍(lán)白斑篩選后，挑取一個白色克隆接種于3ml的LB培養(yǎng)基中。培養(yǎng)24小時后，提取重組Bacmid。以Lipofectin法共轉(zhuǎn)染Sf21細(xì)胞。三天后收集含有重組病毒的共轉(zhuǎn)染上清，其病毒滴度約為2×107pfu/ml。共轉(zhuǎn)染上清用于提取病毒DNA，分別以scu-PA-32k和Annexin V的兩對引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR條件同前，PCR鑒定結(jié)果證實，可擴(kuò)增出840bp及980bp的DNA片斷，與相應(yīng)供體質(zhì)粒擴(kuò)增出的DNA片斷相一致(圖5)。
實施例4.Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白在粉蚊夜蛾細(xì)胞Tn-5B1-4中的表達(dá)重組病毒上清分別以MOI＝10感染昆蟲細(xì)胞Sf21及Tn-5B1-4，72小時后收集細(xì)胞，用于SDS-PAGE及Western blot分析，結(jié)果見圖6和圖7。圖6的結(jié)果表明，Annexin V-scu-PA一32K融合蛋白在Tn細(xì)胞中得到高效表達(dá)，表達(dá)量占細(xì)胞總蛋白的20％左右，其分子量為70kD，與計算的分子量相一致，而Sf21細(xì)胞的表達(dá)量較低，SDS-PAGE圖譜上未見明顯的表達(dá)條帶。Western blot分析表明，Tn-5B1-4細(xì)胞中的表達(dá)蛋白與抗尿激酶單克隆抗體及抗人Annexin V的多抗有特異的免疫反應(yīng)，說明表達(dá)蛋白為低分子量尿激酶與Annexin V的融合蛋白。
實施例5.昆蟲細(xì)胞表達(dá)的Annexin V-scu-PA-32K的融合蛋白Ni-NTA親和層析純化由于在融合蛋白的N端融合了6Xhis，所以可用Ni-NTA親和層析來純化目的蛋白。重組病毒感染昆蟲細(xì)胞72小時后收集細(xì)胞，以液氮中反復(fù)凍溶裂解細(xì)胞，15000rpm離心20分鐘，收集上清，直接上以結(jié)合緩沖液平衡的Ni-NTA樹脂，流速為10ml/hr，分別以6倍及4倍柱體積的結(jié)合緩沖液(20mmol/L Tris-HCl，5mmol/L咪唑，pH7.9)及洗滌緩沖液(20mmol/LTris-HCl，20mmol/L咪唑，pH7.9)洗去雜蛋白，最后以6倍柱體積的洗脫緩沖液(20mmol/L Tris-HCl，300mmol/L咪唑，pH7.9)洗脫6Xhis的融合蛋白，純化的融合蛋白的純度達(dá)90％以上(圖8)。
實施例6.昆蟲細(xì)胞表達(dá)的Annexin V-scu-PA-32K的融合蛋白的生物活性鑒定昆蟲細(xì)胞表達(dá)的Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白不僅具有低分子量尿激酶的纖溶活性，而且具有Annexin V的抗凝活性及對活化血小板具有高親和力。血纖維蛋白平板實驗測定纖溶活性參照文獻(xiàn)(Ploug T.et al.，1957，Biochem Biophys Acta，27278)方法稍加修改進(jìn)行，用0.1mol/L的PBS，pH7.4配制1.4％的瓊脂糖，水浴煮沸，取5ml與5ml 37℃預(yù)熱的人纖維蛋白原(2mg/ml)及0.2ml的42℃預(yù)熱的凝血酶(50U/ml)混合，傾入40孔的酶聯(lián)板蓋上，凝后打孔加入10μl的待測樣品，在濕盒中37℃孵育6至18小時，溶解圈直徑與每孔UK的量的對數(shù)呈線性關(guān)系。實驗結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物具有明顯的纖溶活性，這種纖溶活性可被抗尿激酶單抗所中和，說明表達(dá)產(chǎn)物具有與天然尿激酶相同的纖溶活性，Tn細(xì)胞中尿激酶的表達(dá)量為7600IU/106細(xì)胞?？鼓龑嶒灢捎肁PTT法，取100μl的活化部分凝血活酶試劑，加入100μl的待測樣品，37℃預(yù)溫3min，加入100μl的參比血漿，測定反應(yīng)物凝固時間。實驗表明(圖9)，表達(dá)產(chǎn)物具有明顯的抗凝活性。膜結(jié)合特異性的分析采用的反應(yīng)體系為10mmol/L Na-HEPES(pH7.4)，136mmol/L NaCl，2.5mmol/L CaCl2，2.7mmol/L KCl，2mmol/L MgCl2，1mmol/L NaH2PO4，5mmol/L glucose，5mg/ml BSA，凝血酶活化的血小板5×107/ml，5nmol/L125I-Annexin V，加入不同濃度的Annexin V及表達(dá)產(chǎn)物，離心收集血小板及上清，分別測定其放射活性，計算結(jié)合百分比。膜結(jié)合特異性研究表明，Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白對活化的血小板的親和力與Annexin V相當(dāng)(圖10)。這些結(jié)果表明，Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白在體內(nèi)對以活化血小板為主要成分的主動脈血栓具有靶向溶栓作用。
