專利名稱：抗水痘－帶狀皰疹病毒基因63產(chǎn)物的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療和預(yù)防感染了水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)的個(gè)體的帶狀皰疹的組合物，并涉及水痘感染的預(yù)防和治療。本發(fā)明組合物含有由VZV基因63編碼的蛋白或其免疫活性衍生物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有與VZV基因63相對(duì)應(yīng)的DNA或RNA的組合物。
水痘病毒是一種人α-皰疹病毒，能導(dǎo)致兩種人類疾病初次感染VZV導(dǎo)致兒童水痘，此后病毒變?yōu)闈摲⒊３Ｖ丶せ?通常幾十年后)產(chǎn)生帶狀皰疹。患水痘時(shí)，病毒透入外周神經(jīng)系統(tǒng)并潛伏直至以痛苦的帶狀皰疹形式重激活。由于病毒是潛伏的，大部分病毒基因地表達(dá)被抑制。由于帶狀皰疹形式的重激活常發(fā)生在年老的或免疫損傷的個(gè)體中，據(jù)信細(xì)胞介導(dǎo)的免疫在控制潛伏狀態(tài)中起著關(guān)鍵作用。
VZV感染具有存在最小量的自由病毒的特征。在潛伏狀態(tài)和重激活時(shí)，病毒主要在細(xì)胞內(nèi)。相應(yīng)地，甚至使用高濃度中和抗體和依賴于細(xì)胞介導(dǎo)免疫的病毒控制也不能預(yù)防復(fù)發(fā)疾病。為了通過(guò)接種獲得保護(hù)，不但需要誘導(dǎo)抗體反應(yīng)，還需要細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)。一種有效的疫苗應(yīng)當(dāng)使細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞具有一旦出現(xiàn)潛伏病毒重激活征兆時(shí)盡可能早的起作用的能力。
由于通過(guò)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞CTL的抗原識(shí)別機(jī)制包括天然抗原分解成肽，蛋白分解片段與主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子的結(jié)合以及復(fù)合體向細(xì)胞表面的排出，任何病毒編碼多肽而不只是那些膜內(nèi)在蛋白質(zhì)例如糖蛋白可以是T細(xì)胞介導(dǎo)反應(yīng)的潛在靶。然而，由于VZV基因組除了外部糖蛋白以外還編碼幾種非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和內(nèi)部病毒顆粒蛋白質(zhì)，導(dǎo)致大量的潛在細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞靶并且不知哪種蛋白質(zhì)是最相關(guān)的。
水痘帶狀皰疹病毒基因組由71個(gè)開放閱讀框組成，編碼68種蛋白質(zhì)。已知病毒DNA的序列(普通病毒學(xué)期刊(J.Gen Virol)67 1759-1816)。水痘帶狀皰疹病毒基因63編碼預(yù)計(jì)分子量為30.5千道爾頓(KDa)的立即早期蛋白質(zhì)(Debrus等,病毒學(xué)期刊(J.of Virology)69(5),1995第3240頁(yè))。該基因開始于110581(起始密碼子)直至111414(終止密碼子)。該基因另一個(gè)反方向的拷貝發(fā)現(xiàn)于堿基119316至118483之間。相當(dāng)罕見地，發(fā)現(xiàn)了IE63蛋白質(zhì)表達(dá)于大鼠模型中，潛伏狀態(tài)時(shí)在神經(jīng)元中。該蛋白質(zhì)已經(jīng)作為融合蛋白在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)(Debrus等)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)VZV IE63蛋白質(zhì)僅在潛伏感染的人三叉神經(jīng)節(jié)和胸神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元胞質(zhì)中檢測(cè)到。這是第一個(gè)鑒定到的在人神經(jīng)系統(tǒng)中于潛伏狀態(tài)下表達(dá)的α-皰疹病毒蛋白質(zhì)。