權(quán)利要求
1.一種血栓靶向性溶栓融合蛋白，其特征在于通過基因工程方法首先構(gòu)建Annexin V與低分子量尿激酶scu-PA-32K的融合基因，將該融合基因插入Bac to Bac昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的供體質(zhì)粒pFastBacHTa中得到重組供體質(zhì)粒pFastBacUKAV，再將該重組供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化獲得重組病毒BacUKAV，BacUKAV感染昆蟲細(xì)胞表達(dá)獲得Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的血栓靶向性溶栓融合蛋白，其特征在于所述Annexin V與scu-PA-32K融合基因的DNA核苷酸及其相應(yīng)的氨基酸序列如下TTAAAATTTCAGTGTGGCCAAAAGACTCTGAGGCCCCGCTTTAAGATTATTGGGGGAGAAL K F Q C G Q K T L R P R F K I I G G ETTCACCACCATCGAGAACCAGCCCTGGTTTGCGGCCATCTACAGGAGGCACCGGGGGGGCF T T I E N Q P W F A A I Y R R H R G GTCTGTCACCTACGTGTGTGGAGGCAGCCTCATCAGCCCTTGCTGGGTGATCAGCGCCACAS V T Y V C G G S L I S P C W V I S A TCACTGCTTCATTGATTACCCAAAGAAGGAGGACTACATCGTCTACCTGGGTCGCTCAAGGH C F I D Y P K K E D Y I V Y L G R S RCTTAACTCCAACACGCAAGGGGAGATGAAGTTTGAGGTGGAAAACCTCATCCTACACAAGL N S N T Q G E M K F E V E N L I L H KGACTACAGCGCTGACACGCTTGCTCACCACAACGACATTGCCTTGCTGAAGATCCGTTCCD Y S A D T L A H H N D I A L L K I R SAAGGAGGGCAGGTGTGCGCAGCCATCCCGGACTATACAGACCATCTGCCTGCCCTCGATGK E G R C A Q P S R T I Q T I C L P S MTATAACGATCCCCAGTTTGGCACAAGCTGTGAGATCACTGGCTTTGGAAAAGAGAATTCTY N D P Q F G T S C E I T G F G K E N SACCGACTATCTCTATCCGGAGCAGCTGAAGATGACTGTTGTGAAGCTGATTTCCCACCGGT D Y L Y P E Q L K M T V V K L I S H RGAGTGTCAGCAGCCCCACTACTACGGCTCTGAAGTCACCACCAAAATGCTGTGTGCTGCTE C Q Q P H Y Y G S E V T T K M L C A AGACCCACAGTGGAAAACAGATTCCTGCCAGGGAGACTCAGGGGGACCCCTCGTCTGTTCCD P Q W K T D S C Q G D S G G P L V C SCTCCAAGGCCGCATGACTTTGACTGGAATTGTGAGCTGGGGCCGTGGATGTGCCCTGAAGL Q G R M T L T G I V S W G R G C A L KGACAAGCCAGGCGTCTACACGAGAGTCTCACACTTCTTACCCTGGATCCGCAGTCACACCD K P G V Y T R V S H F L P W I R S H TAAGGAAGAGAATGGCCTGGCCCTCGGCGATTTCGAAGAAATTCCAGAAGAATATCTCGAGK E E N G L A L G D F E E I P E E Y L EATGGCACAGGTTCTCAGAGGCACTCTGACTGACTTCCCTGGATTTGATGAGCGGGCTGATM A Q V L R G T L T D F P G F D E R A DGCAGAAACTCTTCGGAAGGCTATGAAAGGCTTGGGCACAGATGAGGAGAGCATCCTGACTA E T L R K A M K G L G T D E E S I L TCTGTTGACATCCGCAAGTAATGCTCAGCGCCAGGAAATCTCTGCAGCTTTTAAGACTCTGL L T S R S N A Q R Q E I S A A F K T LTTTGGCAGGGATCTTCTGGATGACCTGAAATCAGAACTAACTGGAAAATTTGAAAAATTAF G R D L L D D L K S E L T G K F E K LATTGTGGCTCTGATGAAACCCTCTCGGCTTTATGATGCTTATGAACTGAAACATGCCTTGI V A L M K P S R L Y D A Y E L K H A LAAGGGAGCTGGAACAAATGAAAAAGTACTGACAGAAATTATTGCTTCAAGGACACCTGAAK