此外，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)這種蛋白質(zhì)是免疫系統(tǒng)的重要靶，特別是T細(xì)胞反應(yīng)的靶，從而可用于預(yù)防和治療VZV感染。特別是，預(yù)防已被VZV感染的病人的帶狀皰疹。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供了一種含有水痘-帶狀皰疹病毒IE63蛋白質(zhì)或其免疫學(xué)功能等價(jià)物和藥物可接受載體的藥組合物。
這是這種蛋白質(zhì)的首次醫(yī)學(xué)應(yīng)用并且從而本發(fā)明相應(yīng)地提供VZV IE63蛋白質(zhì)或其免疫學(xué)功能等價(jià)衍生物用于藥物中。
本發(fā)明的另一方面是提供了一種治療易患有或正患有VZV感染的人的方法，包括施用安全和有效量的根據(jù)本發(fā)明的組合物。
每一疫苗劑量中的蛋白質(zhì)量是以能夠在典型疫苗中誘導(dǎo)免疫保護(hù)反應(yīng)而沒有顯著的有害副反應(yīng)的量來(lái)選擇的。這一量將隨使用的特定免疫原以及它怎樣呈遞而變化。通常，預(yù)計(jì)每劑包含1-1000微克蛋白質(zhì)，優(yōu)選地2-100微克，最優(yōu)選地4-40微克。通過(guò)包括觀察受試者中適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答的標(biāo)準(zhǔn)研究可確定特定疫苗的最佳量。在初次接種后，可使對(duì)象以充分間隔接受一次或多次加強(qiáng)劑量免疫。
除了向易患有VZV感染的人接種外，還可使用本發(fā)明的藥物組合物，免疫治療感染VZV的病人，以預(yù)防或顯著降低復(fù)發(fā)疾病，帶狀皰疹病的頻率，嚴(yán)重程度或持久性等。
在本發(fā)明的疫苗中，可直接使用VZV IE63蛋白質(zhì)的水溶液。或者，可將經(jīng)過(guò)或未經(jīng)凍干的VZV IE63蛋白質(zhì)與任何各種已知的佐劑相混合。這類佐劑包括但不限于，氫氧化鋁，胞壁酰二肽和皂角苷諸如Quil A，特別是QS21或3脫酰單磷酰類脂A(3D-MPL)。優(yōu)選地誘導(dǎo)TH1應(yīng)答的佐劑或佐劑系統(tǒng)是優(yōu)選的。能夠優(yōu)先地刺激TH1細(xì)胞應(yīng)答的佐劑描述于國(guó)際專利申請(qǐng)WO94/00153和WO95/17209中。
一種特別優(yōu)選的佐劑包括QS21，一種來(lái)源于皂樹(Quillaja SaponariaMolina)樹皮的高效液相色譜純化的非毒性組分，和3去氧?；瘑瘟柞ｎ愔珹(3D-MPL)，任選地與一種水包油乳劑一起。
3去氧?；瘑瘟柞ｎ愔珹是從GB2220211(Ribi)所知的。化學(xué)性質(zhì)上來(lái)講它是具4,5或6?；湹?去氧?；瘑瘟柞ｎ愔珹混合物并且由Ribi免疫化學(xué)，蒙大那公司(Ribi Immunochem Montana)制造。3去氧?；瘑瘟柞ｎ愔珹的一種優(yōu)選的形式在國(guó)際專利申請(qǐng)No.92/16556中公開。
QS21是從南美的皂樹樹皮(Quillaja Saponaria Molina)中經(jīng)高效液相色譜純化得到的皂角苷非毒性組分并且在美國(guó)專利No.5,057,540中公開了(作為QA21)其生產(chǎn)方法。
一種優(yōu)選的水包油乳劑包括諸如角鯊烯，α-生育酚和吐溫80的一種可代謝油。另外，水包油乳劑可包含Span85和/或卵磷脂。
QS21對(duì)3D-MPL的比率典型地處于1∶10到10∶1的數(shù)量級(jí)；優(yōu)選地1∶5到5∶1并且通常實(shí)際為1∶1。最佳協(xié)同作用的優(yōu)選范圍是2.5∶1到1∶1的3D MPL:QS21。對(duì)人類施藥時(shí)典型地QS21和3D MPL在疫苗中的每劑含量范圍為1微克-100微克，優(yōu)選地10微克-50微克。典型地，水包油含有2％到10％的角鯊烯；2％到10％α-生育酚和0.3％到3％的吐溫80。優(yōu)選的角鯊烯α-生育酚比率是等量或小于1，這樣能使乳劑更穩(wěn)定。也可含有1％的Span85。在有些情況下，本發(fā)明的疫苗進(jìn)一步含有一種穩(wěn)定劑是有益的。
作為進(jìn)一個(gè)示范的替代方案，也可將蛋白質(zhì)包在諸如脂質(zhì)體的微粒中。在另一個(gè)示范的替代方案中，可將VZV IE63蛋白質(zhì)與免疫刺激性分子，諸如殺死的博代桿菌或一種破傷風(fēng)類毒素相綴合。
疫苗制備通常描述于疫苗新趨勢(shì)和發(fā)展(New Trends and Developments inVac cines),Voller等(編者)，University Park Press,Baltimore,Maryland,1978一書中。包埋于脂質(zhì)體中由Fullerton描述于美國(guó)專利4,235,877中。蛋白質(zhì)與大分子的綴合公布于例如Likhite的美國(guó)專利4,372,954和Armor等的美國(guó)專利4,474,757中。Quil A的使用由Dalsgaard等公開于Acta Vet Scand 18:349(1977)中。3D-MPL來(lái)自美國(guó)的Ribi免疫化學(xué)公司(Ribi immunochem)，并公開于英國(guó)專利申請(qǐng)No.2220211和美國(guó)專利4912094中。QS21公開于美國(guó)專利No.5057540中。
本發(fā)明的多核苷酸在遺傳免疫中的應(yīng)用優(yōu)選地使用下列一種合適的傳遞方法，諸如將質(zhì)粒DNA直接注射到肌肉(Wolff等，人類分子遺傳(Hum MolGenet)1992,1:363,Manthorpe等，人類遺傳治療(Hum,Gene Ther.)1963:4,419)，遞送與特定蛋白質(zhì)載體復(fù)合的DNA(Wu等，生物化學(xué)雜志(J.BiolChem)1989:264,1985)，將DNA與磷酸鈣共沉淀(Benvensity和Reshef,美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(PNA),1986:83,9551)，或與其它易化劑facilitator一起將DNA包埋于多種形式的脂質(zhì)體中(Kaneda等，科學(xué)(Science)1989:243,375)，顆粒轟擊(Tang等，自然(Nature)1992,356∶152,Eisenbraun等，DNA細(xì)胞生物學(xué)(DNACell Biol)1993,12:791)以及使用克隆的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Seegar等，PNAS1984:81,5849)或非感染性重組病毒載體諸如Semliki Forest helper2系統(tǒng)(Berglund等生物/技術(shù)學(xué)(Bio/Technology)1993,11∶916-920)進(jìn)行活體感染。合適的肌肉轉(zhuǎn)染促進(jìn)因子(promoter)包括巨細(xì)胞病毒(CMV)，勞斯肉瘤病毒(RSV),Sra，肌動(dòng)蛋白，MCK，α-珠蛋白，腺病毒，二氫葉酸還原酶。遞送依據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的優(yōu)選方法是使用金顆粒通過(guò)US5100792,US5036006，以及4945050的基因槍方法遞送。
可以使用描述于WO90/11092中的給藥劑量和途徑對(duì)本發(fā)明多核苷酸組合物給藥。不過(guò)精確的劑量顯然應(yīng)依賴于諸如體重，性別，給藥方式，病人大致健康狀況和要處理的疾病狀況等因素。盡管如此，對(duì)肌肉內(nèi)給藥，使用的劑量典型地處于0.05微克/公斤到大約50毫克/公斤的范圍，更典型地大約0.1到10毫克/公斤。由于具誘導(dǎo)高水平CTL的能力，皮下，表皮，真皮內(nèi)或粘膜給藥是有益的。