G A G T N E K V L T E I I A S R T P EGAACTGAGAGCCATCAAACAAGTTTATGAAGAAGAATATGGCTCAAGCCTGGAAGATGACE L R A I K Q V Y E E E Y G S S L E D DGTGGTGGGGGACACTTCAGGGTACTACCAGCGGATGTTGGTGGTTCTCCTTCAGGCTAACV V G D T S G Y Y Q R M L V V L L Q A NAGAGACCCTGATGCTGGAATTGATGAAGCTCAAGTTGAACAAGATGCTCAGGCTTTATTTR D P D A G I D E A Q V E Q D A Q A L FCAGGCTGGAGAACTTAAATGGGGGACAGATGAAGAAAAGTTTATCACCATCTTTGGAACAQ A G E L K W G T D E E K F I T I F G TCGAAGTGTGTCTCATTTGAGAAAGGTGTTTGACAAGTACATGACTATATCAGGATTTCAAR S V S H L R K V F D K Y M T I S G F QATTGAGGAAACCATTGACCGCGAGACTTCTGGCAATTTAGAGCAACTACTCCTTGCTGTTI E E T I D R E T S G N L E Q L L L A VGTGAAATCTATTCGAAGTATACCTGCCTACCTTGCAGAGACCCTCTATTATGCTATGAAGV K S I R S I P A Y L A E T L Y Y A M KGGAGCTGGGACAGATGATCATACCCTCATCAGAGTCATGGTTTCCAGGAGTGAGATTGATG A G T D D H T L I R V M V S R S E I DCTGTTTAACATCAGGAAGGAGTTTAGGAAGAATTTTGCCACCTCTCTTTATTCCATGATTL F N I R K E F R K N F A T S L Y S M IAAGGGAGATACATCTGGGGACTATAAGAAAGCTCTTCTGCTGCTCTGTGGAGAAGATGACK G D T S G D Y K K A L L L L C G E D DTAA*
3.如權(quán)利要求1所述的血栓靶向性溶栓融合蛋白，其特征在于所述的重組供體質(zhì)粒pFastBacHTUKAV的結(jié)構(gòu)包括PH啟動子，Annexin V與scu-PA-32K融合基因含有UK，hirudin與Annexin V，轉(zhuǎn)座子左臂TnTL，轉(zhuǎn)座子右臂TnTR，氨卞青霉素抗性Apr，慶大霉素抗性Gmr，質(zhì)粒復(fù)制啟始點Ori。
4.如權(quán)利要求1所述的血栓靶向性溶栓融合蛋白，其特征在于所述的重組病毒BacUKAV是將重組供體質(zhì)粒pBacFastHTUKAV轉(zhuǎn)化鈣細(xì)胞HB10B后，獲取重組Bacmid，并以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Sf21細(xì)胞后而得到。
5.如權(quán)利要求1所述的血栓靶向性溶栓融合蛋白，其特征在于重組病毒BacUKAV感染粉蚊夜蛾細(xì)胞Tn-5B1-4表達(dá)獲得Annexin V-scu-PA-32K融合蛋白。
6.如權(quán)利要求1所述的血栓靶向性溶栓融合蛋白，其特征在于Annexin V也可以與鏈激酶、組織纖溶酶原激活物、葡激酶或纖維蛋白降解產(chǎn)物融合成靶向性溶栓重組蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及以對活化血小板具有高親和力的Annexin V為載體構(gòu)建血栓靶向性溶栓融合蛋白是Annexin V與低分子量尿激酶融合基因在昆蟲細(xì)胞中的活性表達(dá)產(chǎn)物。將Annexin V與scu－PA－32K融合基因插入Bac to Bac昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的供體質(zhì)粒中,將重組供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化鈣細(xì)胞HB10B,并經(jīng)藍(lán)白斑篩選獲取重組Bacmid,以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Sf21細(xì)胞而獲得重組病毒BacUKAV。昆蟲細(xì)胞Tn－5B1－4表達(dá)的Annexin V－scu－PA－32K融合蛋白不僅對活化血小板具有高親和力,而且具有尿激酶的纖溶活性,為雙功能蛋白。
文檔編號C12N15/12GK1247195SQ9911352
公開日2000年3月15日 申請日期1999年3月12日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月12日
發(fā)明者吳祥甫, 孫建新, 楊冠珍 申請人:中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所