本發(fā)明的疫苗另外還可含有其它抗原性組分，諸如VZV gpⅠ,gpⅡ,gpⅢ,gpⅣ或其截短的衍生物或其它立即早期蛋白質(zhì)諸如IE62蛋白質(zhì)。特別是公開為No.0405867的歐洲專利申請(qǐng)中所述的截短的gpⅠ,gpⅡ或gpⅢ。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，提供的疫苗組合物含有與IE63或IE63衍生物并用的非錨定(anchorless)gpⅠ。
非錨定意味著一種實(shí)質(zhì)上缺乏所有的C末端錨區(qū)域的VZV糖蛋白衍生物并且它使其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)分泌。這種蛋白質(zhì)描述于歐洲專利EP-A-0405867。
在另一實(shí)施方案中提供了含有一種含融合蛋白的疫苗，該融合蛋白含有體現(xiàn)IE63或衍生物的氨基酸序列和體現(xiàn)gpⅠ,gpⅡ,gpⅣ或gpⅤ中的一個(gè)或其衍生物或其它立即早期蛋白諸如IE62的氨基酸序列。
在另一個(gè)實(shí)施例中，可直接使用能表達(dá)IE63或其衍生物的多核苷酸作為核酸疫苗。優(yōu)選地，該多核苷酸是DNA。在這種情況下，多核苷酸將在一種合適的啟動(dòng)子控制下。
也可使用RNA免疫。在此情況下，可依據(jù)WO92/10578中的方法制備RNA。
實(shí)施例1含有VZV IE63蛋白質(zhì)的疫苗制劑
制成了兩種佐劑制劑，每種含有下列水包油乳劑組分。
SB62:5％角鯊烯，5％生育酚，2.0％吐溫80；顆粒大小180nm1(a)制備乳劑SB62(2倍濃度)
將吐溫80溶解于磷酸緩沖鹽溶液(PSB)制成PBS中的2％溶液。為了制成100毫升二倍濃度乳劑，將5克DLα-生育酚和5毫升角鯊烯渦動(dòng)以充分混合。加入90毫升PBS/吐溫溶液并充分混合。然后將產(chǎn)生的乳劑通過(guò)注射器并最后使用Ml10S微流儀(microfluidics machine)微流。產(chǎn)生的油滴大小大致180nm。1(b)依據(jù)Debrus等(Supra)的方法制備抗原。1(c)制備IE63蛋白QS21/3D-MPL水包油制劑。
將等體積二倍濃度抗原(20微克或100微克)加入1a)的乳劑中并混合。將其與50微克/毫升3D-MPL和20微克/毫升QS21混合形成最終制劑。緩沖液與鹽含量和pH相應(yīng)實(shí)施例2IE P63的免疫學(xué)特征2.1材料
從有一人已被免疫接種的十一位健康供血者中抽取血液。所有這些供血者都是成年人，并在童年患過(guò)水痘。在每一例中，將30毫升血液采集到肝素化試管中以及將5毫升放置凝血以獲取血清。2.2體液免疫應(yīng)答
進(jìn)行了使用全VZV和對(duì)照抗原來(lái)檢測(cè)血液樣品中抗-VZV IgG的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試驗(yàn)所有檢測(cè)的供血者(除一人外)都有可檢測(cè)水平的抗VZV抗體，從而提供了童年時(shí)患過(guò)水痘的血清學(xué)證明。
使用克隆到pGEX5X中并在大腸桿菌(E.coli)中以融合蛋白(GST-IE63)表達(dá)以及通過(guò)親和層析(Deburs等，病毒學(xué)期刊)(J.Viol),69,3240-3245)純化的IE63通過(guò)Western印跡檢測(cè)研究抗-IE63抗體的存在。使用以相同方式表達(dá)和純化的GST蛋白質(zhì)作為陰性對(duì)照。在所有檢測(cè)的血液樣品中，純化的IE63融合蛋白得以識(shí)別表明了血清中存在抗-IE63抗體。對(duì)照蛋白質(zhì)從未被該抗體識(shí)別。2.3細(xì)胞免疫應(yīng)答
通過(guò)刺激由菲可帕克(ficollhypaque)離心分離的PBMC(外周血單核細(xì)胞)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞刺激。
通過(guò)用植物血細(xì)胞凝集素(PHA)刺激3×105 PBMC一式三份進(jìn)行全部試驗(yàn)測(cè)定非特異刺激指數(shù)，全VZV和對(duì)照抗原(通過(guò)超聲處理感染或未感染黑素瘤細(xì)胞制備)及純化的融合蛋白(GST-IE63或單獨(dú)的GST)。在第6天，用3H-胸苷脈沖標(biāo)記細(xì)胞16小時(shí)，然后收獲細(xì)胞。刺激指數(shù)(SI)以蛋白質(zhì)刺激孔中的每分鐘計(jì)數(shù)(CPM)與對(duì)照孔的比率計(jì)算，并且在＞2時(shí)認(rèn)為是陽(yáng)性。2.4T細(xì)胞增生結(jié)果
使用先前確定的參數(shù)，迄今已進(jìn)行了10次增生檢測(cè)。
結(jié)果列于表1。
用全VZ抗原或IE63刺激后獲得的刺激指數(shù)描繪于

圖1所示的曲線圖中。
從這些數(shù)據(jù)，我們可推斷
大多數(shù)人(6/10)具有對(duì)VZV IE63的記憶T細(xì)胞應(yīng)答。
兩名供體用全抗原和純化的融合蛋白時(shí)均具有很低的刺激指數(shù)(SI)，可認(rèn)為是陰性的(SI＜2)。但是，其中一人具有很低的抗體滴度，沒有任何具水痘病史的明確證據(jù)，因此可能是一名陰性供血者。另一名具有很高抗體滴度的人在用MBP-IE63進(jìn)行檢測(cè)時(shí)具有較好的SI(SI=3.4)，表明在某些情況下一種融合蛋白更好地被T細(xì)胞識(shí)別因此在SI非常低且有高的標(biāo)準(zhǔn)偏差時(shí)兩種蛋白質(zhì)的比較是有益的。
另兩位供血者對(duì)IE63顯示陰性應(yīng)答而其SI對(duì)全抗原則較高，但是只用GST融合蛋白進(jìn)行了刺激。實(shí)施例3細(xì)胞反應(yīng)
在上述實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)展中，檢測(cè)了來(lái)自19位健康成年人的PBMC對(duì)VZV抗原或GST-IE63純化蛋白刺激的T細(xì)胞增生反應(yīng)。對(duì)VZ抗原的平均S.I.是15.5±3.3標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)，其值在2.1和52之間。用GST-IE63刺激后的平均S.I.是3.4±0.48SE，其值在1.8和8之間。這些S.I.數(shù)據(jù)顯著高于在非免疫病人中觀察到的數(shù)據(jù)，其S.I.對(duì)VZV抗原為1.95±0.48SE，對(duì)IE63為1.3±0.1SE。當(dāng)繪出VZV刺激后的S.I.并與使用GST-IE63的S.I.相對(duì)比，兩位非免疫病人對(duì)兩種抗原制劑清楚地顯示陰性(S.I.＜2.0)(圖2)。所有17位免疫供血者對(duì)VZV抗原具有高于2.0的S.I.。在這些陽(yáng)性供血者中，其中的3人(17％)，一人有多次帶狀皰疹發(fā)疹歷史，對(duì)VZV抗原顯示非常強(qiáng)烈的反應(yīng)，而對(duì)GST-IE63的S.I.低于2.0。四位對(duì)GST-IE63的S.I.為2.0的供血者對(duì)VZ抗原的S.I.在5.4到11的范圍。但是，所有對(duì)GST-IE63的S.I.≤2的供血者對(duì)單獨(dú)GST有非常重要的反應(yīng)(未發(fā)表資料)，這使得結(jié)果難以解釋。所有其它天然免疫個(gè)體(59％)對(duì)GST-IE63顯示強(qiáng)烈反應(yīng)，其S.I.在2.3到8之間。但是，未發(fā)現(xiàn)用VZ抗原和用融合蛋白刺激之間有何相關(guān)性。實(shí)施例4細(xì)胞因子檢測(cè)
評(píng)價(jià)了7個(gè)受試者的用IE63刺激的PBMC的細(xì)胞因子產(chǎn)生用GST或GST-IE63刺激PBM C并在第2,4或6天用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)測(cè)定白介素2(IL.2)，白介素4(IL4)和g-FN。結(jié)果以GST-IE63或單獨(dú)的GST刺激后檢測(cè)到的細(xì)胞因子濃度間的差別表示。IE63刺激后的T-細(xì)胞未檢測(cè)到IL2和IL4但產(chǎn)生了顯著量(175到1400皮克/毫升)的γ-干擾素(r-IFN)，第四天產(chǎn)量達(dá)到最高。未觀察到刺激的培養(yǎng)物中檢測(cè)到的γ-干擾素的量非常低。實(shí)施例5細(xì)胞毒性檢測(cè)
在有限稀釋分析從10名VZV-免疫供體中獲得的T細(xì)胞中測(cè)定了IE62和IE63-特異性CTL反應(yīng)。使用未感染的或由牛痘對(duì)照，牛痘-IE62或牛痘-IE63感染的自體靶進(jìn)行了這些檢測(cè)。在供體中對(duì)照靶產(chǎn)生的背景變動(dòng)很大，但只有在病毒特異性靶裂解至少比對(duì)照靶(未感染的或用牛痘-對(duì)照感染的)裂解強(qiáng)10％時(shí)結(jié)果才被認(rèn)為有效。
如一次檢測(cè)中證明(圖3)，當(dāng)使用T-Lymphokwik回收的T細(xì)胞種群時(shí)，表達(dá)VZV蛋白的靶的裂解顯著高于在未感染或?qū)φ瞻兄杏^察到的裂解。表達(dá)IE62的靶中觀察到的裂解與表達(dá)IE63的靶中的裂解沒有顯著差別。用全T細(xì)胞種群進(jìn)行的4次檢測(cè)得到了相似的結(jié)果對(duì)IE62觀察到25-48％特異性裂解，和對(duì)IE63的27-43％。識(shí)別IE62或IE63的T細(xì)胞平均前體頻率分別是44500±22500SE和31000±16000SE，但是此差別在統(tǒng)計(jì)上是不顯著的(P=0.8)。
使用純化的CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞種群作為效應(yīng)物制備了有限稀釋培養(yǎng)基。兩種群均裂解IE62和IE63靶。識(shí)別IE62或IE63的CD8+細(xì)胞的RCF分別是28500±10100SE和30500±13700SE，這在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是無(wú)差別的(P=0.9)，表明CD8+細(xì)胞對(duì)兩種病毒蛋白質(zhì)以相同的效率識(shí)別(圖4)。在兩種群效應(yīng)物細(xì)胞中裂解IE63鞘的細(xì)胞數(shù)也是相同的平均CD4+效應(yīng)物細(xì)胞是31450±7500SE，與CD8+細(xì)胞的頻率相同(P=0.97)。但是，計(jì)算機(jī)分析中舍棄了用于IE62識(shí)別的CD4+細(xì)胞頻率的計(jì)算。實(shí)施例6潛伏狀態(tài)下VZV IE63的表達(dá)
為了檢測(cè)潛伏感染的神經(jīng)節(jié)中VZV的表達(dá)，從死亡24小時(shí)以內(nèi)的9名成人和3名嬰兒中獲取了一個(gè)三叉神經(jīng)節(jié)和多個(gè)胸神經(jīng)節(jié)。在死亡之前所有受試者都不是免疫損傷的，并且通過(guò)尸檢，沒有新近皰疹病毒感染的皮膚征兆。酶免疫測(cè)定揭示所有成人血清中有抗VZV抗體。只從3名嬰兒中一名中獲得的血清中不含抗VZV抗體。使用VZV特異性引物的液相PCR擴(kuò)增(Mahalinaham R等，英國(guó)醫(yī)學(xué)雜志(Eng.J.Med)323,627-631)揭示在從一小部分每種神經(jīng)節(jié)中提取的DNA中在所有成人神經(jīng)節(jié)中有VZV DNA，而在嬰兒神經(jīng)節(jié)中均不含VZV DNA。對(duì)每一神經(jīng)節(jié)的剩余部分使用在兔中培養(yǎng)的抗如(Debrus等supra)所述在大腸桿菌中以谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白表達(dá)并純化的30.5-千道爾頓-VZV IE63蛋白的抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。VZV感染的和未感染的BSC-1(非洲猴腎)細(xì)胞分別用作陽(yáng)性和陰性對(duì)照。
在VZV感染的BSC-1細(xì)胞中觀察到兩個(gè)含有VZV IE63蛋白質(zhì)的典型VZV細(xì)胞病理學(xué)病灶。在未感染的細(xì)胞或單純皰疹病毒(HSV)感染的BSC-1細(xì)胞中未測(cè)到信號(hào)。在死于動(dòng)脈粥樣硬化的46歲男人死亡后17小時(shí)獲取的神經(jīng)節(jié)中，特征性的紅色揭示3個(gè)神經(jīng)元胞質(zhì)中僅有VZV IE63蛋白質(zhì)。當(dāng)將正常兔血清用于同一神經(jīng)節(jié)相鄰部分時(shí)未檢測(cè)到信號(hào)。同一對(duì)象不同胸神經(jīng)節(jié)相鄰部分神經(jīng)元胞質(zhì)中檢測(cè)到深紅染色。在潛伏感染神經(jīng)節(jié)的多個(gè)神經(jīng)元中?？吹綔\紅色，暗示著更彌漫的，或許低豐度的感染。在衛(wèi)星(被膜)細(xì)胞，毛細(xì)管，結(jié)締組織，神經(jīng)節(jié)中的神經(jīng)束，或進(jìn)入神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)無(wú)根(rootless)中從未發(fā)現(xiàn)紅色VZV IE63蛋白特異性染色。當(dāng)將抗VZV IE63蛋白質(zhì)的抗血清用于死于膿毒癥并發(fā)先天臍突出和肺發(fā)育不全的2個(gè)月嬰兒的神經(jīng)節(jié)時(shí)未檢測(cè)到信號(hào)?？偟膩?lái)說(shuō)，從2位成人的5個(gè)神經(jīng)節(jié)(4個(gè)胸神經(jīng)節(jié)和1個(gè)三叉神經(jīng)節(jié))中發(fā)現(xiàn)了VZV IE63蛋白質(zhì)。在這些成人之一中，從5個(gè)胸神經(jīng)節(jié)中的4個(gè)中的所有10個(gè)切片中都檢測(cè)到VZV IE63蛋白質(zhì)。在第二位成人中，從自三叉神經(jīng)節(jié)的所有4切片中都檢測(cè)到VZV IE63蛋白質(zhì)。在陽(yáng)性切片中，在2-4神經(jīng)元胞質(zhì)中檢測(cè)到VZV IE63蛋白質(zhì)。在每一個(gè)從來(lái)自7位其它成人中的16個(gè)神經(jīng)節(jié)中制備的4切片中的任一個(gè)中，或在每一個(gè)從3個(gè)嬰兒中得到的9個(gè)神經(jīng)節(jié)中制備的4切片中的任一個(gè)中未檢測(cè)到VZV IE蛋白質(zhì)。
在幾乎所有神經(jīng)節(jié)中檢測(cè)到VZV DNA但只在某些潛伏感染神經(jīng)節(jié)中檢測(cè)到VZV IE63可能反映了抽樣，即檢測(cè)每一含VZV IE63蛋白質(zhì)的VZVDNA的神經(jīng)節(jié)的每一切片可能揭示附加的陽(yáng)性神經(jīng)節(jié)。換句話說(shuō)，在不同神經(jīng)節(jié)中病毒表達(dá)可能不同，例如，在HSV潛伏感染的神經(jīng)節(jié)中，含HSV DNA的神經(jīng)元數(shù)量遠(yuǎn)大于揭示出的潛伏狀態(tài)相聯(lián)系的轉(zhuǎn)錄的。
最后，可能出現(xiàn)病毒重激活，雖然由于死前沒有帶狀皰疹樣疹的臨床證據(jù)，沒有疹前長(zhǎng)時(shí)間神經(jīng)痛(皰疹前神經(jīng)痛)的病史，沒有不出疹(Zoster sineherpete)的皮膚瘤(deermatomal)散布痛病史，以及沒有暗示低級(jí)神經(jīng)節(jié)炎的出疹后神經(jīng)痛病史，看起來(lái)在神經(jīng)節(jié)含VZV IE63蛋白質(zhì)的受試者中不太可能發(fā)生。此外，神經(jīng)節(jié)的組織學(xué)檢查揭示無(wú)噬神經(jīng)細(xì)胞作用，包涵體或炎癥反應(yīng)。結(jié)論
從這些實(shí)驗(yàn)中，我們可推斷VZV IE63引發(fā)了一個(gè)完整的免疫應(yīng)答
·可通過(guò)western印跡測(cè)定在多數(shù)具水痘病史的供體血清中檢測(cè)到抗IE
63抗體；
·用IE63(純化為GST-融合蛋白)體外刺激后能使T細(xì)胞增生，但有
限量的測(cè)試供體未能使我們發(fā)現(xiàn)用VZV的刺激指數(shù)(S.I.)與用IE63
的直接的相關(guān)性。如上清液中大量γ-干擾素的表達(dá)所示，反應(yīng)于IE
63刺激發(fā)生的T細(xì)胞增生多為TH1；
·顯示了在IE63識(shí)別中的T細(xì)胞細(xì)胞毒性活性。如通過(guò)使用純化的效
應(yīng)物細(xì)胞所確定的，CD4+以及CD8+細(xì)胞參與裂解過(guò)程。識(shí)別
IE63的前體細(xì)胞數(shù)量近似于對(duì)IE62有響應(yīng)的細(xì)胞數(shù)量。
這是鑒定在于潛伏狀態(tài)下人神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)的皰疹病毒蛋白及其免疫學(xué)特性的第一篇報(bào)道，它是一種待包含于抗水痘帶狀皰疹的疫苗中的優(yōu)異的抗原。
表1T細(xì)胞增生表1對(duì)VZV的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。在用全抗原(超聲處理的感染的或模擬感染的稀釋4,16或64倍的黑素瘤細(xì)胞)或用IE63融合蛋白(GST或GST-IE63)刺激后測(cè)出刺激指數(shù)。對(duì)全抗原用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(以O(shè).D.＞0.250的稀釋度表達(dá))或?qū)E63用Western印跡檢測(cè)評(píng)價(jià)體液免疫狀態(tài)。
權(quán)利要求
1．一種包含水痘-帶狀皰疹病毒IE63蛋白或免疫學(xué)功能衍生物以及一種藥物可接受賦形劑的藥物組合物。
2．一種包含編碼IE63的核酸或其免疫學(xué)功能衍生物的藥物組合物。
3．用于藥物的IE63基因蛋白或其免疫學(xué)功能衍生物。
4．使用IE63蛋白或其免疫學(xué)活性衍生物制備能預(yù)防或改善水痘或帶狀皰疹的藥物。
5．根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，另外包含其它的VZV抗原。
6．根據(jù)權(quán)利要求5的藥物組合物，其中的第二種水痘-帶狀皰疹蛋白選自gpⅠ,gpⅡ,gpⅢ,gpⅣ,gpⅤ或IE62或其免疫學(xué)功能衍生物。
7．根據(jù)權(quán)利要求1,2,5或6的藥物組合物，另外包含一種佐劑。
8．根據(jù)權(quán)利要求7的藥物組合物，其中的佐劑優(yōu)選地誘導(dǎo)TH1反應(yīng)。
9．根據(jù)權(quán)利要求9的藥物組合物，其中的抗原與QS21和3D-MPL一起以水包油乳劑方式存在。
10．一種治療患有或易患有水痘-帶狀皰疹病毒感染的病人的方法，包括向病人施用安全有效量的如權(quán)利要求1,2,5,6,7,8或9中的任一個(gè)中所述的藥物組合物。
11．生產(chǎn)包含水痘-帶狀皰疹病毒IE63蛋白，核酸或其免疫學(xué)功能衍生物的藥物組合物的方法，包括將上述蛋白，核酸或衍生物與藥物可接受賦形劑混合。
12．根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中的賦形劑含有一種佐劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于治療和預(yù)防感染了水痘－帶狀皰疹病毒(VZV)的個(gè)體的帶狀皰疹的組合物,并涉及水痘感染的預(yù)防和治療。發(fā)明組合物含有由VZV基因63編碼的蛋白或其免疫學(xué)活性衍生物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有與VZV基因63相對(duì)應(yīng)的DNA或RNA的組合物。
文檔編號(hào)A61K39/245GK1210470SQ97192099
公開日1999年3月10日 申請(qǐng)日期1997年2月4日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月9日
發(fā)明者伯納德·倫蒂爾, 凱瑟琳·薩德佐特 申請(qǐng)人:史密斯克萊·比奇曼生物公司, 烈日大學(xué)